CN103127158B

CN103127158B - 一种青钱柳提取物及其应用

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Publication number: CN103127158B
Application number: CN201310018301.2A
Authority: CN
Inventors: 黄晓航; 王庆华; 边际
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2033-01-17
Also published as: CN103127158A

Abstract

本发明涉及一种青钱柳提取物及其应用。一种青钱柳提取物，至少含有如下有效成分：10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇；硝酸壬酯；异-丁氧胺；十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯；己二酸，2-(2乙基己基)酯；2-丁基，1-辛醇；十八烷基乙烯醚和赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯；上述有效成分占青钱柳提取物干重的重量百分比为50%～98%。本发明所述的青钱柳提取物能显著促进胰岛贝塔细胞胰岛素的分泌，以增强小鼠的血糖耐受来调节血糖，可用于制备预防和治疗糖尿病的药物，为进一步开发利用青钱柳的药用价值指出了方向。

Description

一种青钱柳提取物及其应用

技术领域

本发明涉及一种青钱柳提取物及其应用，特别是一种从青钱柳中提取的含有非极性化合物的提取物及其在治疗糖尿病中的应用，属于药物制备技术领域。

背景技术

糖尿病是因胰岛素分泌或利用不足而引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱的综合征。近年来糖尿病的发病率逐年上升，是造成人类死亡的主要病因之一，严重危害人类健康。目前糖尿病前期患者以及糖尿病患者的人数正逐年快速增长。据世界卫生组织估计，目前全球患者就超过2亿人（http://www.who.int/diabetes），保守估计到2025年全球糖尿病人数将超过3亿人。仅以北美为例，糖尿病患者可占正常人群的10%。而患前期糖尿病(Prediabetic)的人数已占正常人群的20%。在中国，据初步统计，糖尿病患者发病率已占正常人的5%，并呈逐年增长趋势。根据世界卫生组织(WHO)预测，仅以3%发病率的保守估测，中国患病的人数已达到4，000万人以上(只计人口增长非相关部分)。从药品开发角度来看，这是一个不断扩大的，有恒定需求的巨大的市场。

I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的两种主要形式。I型糖尿病主要在青少年患者发病，是一种依赖T细胞的复杂的自家免疫性疾病。患者由于自身免疫系统破坏了胰岛B-细胞，导致了胰岛素分泌的不足因而不得不长期依赖外源性的胰岛素。II型糖尿病常发生于成年人，患者占糖尿病患者总人数的90％，由于肌体胰岛素分泌不足或产生胰岛素抵抗，不能有效降低患者的血糖，因而出现高血糖症。当外周组织细胞胰岛素敏感性降低时，即产生外周胰岛素抵抗，损害了这些组织葡萄糖的利用，不能有效地促使葡萄糖的转化导致机体发生高血糖症。

目前在临床上用于治疗糖尿病的药物主要包括胰岛素,促胰岛素分泌药和胰岛素敏感剂。这类药品在国际上已沿用多年，成为临床上的一线药物。

胰岛素：胰岛素是当今世界上治疗糖尿病的首选药物。高剂量胰岛素迫使外周组织(如脂肪和肌肉)摄取糖以达到降低血糖的目的。其优点是降糖作用快而明显；其缺点是机体不可避免会产生胰岛素依赖，低血糖休克等副作用，以及最终由于胰岛素依赖而导致的胰腺萎缩及胰岛功能的完全丧失。我国目前临床上应用的主要是动物来源提取的动物胰岛素（主要是猪胰岛素）和基因工程生产的人胰岛素。前者若长期使用，有可能引起严重的免疫反应，危及病人生命。后者因其价格昂贵，长期持续使用将给病人造成严重的经济负担。

胰岛素分泌药：磺基脲(sulphonylurea)和其类似物的小分子化合物药物是临床上使用了几十年的经典药物。其作用机理是通过激活胰岛B-细胞表面的受体引起与其偶联的B-细胞ATP敏感型钾离子通道开放，致钙离子内流使储存的胰岛素分泌。

胰岛素敏感剂。胰岛素敏感剂以改善外周胰岛素抵抗为出发点，同其他目前使用的治疗糖尿病药一样，胰岛素敏感剂能改善血糖浓度，新型的胰岛素敏感剂比传统的(如自50年代便开始使用的metformin)有着更明显的降糖效果。

传统的中药在治疗糖尿病方面有着悠久的历史。已证明多种中药，如黄芪、丹参、黄岑、桑叶、葛根、黄连等单独或配伍使用，对糖尿病有一定的治疗效果。中药通过把益气养阴与活血化瘀药组合在一起，能使糖尿病患者症状得到有效缓解与改善，因而中药有着化学合成药物不可替代的优势。但迄今为止，许多中药的作用机制仍然不十分清楚，其有效成分也未能得到确认。有鉴于此，在搞清中药有效成分，探明其作用机制的基础上，研制有效的治疗糖尿病的中药，对于发掘中药宝库，造福于糖尿病患者有着非常重要的意义。

青钱柳(Cyclocarya paliurus)系多年生胡桃木科(Juglandaceae)植物，在我国南方，包括江西、四川、福建等省都有分布。该树树形像柳树，果实如古铜钱。据《中国中药志要》记载，其树皮、树叶具有清热消肿和止痛功能。青钱柳因含有大量生物活性物质而具有独特的保健和药用价值。以青钱柳叶为主的青钱柳茶或冲泡液甘甜滋润，能生津止渴，被认为具有清热解暑、降压强心、延年益寿的作用，可有效地用于防治糖尿病、高血压、冠心病和神经衰弱等疾病。

研究发现，青钱柳含有多种无机和有机成分。其含有的无机元素包括以可溶态存在的微量元素锰、铁、铜、铬、锌、硒、钒、锗等，这些元素对人体的保健有重要的作用。其中元素镍，铬，钒与糖代谢和胰岛素作用密切相关，在青钱柳叶中的含量大约为茶叶的10倍。这些成分对青钱柳冲泡液的降血糖、降血压和降血脂等功能可能起到了重要作用。青钱柳的有机成分很多，主要成分为黄酮类、三萜类、皂苷类和有机酸类化合物，此外还有一些小分子化合物。目前已经分离出来的化合物已有几十种，以黄酮类和皂苷类化合物居多，如槲皮素．山奈酚、青钱柳苷和青钱柳酸等，有些化合物是在青钱柳中发现的新化合物。

先前实验证明青钱柳粗提液具有的生物活性物质具备多种药理学功能，有明显的降血糖作用。但是其有效成分至今不甚清楚。易醒掣给胰岛B细胞破坏的小鼠糖尿病模型以青钱柳提取物后，进行了小鼠糖耐受量实验。研究发现青钱柳70％乙醇提取物和青钱柳多糖复合物具有显著降血糖和增加糖耐受量的作用。李磊等证明，青钱柳中含有显著降血糖的多糖类活性物质，实验结果证明青钱柳多糖能增强糖尿病小鼠对葡萄糖的耐受力。上官新晨将青钱柳醇提取物和水提物用于治疗糖尿病家兔，效果也很显著。谌梦奇等以青钱柳叶为主药配方，经煎熬浓缩，酒精提纯，佐以党参、黄芪、淮山、菊花、枸杞等制成保健甜茶对120例II型糖尿病患者进行治疗。结果显示青钱柳制剂确有降血糖作用，且无毒副作用。当与降糖药物协同作用时，对消除糖尿病症状，防治并发症有较好的效果。这些研究为青钱柳叶在民间制茶饮用以防治糖尿病提供了有效地实验证据，但其科学解释有待进一步研究。

中国专利文献CN101254200A（申请号200710037699.9）公开了一类青钱柳苷化合物或其药学上可接受的盐，或者含该类化合物的植物提取物的用途，它可被用于制备治疗或预防糖尿病的组合物。该青钱柳苷化合物主要为由青钱柳中提取的一类极性较强的糖苷类物质。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种青钱柳提取物及其应用，该提取物有促进胰岛贝塔细胞分泌胰岛素和增加小鼠的血糖耐受来调节血糖的作用，因此可以用于制备预防和治疗糖尿病的药物。

一种青钱柳提取物，其特征在于，至少含有如下有效成分：

10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇；硝酸壬酯；异-丁氧胺；十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯；己二酸，2-(2乙基己基)酯；2-丁基，1-辛醇；十八烷基乙烯醚和赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯；上述有效成分占青钱柳提取物干重的重量百分比为50%～98%。

上述10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇（10-Methoxy-nb-α-methyl corynantheol）的化学结构式如下：

上述硝酸壬酯（n-Nonyl nitrate）的化学结构式如下：

上述异-丁氧胺（Iso-butoxyamine）的化学结构式如下：

上述十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯（pentadecanoic acid，4,6,10,14tetramethyl-methyl-ester）的化学结构式如下：

上述己二酸，2-(2乙基己基)酯（bis-(2ethylhexyl)ester）的化学结构式如下：

上述2-丁基，1-辛醇（2-butyl，1-Octanol）的化学结构式如下：

上述十八烷基乙烯醚（Octadecyl vinyl ether）的化学结构式如下：

上述赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯（Erythro cis-4,5-dimethyl-2-undecene）的化学结构式如下：

根据本发明优选的，所述青钱柳提取物，还含有青钱柳苷。

上述青钱柳苷（cyclocoriosideI）的化学结构式如下：

上述青钱柳提取物的制备方法，包括如下步骤：

（1）取青钱柳叶，经粉碎后，用质量百分比为70%～85%的乙醇室温下提取，提取物用氯仿、正己烷或乙酸乙酯萃取，制得萃取液；

（2）将步骤（1）制得的萃取液在硅胶柱上用氯仿甲醇混合溶液浓度梯度进行洗脱，氯仿甲醇混合溶液浓度梯度为氯仿：甲醇的体积比是80:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1，洗脱后得到30级分；收集第12-15级分洗脱液，制得初提物；

（3）将步骤（2）制得的初提物经纸色谱层析分离纯化，纸色谱流动相为氯仿、甲醇、乙酸和水的混合溶液，各组分的体积比为氯仿：甲醇：乙酸:水是400:20:2.5:0.5，经洗脱后，收集洗脱后的组合物；

（4）将步骤（3）收集洗脱后的组合物用氯仿：甲醇体积比为50:1的混合液洗脱分离，收集洗脱液，制得青钱柳提取物。

经质谱分析确定其化学结构为一类非极性化合物，其主要成分为：10-甲氧基nb-α-甲基柯楠醇；硝酸壬酯；异-丁氧胺；十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯；己二酸，2-(2乙基己基)酯；2-丁基，1-辛醇；十八烷基乙烯醚和赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中青钱柳叶含水率为10～15wt%，更优的，青钱柳叶含水率为10wt%。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的提取时间为1.5～2.5小时。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的萃取温度为室温，萃取时间为3～10分钟，提取物与氯仿、正己烷或乙酸乙酯混合的体积比为1:（0.5～2）；更优的，提取物与氯仿、正己烷或乙酸乙酯混合的体积比为1:1。

根据本发明优选的，所述步骤（2）浓度梯度洗脱的每级洗脱时间为70～180min；更优的，浓度梯度洗脱的每级洗脱时间为90min。

根据本发明优选的，所述步骤（2）还包括收集第21-27级分洗脱液。

经质谱分析确定第21-27级分为极性较强的化合物，其主要成分为青钱柳苷。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的洗脱时间为100～150min，更优的，洗脱时间为120min。

上述青钱柳提取物在制备防治糖尿病药物中的应用。

有益效果

本发明所述的青钱柳提取物，尤其是提取物中非极性部分的化合物，能显著促进胰岛贝塔细胞胰岛素的分泌，增强小鼠的血糖耐受来调节血糖，可用于制备预防和治疗糖尿病的药物，为进一步开发利用青钱柳的药用价值指出了方向。

附图说明

图1是制得的青钱柳提取物中10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇的MS谱图；

图2是制得的硝酸壬酯的MS谱图；

图3是制得的异-丁氧胺的MS谱图；

图4是制得的十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯的MS谱图；

图5是制得的己二酸，2-(2乙基己基)酯的MS谱图；

图6是制得的2-丁基，1-辛醇的MS谱图；

图7是制得的十八烷基乙烯醚的MS谱图；

图8是制得的赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯的MS谱图；

图9是青钱柳提取物对胰岛贝塔细胞分泌胰岛素的刺激效果图；

图10是在不同级分的青钱柳提取物的刺激下胰岛贝塔细胞分泌胰岛素的实验结果图；

图11是按照实施例制备的青钱柳提取物刺激胰岛贝塔细胞分泌胰岛素的效果图；

图12是不同浓度下青钱柳提取物刺激胰岛贝塔细胞分泌胰岛素的量效关系实验结果图；

图13是青钱柳提取物增进CD1小鼠血糖耐受实验的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护的范围不限于此。

实验设备说明

实施例中所述硅胶层析柱的硅胶购自青岛海洋化工厂；

实施例中色谱分离采用纸层析分离技术，流动相采用氯仿:甲醇:乙酸：水(400:25:2.5:0.5)。

实施例中质谱鉴定采用飞行时间质谱仪，为美国安捷伦公司1100LC/TOF型。

原材料来源

实验所用CD1小鼠购自美国缅因州Jackson Laboratories公司。

小鼠在恒温，每天12小时光照，自由饮水饮食条件下饲养。实验组小鼠腹腔注射用PBS缓冲液稀释100倍的青钱柳提取物，对照组以注射PBS作为对照。小鼠禁食过夜约15h，腹腔注射1.5g葡萄糖/kg BW。尾静脉取血，注射后在不同时间点检测血糖。

胰岛素分泌细胞系INS-1细胞购自美国ATCC公司原代细胞库。

FBS血清的购自加拿大GIBCO公司。

RPMI 1640细胞培养液购自加拿大GIBCO公司。

KRB缓冲液配方为4.8mM KCl，129mM NaCl，5mM Na₂CO₃，1.3mM KH₂PO₄，1mM CaCl₂，1.2mMMgSO₄，0.5mM glucose，10mM HEPES，pH7.4。

实施例1

青钱柳提取物的制备方法，包括如下步骤：

（1）取青钱柳叶，经粉碎后，用质量体积比85%的乙醇在室温下提取2h，提取物按体积比1:1的比例用氯仿室温下萃取5min，重复萃取2次，合并有机相，制得萃取液；

（2）将步骤（1）制得的萃取液在硅胶柱上用氯仿甲醇混合溶液浓度梯度进行洗脱，氯仿甲醇混合溶液浓度梯度为氯仿：甲醇的体积比是80:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1，每级洗脱时间为90min，洗脱后得到30级分；收集第12-15级分洗脱液，制得初提物；

（3）将步骤（2）制得的初提物经色谱层析分离纯化，色谱层析洗脱液为氯仿、甲醇、乙酸和水的混合溶液，各组分的体积比为氯仿：甲醇：乙酸:水是400:20:2.5:0.5，洗脱时间为120min，收集洗脱后的组合物；

经质谱分析确定其化学结构为一类非极性化合物，其有效成分为10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇；硝酸壬酯；异-丁氧胺；十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯；己二酸，2-(2乙基己基)酯；2-丁基，1-辛醇；十八烷基乙烯醚和赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯。

上述有效成分占青钱柳提取物干重的重量百分比为90%。各组分的MS谱图结果如图1～8所示。

实施例2

如实施例1所述的制备方法，不同之处在于，步骤（2）中除收集第12-15级分洗脱液外，同时收集第21-27级分洗脱液，并同时进行实施例1所述的步骤（3）和步骤（4）的过程，制得第12-15级分青钱柳提取物和第21-27级分青钱柳提取物。最后将第12-15级分青钱柳提取物和第21-27级分青钱柳提取物混合制得青钱柳提取物。

经质谱分析确定第21-27级分青钱柳提取物中的化学结构为一类极性较强的化合物，其主要成分为青钱柳苷。

实施例3

青钱柳提取物的制备方法，包括如下步骤：

（1）取青钱柳叶，经粉碎后，用质量体积比70%的乙醇在室温下提取1.5h，提取物按体积比1:1的比例用正己烷室温下萃取5min，制得萃取液；

（2）将步骤（1）制得的萃取液在硅胶柱上用氯仿甲醇混合溶液浓度梯度进行洗脱，氯仿甲醇混合溶液浓度梯度为氯仿：甲醇的体积比是80:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1，每级洗脱时间为70min，洗脱后得到30级分；收集第12-15级分洗脱液，制得初提物；

（3）将步骤（2）制得的初提物经色谱层析分离纯化，色谱层析洗脱液为氯仿、甲醇、乙酸和水的混合溶液，各组分的体积比为氯仿：甲醇：乙酸:水是400:20:2.5:0.5，洗脱时间为100min，收集洗脱后的组合物；

经质谱分析确定其化学结构为一类非极性化合物，其有效成分为10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇；硝酸壬酯；异-丁氧胺；十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯；己二酸，2-(2乙基己基)酯；2-丁基，1-辛醇；十八烷基乙烯醚和赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯。上述有效成分占青钱柳提取物干重的重量百分比为50%。

实施例4

青钱柳提取物的制备方法，包括如下步骤：

（1）取青钱柳叶，经粉碎后，用质量体积比80%的乙醇在室温下提取2.5h，提取物按体积比1:1的比例用乙酸乙酯室温下萃取5min，制得萃取液；

（2）将步骤（1）制得的萃取液在硅胶柱上用氯仿甲醇混合溶液浓度梯度进行洗脱，氯仿甲醇混合溶液浓度梯度为氯仿：甲醇的体积比是80:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，1:1，0:1，每级洗脱时间为120min，洗脱后得到30级分；收集第12-15级分洗脱液，制得初提物；

（3）将步骤（2）制得的初提物经色谱层析分离纯化，色谱层析洗脱液为氯仿、甲醇、乙酸和水的混合溶液，各组分的体积比为氯仿：甲醇：乙酸:水是400:20:2.5:0.5，洗脱时间为150min，收集洗脱后的组合物；

经质谱分析确定其化学结构为一类非极性化合物，其有效成分为10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇；硝酸壬酯；异-丁氧胺；十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯；己二酸，2-(2乙基己基)酯；2-丁基，1-辛醇；十八烷基乙烯醚和赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯。上述有效成分占青钱柳提取物干重的重量百分比为80%。

对比例

对比例的样品为实施例2制备的第21-27级分青钱柳提取物。

试验例1

从青钱柳中提取的组合物用于刺激胰岛贝塔细胞分泌胰岛素

将胰岛素分泌细胞系INS-1细胞以每孔2.5×10⁵的密度在24孔细胞培养板培养，使用含10％（体积百分比）FBS血清的RPMI 1640细胞培养液。将培养板置于二氧化碳培养箱中。次日，以无葡萄糖的新鲜KRB缓冲液培养2次每次30min。然后对照组细胞分别接受加有2.8和16.7mM的葡萄糖的KRB缓冲液作为低糖和高糖对照组，实验组细胞分别加入30μg/ml的实施例1～4及对比例制得的青钱柳提取物的KRB缓冲液处理1hr，其中加入30μg/ml实施例1～4的青钱柳提取物的KRB缓冲液处理1hr的标记为实验组1～4，加入2.8mM和16.7mM浓度葡萄糖的KRB缓冲液处理1hr标记为对照组。处理完毕后，按照使用说明书用鼠胰岛素RIA试剂盒(Linco,St.Charles,MO)测量收集的KRB缓冲液中的胰岛素水平。

实验结果显示，实施例1到实施例4所制得的的青钱柳提取物都有刺激胰岛贝塔细胞分泌胰岛素的功能。

从对照组的实验结果可以得知，在高糖刺激下，贝塔细胞的胰岛素的分泌从低糖处理下的15ng/ml上升到37ng/ml，证明实验细胞对外界刺激敏感，生理功能正常。

从实施例1的实验数据得知，在青钱柳提取物的作用下，胰岛贝塔细胞的胰岛素分泌量增加到80.5ng/ml，较高糖刺激下胰岛素的分泌量提高超过1倍，结果如图9所示。

从实施例2将提取物分为不同级分分别测试刺激胰岛素的分泌效果的结果得知，从青钱柳提取的30个级分中，刺激胰岛素分泌的结果有不同。12到15级分具有更强的刺激胰岛贝塔细胞分泌胰岛素的功能。其刺激效果比高葡萄糖刺激下大约高60%到150%。作为对比例的第21到27级分虽也具有刺激胰岛素分泌的功能，但生物活性比前一级分显著降低，仅比高糖刺激下胰岛素的分泌量高10-15%左右，结果如图10所示。

实施例1,2，3，4共同比较的实验结果可以看出，除实施例2由于将对比例极性较强，而活性较弱的21-27级分与非极性的12-15级分混合，造成刺激胰岛素分泌的活性下降外，不同提取方法所得到的青钱柳提取物刺激胰岛素分泌的活性略有差别，但没有形成统计学意义上的显著差异。说明几种提取方法均可行，得到的提取物都具有生物活性，结果如图11所示。

试验例2

从青钱柳提取的组合物，按不同比例稀释观察量效关系。从实验结果得知，对照组不同浓度的葡萄糖对胰岛贝塔细胞刺激作用存在量效关系。实验组由3种不同提取方法得到的青钱柳提取物对胰岛贝塔细胞均有刺激作用，结果显示胰岛素的分泌量与浓度存在明显的量效关系。即高浓度的级分刺激下，胰岛素的分泌量较高，说明青钱柳提取物有作为制备药学上应用物质的价值。结果如图12所示。

试验例3

从青钱柳提取的组合物用于小鼠糖耐受实验

小鼠血糖耐受是在12周龄CD1小鼠身上进行。10只正常小鼠分为对照组和实验组（n＝5），12小时禁食后腹腔下注射100μl生理盐水1：100稀释的青钱柳提取物。30分钟后给予小鼠葡萄糖口服液(1毫克/公斤体重)。用血糖仪检测尾静脉血糖含量。结果显示青钱柳提取物对正常小鼠空腹及餐后血糖均有降低作用，提示有增强小鼠血糖耐受作用，结果如图13所示。

结果分析

由试验例1～2的结果可以看出，青钱柳的不同级分刺激胰岛素分泌的效果有不同。即分离得到的第12-15级分的效果远好于第21-27级分对胰岛素分泌的刺激效果。说明青钱柳中具有降糖功能的有效活性物质主要集中在非极性的部分，其效果远好于极性较强的部分。这也说明本实施例得到的10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇等类非极性物质的降糖效果胜于之前报道的青钱柳苷等类极性物质的效果。上述结果为进一步开发利用青钱柳的药用价值指出了方向。

Claims

1.一种青钱柳提取物，其特征在于，至少含有如下有效成分：

10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇；硝酸壬酯；异-丁氧胺；十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯；己二酸，2-(2乙基己基)酯；2-丁基，1-辛醇；十八烷基乙烯醚和赤独-4,5-二甲基-2-十一碳烯；上述有效成分占青钱柳提取物干重的重量百分比为50%～98%；

包括如下制备步骤：

（2）将步骤（1）制得的萃取液在硅胶柱上用氯仿甲醇混合溶液浓度梯度进行洗脱，氯仿甲醇混合溶液浓度梯度为氯仿：甲醇的体积比是80:1，50:1，30:1，20:1，10:1， 5:1，1:1，0:1，洗脱后得到30级分；收集第12-15级分洗脱液，制得初提物；

2.如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，还含有青钱柳苷。

3. 如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（1）中青钱柳叶含水率为10～15wt%。

4. 如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（1）中青钱柳叶含水率为10wt%。

5. 如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（1）中的提取时间为1.5～2.5小时。

6. 如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（1）中的萃取温度为室温，萃取时间为3～10分钟，提取物与氯仿、正己烷或乙酸乙酯混合的体积比为1:（0.5～2）。

7. 如权利要求6所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（1）中的提取物与氯仿、正己烷或乙酸乙酯混合的体积比为1:1。

8. 如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（2）浓度梯度洗脱的每级洗脱时间为70～180min。

9. 如权利要求8所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（2）浓度梯度洗脱的每级洗脱时间为90min。

10. 如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（2）还包括收集第21-27级分洗脱液。

11. 如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（3）中的洗脱时间为100～150min。

12. 如权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于，所述步骤（3）中的洗脱时间为120min。

13. 权利要求1所述的青钱柳提取物在制备防治糖尿病药物中的应用。