CN112625080B - 一种青钱柳三萜皂苷单体分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种青钱柳三萜皂苷单体分离方法，包括以下步骤：除杂，硅胶拌样，装柱，反相硅胶柱洗脱，色谱分离A，色谱分离B。其中色谱分离A中先分离出青钱柳苷I，洗脱液再继续进行色谱分离B，利用含有硼酸基团的填料，对青钱柳苷II和青钱柳苷III完成分离。本发明方法原料处理量小，溶剂用量少，生产周期短，工艺连贯、简单，可操作性强，生产成本低，安全环保无污染，适合工业化生产；为青钱柳天然活性成分的深入研究，以及青钱柳资源的应用推广奠定了基础。

Description

一种青钱柳三萜皂苷单体分离方法

技术领域

本发明涉及青钱柳天然活性成分的分离方法，具体涉及一种青钱柳三萜皂苷单体分离方法。

背景技术

青钱柳，胡桃科青钱柳属，是一种高大速生乔木，为我国特产。广泛分布于江西、浙江、江苏、安徽、福建、湖南、湖北、四川、贵州、云南等地。据《中国中药资源志要》记载，其树叶、树皮、树根可入药，性温，味辛微苦，具有清热消肿、解毒止痛的功能。长期以来，民间有传统取其叶制茶做饮料，有清热降暑、降血压、治疗高血压和糖尿病，以致延年益寿等功效，故又称其为甜茶树、神茶树、摇钱树。

青钱柳中最重要的天然活性成分是三萜类化合物，青钱柳中的三萜类化合物的种类繁多，包括三萜皂苷以及三萜酸类。

青钱柳三萜酸类化合物包括：青钱柳酸A、青钱柳酸B、α-乳香酸、β-乳香酸、齐墩果酸、阿江榄仁酸、乌苏酸、2α-羟基乌苏酸等。其中，青钱柳酸A、青钱柳酸B、α-乳香酸、β-乳香酸、齐墩果酸的分子构型属于齐墩果烷型五环三萜；乌苏酸和2α-羟基乌苏酸的分子构型属于乌苏烷型五环三萜。

青钱柳三萜皂苷类化合物包括：青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷Ⅱ、青钱柳苷Ⅲ、青钱柳苷A、青钱柳苷B、青钱柳苷C等。其中，青钱柳苷A、青钱柳苷B、青钱柳苷C和青钱柳苷Ⅰ的分子构型属于20，24-环氧达玛烷型四环三萜皂苷；青钱柳苷Ⅱ和青钱柳苷Ⅲ的分子构型属于2，3-裂环达玛烷型四环三萜皂苷。

不同的青钱柳三萜类化合物都有不同或不同程度的风味、生理活性和营养保健作用，例如：青钱柳中的三萜皂苷，如青钱柳苷I(cyclocarioside I)、青钱柳苷Ⅱ(cyclocariosideⅡ)、青钱柳苷Ⅲ(cyclocariosideⅢ)等，属于新型的天然甜味剂，能够满足高血糖患者对甜味的需求，而不加重病情，同时在降糖、降脂、降压方面具有很好的作用。其中青钱柳苷I的甜度约是蔗糖的250倍。齐墩果酸、乌苏酸，虽然不是甜味剂，但是具有清除自由基、抗氧化、抗菌消炎、保肝护肝等作用。

CN107753552A公开了一种青钱柳叶提取物的制备方法，是以青钱柳叶为原料，经高温水提法或低温逆流水提法、蝶式分离、UHT杀菌过滤、冷冻干燥等步骤，等到青钱柳叶提取物。

CN110183545A公开了一种青钱柳多糖的提取及脱色方法，是以青钱柳叶为原料，经水浸泡、复合溶壁酶酶解、超声辅助三级逆流提取、醇沉、水溶解、超声辅助树脂脱色等步骤，得到青钱柳多糖。

CN108567142A公开了一种青钱柳总黄酮的制备方法，是以青钱柳干叶为原料，经粉碎、低温酶提取、活性炭脱色、大孔树脂纯化等步骤，获得含量约为80％的青钱柳总黄酮。

CN109364119A公开了从青钱柳叶中制备具有降血糖作用的总三萜的方法及应用，是以青钱柳叶为原料，经乙醇水混合溶剂提取、有机溶剂液液萃取后、聚酰胺柱色谱有机溶剂洗脱、大孔树脂柱色谱乙醇水洗脱等步骤，得到青钱柳总三萜。

CN 103694364 A公开了一种青钱柳多糖和黄酮同步提取分离与纯化的方法，是将青钱柳叶预处理后，通过用30％乙醇提取，经过调节浓缩液预处理，稀醇上样、AB-8号大孔树脂及D301强酸型阳离子交换树脂的组合串联分离、浓乙醇、0.5mol/L氨水溶液洗脱，经浓缩、冷冻干燥分别得到纯度较高的黄酮、多糖两种生物活性物质。

CN 110051726 A公开了一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法及应用，具体是以青钱柳叶为原料，经乙醇水溶剂提取，有机溶剂萃取，通过聚酰胺材料吸附，洗脱浓缩液获得粗三萜浸膏，在用醇溶液洗脱，得到总黄酮；水提后的青钱柳叶药渣再经热水提取，沉淀，除蛋白，大孔树脂吸附杂质，得到总多糖。

现有技术中对于青钱柳三萜皂苷的提取主要集中于青钱柳苷I的制备提取，因为其含量最多，获得最容易，但对于青钱柳皂苷中同样具有高经济价值的青钱柳苷II和青钱柳苷III，没有利用。CN102432660A公开了一种青钱柳苷I的提取分离方法，方法是将青钱柳干燥叶粉碎，加生物酶酶解1-3天，酶解原料加8-12倍量60-90％乙醇溶液，在50-90℃的温度下浸泡提取1-3次，提取液浓缩至浸膏，加适量水分散后，加入水饱和正丁醇萃取2-4次，合并萃取液加丙酮沉淀，过滤，滤液浓缩干燥得到粗提物，加入适量有机溶剂回流提取，提取液浓缩，冷却，结晶，重结晶，得到青钱柳苷I。CN103232515A公开了一种制备青钱柳苷Ⅰ的方法，步骤如下：(1)取青钱柳干燥叶粉碎，用5～10倍量50～80％甲醇溶液浸泡提取2～3次，提取液减压浓缩至无醇，加入大孔树脂柱中吸附，水洗无糖色，再用3～6倍柱体积40～70％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得浓缩液；(2)上述浓缩液加入大孔树脂中吸附，挥干水分后，装柱，乙酸乙酯、甲醇梯度洗脱，收集流分浓缩，减压干燥即得。

然而，目前能够工业化生产得到的青钱柳提取物，由于生产工艺的缺陷，往往都是经提取初加工、简单富集得到的各种规格、各种成分混合物。由于没有经过精细的分离纯化，产品的纯度或含量严重偏低，青钱柳天然活性成分的风味和保健效果都难以充分发挥。例如，青钱柳总三萜皂苷中有一部分是天然甜味剂，但是其余非甜味剂的三萜皂苷不但不能提供甜味，反而带来了令人不愉快的苦味和涩味。如此亦是青钱柳天然甜味剂资源的研发和应用难以快速开展的原因之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种原料处理量小，溶剂用量少，生产周期短，工艺连贯、简单，可操作性强，生产成本低，安全环保无污染，适合工业化生产的，可同时分离三种青钱柳三萜皂苷单体的生产方法。

青钱柳苷I属于20,24环氧达玛烷型四环三萜皂苷，青钱柳苷II和III属于2,3裂环达玛型四环三萜皂苷，可以通过其极性的不同，用色谱柱的方法将青钱柳苷I和青钱柳苷II，III分离。青钱柳苷II，III分离极性很接近，利用一般的分离方法难以将两者分离，本发明通过硼酸改性的丙烯酸树脂，利用青钱柳苷II上顺式的邻二羟基和硼酸之间的特异性反应，完成青钱柳苷II和青钱柳苷III的分离。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种青钱柳三萜皂苷单体分离方法，包括以下步骤：

(1)除杂：原料青钱柳总三萜皂苷经过粉碎、过筛、加入混合溶剂，室温搅拌，过滤，得不溶物；

(2)硅胶拌样：将不溶物用低碳醇分散、溶解至浸膏状，加入反相硅胶，搅拌均匀，干燥，得拌样硅胶；

(3)装柱：往层析柱筒体中先装入反相硅胶，再在反相硅胶上方装入步骤(2)所得拌样硅胶，得反相硅胶层析柱；

(4)反相硅胶柱洗脱：用洗脱剂对反相硅胶层析柱进行洗脱，收集目标洗脱流出液，浓缩，干燥，得青钱柳苷粗品；

(5)色谱分离A：先将青钱柳苷粗品用低极性流动相I溶解稀释，注入高压制备液相色谱柱I，先以低极性流动相I洗脱，收集洗脱液I，浓缩干燥后得到青钱柳苷I；再用高极性流动相II洗脱，得洗脱液II备用；

(6)色谱分离B：调节洗脱液II为弱碱性，注入高压制备液相色谱柱II，以高极性流动相II洗脱，得到洗脱液III，浓缩干燥得到青钱柳苷III；在高极性流动相II中加入弱酸，调节流动相II为弱酸性，继续洗脱，得到洗脱液IV，浓缩干燥得到青钱柳苷II；所述液相色谱柱II中填料含有硼酸基团或偏硼酸。

优选的，步骤(1)中，所述青钱柳总三萜皂苷的获得是现有技术中已经公知的，比如可参考发明人申请号为CN201911267286.9的发明专利申请文件《一种从青钱柳中分离多种有效成分的连续化方法》。优选地，青钱柳总三萜皂苷的纯度在80wt％以上。

优选的，步骤(1)中，所述的混合溶剂为石油醚、环己烷、正己烷、6#溶剂油、120#溶剂油中任意一种溶剂与乙酸乙酯的混合溶剂，其中，石油醚、环己烷、正己烷、6#溶剂油、120#溶剂油与乙酸乙酯的体积比为6～9：1(L/L)。所述混合溶剂的用量没有特别的限定，能够充分浸润提取样品即可，一般溶剂的体积用量为青钱柳总三萜皂苷样品质量的5～10倍(L/kg)。使用混合溶剂室温搅拌的目的，是除去青钱柳总三萜皂苷中的三萜酸类杂质。将青钱柳总三萜皂苷样品粉碎、过筛的目的，是使混合溶剂充分浸润并渗透样品，增加杂质的浸出量，增强除杂的效果。

优选地，步骤(2)中，所述低碳醇选自甲醇、乙醇、丙醇中的至少一种。低碳醇的体积用量是步骤(1)不溶物质量的1-3倍(L/kg)。

优选地，步骤(2)中，所述反相硅胶的类型为C4、C6、C8、C12、C18中的一种或几种；所述反相硅胶的用量为青钱柳总三萜皂苷样品质量的1～2倍。拌样的目的是使物料能和反相硅胶充分吸附。若反相硅胶的用量过少，物料将无法完全被吸附；若反相硅胶的用量过多，将造成浪费并增加洗脱的难度。

优选地，步骤(3)中，所述反相硅胶的用量为青钱柳总三萜皂苷样品质量的8～12倍。先加入反相硅胶的目的是，提供一个缓冲区域，使洗脱过程中各种成分在反相硅胶柱床中保留不同的时间。若反相硅胶的用量过少，各种成分保留的相对时间太接近，将无法达到分离的目的；若反相硅胶的用量过多，将造成浪费并增加洗脱剂的用量。

优选地，步骤(3)中，所述反相硅胶层析柱的高径比为8～20:1。若层析柱的高径比过小，则分离的效果差；若层析柱的高径比过大，将增加洗脱剂的用量和洗脱的时间。

优选地，步骤(4)中，所述洗脱剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮的水溶液中的一种或几种，洗脱剂的体积百分比浓度为20～90％，洗脱剂的用量为5～20BV，洗脱的流速为0.5～2BV/小时。所述目标洗脱流出液为硅胶薄层层析(TLC)检测富含青钱柳苷(青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷Ⅱ和青钱柳苷Ⅲ)的目标洗脱流出液。

优选地，步骤(5)中，所述高压制备液相色谱柱I中的填料为聚苯乙烯；所述低极性流动相I为乙腈/甲醇/乙醇-四氢呋喃混合溶剂，其中乙腈/甲醇/乙醇体积分数为10～20％；所述高压制备液相色谱柱I的柱压为3～6Mpa；色谱填料的粒径为5～20μm；所述色谱填料的用量为青钱柳苷粗品重量的20～40倍(L/kg)；所述色谱填料装柱的高径比为2～3：1；所述流动相洗脱的流速为20～40BV/小时。

优选地，步骤(6)中，所述调节洗脱液II为弱碱性，是指用NaOH和/或KOH稀溶液调节洗脱液II的pH为9-10；

优选地，步骤(6)中，所述所述高压制备液相色谱柱II中的填料为苯硼酸改性的丙烯酸树脂；高极性流动相II为乙腈/甲醇/乙醇-水混合溶剂，乙腈/甲醇/乙醇体积占比为25～40％；所述高压制备液相色谱柱II的柱压为5～8Mpa；色谱填料的粒径为5～20μm；所述色谱填料的用量为青钱柳苷粗品重量的20～40倍(L/kg)；所述色谱填料装柱的高径比为2～3：1。

优选地，步骤(6)中，所述所述高压制备液相色谱柱II中的填料为苯硼酸改性的丙烯酸树脂；更优选地，所述苯硼酸改性的聚丙烯酸树脂是在聚丙烯酸树脂中加入10-20wt％的4-氨基苯硼酸的乙醇溶液，在羧基活化剂作用下改性得到。所述羧基活化剂为N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种。

更为具体而言，将4-氨基苯硼酸溶于乙醇溶液，得到10-20wt％的4-氨基苯硼酸的乙醇溶液，加入到聚丙烯酸树脂中，4-氨基苯硼酸的乙醇溶液的体积用量是丙烯酸树脂质量的1-2倍(L/kg)，再加入溶有羧基活化剂的MDF溶液，羧基活化剂是丙烯酸树脂的0.1-0.5wt％，在5-10℃反应4-8h，即得苯硼酸改性的聚丙烯酸树脂。

优选地，步骤(6)中，所述弱酸为醋酸，加入量为流动相II中醋酸浓度为1-3wt％。加入醋酸的目的一方面防治青钱柳苷II和III的交叉和拖尾，另一方面可以调节流动相为弱酸性，使青钱柳苷II和硼酸基反应后的硼酸酯解离重新得到青钱柳苷II，进而被洗脱下来。

优选地，步骤(6)中，在收集洗脱液III时，流动相II的流速为5-10BV/小时；在收集洗脱液IV时，即在流动相II中加入醋酸后，流动相II的流速为10-20BV/小时。

本发明的低极性流动相I和高极性流动相II中“低极性”和“高极性”，是流动相I和流动相II相比较而言。即表达的是流动相II的极性强于流动相I。

本发明中，1BV＝1个反相硅胶层析柱装柱体积或1个色谱填料装柱体积。

本发明方法的原理是：

使用低极性有机溶剂与乙酸乙酯的混合溶剂搅拌除杂，可以除去青钱柳总三萜皂苷中的三萜酸类杂质；再使用反相硅胶干法柱层析，可以将青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷Ⅱ和青钱柳苷Ⅲ富集，得到青钱柳苷混合粗品；再通过高压制备液相色谱，利用极性的差异，将青钱柳苷Ⅰ洗脱分离，再更换高极性流动相II，利用苯硼酸改性的丙烯酸树脂上的苯硼酸基团和顺邻二羟基的特异性反应，分离得到了一般分离方法无法有效分离的青钱柳苷II和青钱柳苷III。

本发明方法的有益效果如下：

(1)本发明方法提供了一种同时分离三种青钱柳三萜皂苷单体的生产方法，所得的青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷Ⅱ和青钱柳苷Ⅲ产品含量高，收率高。

(2)本发明方法原料处理量小，溶剂用量少，生产周期短，工艺连贯、简单，可操作性强，生产成本低，安全环保无污染，适合工业化生产。

(3)本发明方法制得的三种青钱柳三萜皂苷单体含量高、生理活性强、甜味纯正，为青钱柳天然活性成分的深入研究，以及青钱柳资源的应用推广奠定了基础。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的青钱柳总三萜皂苷样品购于湖南华诚生物资源股份有限公司，其中青钱柳总三萜皂苷的含量为90.20％，青钱柳苷Ⅰ的含量为42.35％，青钱柳苷Ⅱ的含量为9.29％，青钱柳苷Ⅲ的含量为8.52％；本发明实施例所使用的柱层析填料聚苯乙烯(10μm)；C18、C12反相硅胶购于青岛邦凯(粒径30μm，色谱纯)；本发明实施例所用聚丙烯酸树脂填料采购自西安天正药用辅料有限公司；本发明实施例所使用的高压制备液相色谱购于江苏汉邦科技有限公司；本发明实施例所使用的辅料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用高效液相色谱(HPLC)外标法测定青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷Ⅱ和青钱柳苷Ⅲ的含量，采用香草醛-高氯酸比色法检测青钱柳总三萜皂苷的含量。

制备例

将4-氨基苯硼酸溶于乙醇溶液，得到15wt％的4-氨基苯硼酸的乙醇溶液，再加入到聚丙烯酸树脂中，4-氨基苯硼酸的乙醇溶液的体积用量是丙烯酸树脂质量的1倍(L/kg)，再加入溶有N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐的MDF溶液，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为丙烯酸树脂的0.1-0.5wt％，在5-10℃反应4-8h，即得苯硼酸改性的聚丙烯酸树脂。

实施例1

(1)除杂：取青钱柳总三萜皂苷样品1kg，粉碎，过60目筛，加入10L混合溶剂(石油醚：乙酸乙酯＝6：1，L/L)，室温搅拌4小时，过滤，得不溶物；

(2)硅胶拌样：将不溶物用甲醇分散、溶解至浸膏状，加入2kg反相硅胶C18，搅拌均匀，60℃鼓风干燥至恒重，得拌样硅胶。

(3)装柱：往层析柱筒体中先装入8kg反相硅胶C18，再在反相硅胶上方装入步骤(2)所得拌样硅胶，得反相硅胶层析柱，其高径比为8:1；

(4)反相硅胶柱洗脱：用洗脱剂(甲醇水溶液，体积百分比浓度为60％，用量为7BV)对反相硅胶层析柱进行洗脱，洗脱的流速为1BV/小时，采用硅胶薄层层析(TLC)检测的方式，收集含有青钱柳苷(青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷Ⅱ和青钱柳苷Ⅲ)的流出液，浓缩，干燥，得青钱柳苷粗品；

(5)制备色谱分离：将青钱柳苷粗品用流动相I(乙腈-四氢呋喃混合溶剂，其中乙腈体积分数为13％)溶解、稀释固形物浓度为10％的溶液，再注入高压制备液相色谱柱I(柱压为4Mpa，色谱柱的填料类型为聚苯乙烯，色谱填料的粒径为10μm，色谱填料的用量为26L，色谱填料装柱的高径比为2.2：1)，用流动相I以28BV/小时的流速洗脱。从洗脱开始计时，第20～30min为洗脱液I，洗脱液I浓缩干燥得到的高含量青钱柳苷Ⅰ产品410.15g；收集洗脱液I结束后，再用高极性流动相II(乙腈和水的混合溶剂，其中乙腈体积占比35％)洗脱，得到洗脱液II。

(6)用5wt％NaOH调节洗脱液II的pH为9.5，注入高压制备液相色谱柱II(柱压为5Mpa，色谱填料的用量为20L，色谱填料装柱的高径比为2.5：1)，填料为制备例制得的苯硼酸改性聚丙烯酸树脂，以高极性流动相II洗脱，收集第10-20min为洗脱液III，洗脱液III浓缩干燥得到得到的高含量青钱柳苷Ⅲ产品81.65g；之后，在流动相II中加入醋酸，使醋酸在流动相II的浓度为2wt％，继续洗脱，得到洗脱液IV，浓缩干燥后得到的高含量青钱柳苷Ⅱ产品88.65g。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得青钱柳苷Ⅰ的含量为98.31％，青钱柳苷Ⅰ的收率为95.21％；本实施例所得青钱柳苷Ⅱ的含量为96.76％，青钱柳苷Ⅱ的收率为92.33％；本实施例所得青钱柳苷Ⅲ的含量95.89％，青钱柳苷Ⅲ的收率为91.89％。

实施例2

(1)除杂：取青钱柳总三萜皂苷样品1kg，粉碎，过60目筛，加入8L混合溶剂(环己烷：乙酸乙酯＝9：1，L/L)，室温搅拌6小时，过滤，得不溶物；

(2)硅胶拌样：将不溶物用乙醇分散、溶解至浸膏状，加入2kg反相硅胶C12，搅拌均匀，60℃鼓风干燥至恒重，得拌样硅胶。

(3)装柱：往层析柱筒体中先装入12kg反相硅胶C12，再在反相硅胶上方装入步骤(2)所得拌样硅胶，得反相硅胶层析柱，其高径比为11:1；

(4)反相硅胶柱洗脱：用洗脱剂(乙腈的水溶液，体积百分比浓度为36％，用量为10BV)对反相硅胶层析柱进行洗脱，洗脱的流速为1BV/小时，采用硅胶薄层层析(TLC)检测的方式，收集含有青钱柳苷(青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷Ⅱ和青钱柳苷Ⅲ)的流出液，浓缩，干燥，得青钱柳苷粗品；

(5)制备色谱分离：将青钱柳苷粗品用流动相I(甲醇-四氢呋喃混合溶剂，其中甲醇体积分数为10％)溶解、稀释固形物浓度为10％的溶液，再注入高压制备液相色谱柱(柱压为6Mpa，色谱柱的填料类型为聚苯乙烯，色谱填料的粒径为10μm，色谱填料的用量为30L，色谱填料装柱的高径比为2.5：1)，用流动相I以25BV/小时的流速洗脱。从洗脱开始计时，第22～33min为洗脱液I，洗脱液I浓缩干燥得到的高含量青钱柳苷Ⅰ产品418.63g；收集洗脱液I结束后，再用高极性流动相II(甲醇和水的混合溶剂，其中乙腈体积占比30％)洗脱，得到洗脱液II。

(6)用5wt％NaOH调节洗脱液II的pH为9，注入高压制备液相色谱柱II(柱压为6Mpa，色谱填料的用量为20L，色谱填料装柱的高径比为2.4：1)，填料为制备例制得的苯硼酸改性聚丙烯酸树脂，以高极性流动相II洗脱，收集第10-20min为洗脱液III，洗脱液III浓缩干燥得到得到的高含量青钱柳苷Ⅲ产品81.53g；之后，在流动相II中加入醋酸，使醋酸在流动相II的浓度为3wt％，继续洗脱，得到洗脱液IV，浓缩干燥后得到的高含量青钱柳苷Ⅱ产品88.74g。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得青钱柳苷Ⅰ的含量为97.41％，青钱柳苷Ⅰ的收率为96.29％；本实施例所得青钱柳苷Ⅱ的含量为97.55％，青钱柳苷Ⅱ的收率为93.18％；本实施例所得青钱柳苷Ⅲ的含量96.68％，青钱柳苷Ⅲ的收率为92.51％。

实施例3

(1)除杂：取青钱柳总三萜皂苷样品1kg，粉碎，过60目筛，加入9L混合溶剂(6#溶剂油：乙酸乙酯＝8：1，L/L)，室温搅拌5小时，过滤，得不溶物；

(2)硅胶拌样：将不溶物用甲醇分散、溶解至浸膏状，加入1.6kg反相硅胶C18，搅拌均匀，60℃鼓风干燥至恒重，得拌样硅胶。

(3)装柱：往层析柱筒体中先装入10kg反相硅胶C18，再在反相硅胶上方装入步骤(2)所得拌样硅胶，得反相硅胶层析柱，其高径比为9:1；

(4)反相硅胶柱洗脱：用洗脱剂(丙酮的水溶液，体积百分比浓度为25％，用量为13BV)对反相硅胶层析柱进行洗脱，洗脱的流速为1.5BV/小时，采用硅胶薄层层析(TLC)检测的方式，收集含有青钱柳苷(青钱柳苷Ⅰ、青钱柳苷Ⅱ和青钱柳苷Ⅲ)的流出液，浓缩，干燥，得青钱柳苷粗品；

(5)制备色谱分离：将青钱柳苷粗品用流动相I(乙醇-四氢呋喃混合溶剂，其中乙腈体积分数为23％)溶解、稀释固形物浓度为10％的溶液，再注入高压制备液相色谱柱(柱压为6Mpa，色谱柱的填料类型为聚苯乙烯，色谱填料的粒径为10μm，色谱填料的用量为32L，色谱填料装柱的高径比为2.6：1)，用流动相I以20BV/小时的流速洗脱。从洗脱开始计时，第24～35min为洗脱液I，洗脱液I浓缩干燥得到的高含量青钱柳苷Ⅰ产品405.64g；收集洗脱液I结束后，再用高极性流动相II(乙腈和水的混合溶剂，其中乙腈体积占比32％)洗脱，得到洗脱液II。

(6)用5wt％NaOH调节洗脱液II的pH为9.5，注入高压制备液相色谱柱II(柱压为8Mpa，色谱填料的用量为20L，色谱填料装柱的高径比为2.5：1)，填料为制备例制得的苯硼酸改性聚丙烯酸树脂，以高极性流动相II洗脱，收集第10-20min为洗脱液III，洗脱液III浓缩干燥得到得到的高含量青钱柳苷Ⅲ产品83.0g；之后，在流动相II中加入醋酸，使醋酸在流动相II的浓度为3wt％，继续洗脱，得到洗脱液IV，浓缩干燥后得到的高含量青钱柳苷Ⅱ产品87.22g。

经高效液相色谱(HPLC)外标法检测，本实施例所得青钱柳苷Ⅰ的含量为98.89％，青钱柳苷Ⅰ的收率为94.72％；本实施例所得青钱柳苷Ⅱ的含量为97.22％，青钱柳苷Ⅱ的收率为91.28％；本实施例所得青钱柳苷Ⅲ的含量95.24％，青钱柳苷Ⅲ的收率为92.77％。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种青钱柳三萜皂苷单体分离方法，包括以下步骤：

（1）除杂：原料青钱柳总三萜皂苷经过粉碎、过筛、加入混合溶剂，室温搅拌，过滤，得不溶物，所述的混合溶剂为石油醚、环己烷、正己烷、6#溶剂油、120#溶剂油中任意一种溶剂与乙酸乙酯组成的混合溶剂；

（2）硅胶拌样：将不溶物用低碳醇分散、溶解至浸膏状，加入反相硅胶，搅拌均匀，干燥，得拌样硅胶；所述低碳醇选自甲醇、乙醇、丙醇中的至少一种；

（3）装柱：往层析柱筒体中先装入反相硅胶，再在反相硅胶中装入步骤（2）所得拌样硅胶，得反相硅胶层析柱；

（4）反相硅胶柱洗脱：用洗脱剂对反相硅胶层析柱进行洗脱，收集目标洗脱流出液，浓缩，干燥，得青钱柳苷粗品；

（5）色谱分离A：先将青钱柳苷粗品用低极性流动相I溶解稀释，注入高压制备液相色谱柱I，先以低极性流动相I洗脱，收集洗脱液I，浓缩干燥后得到青钱柳苷I；再用高极性流动相II洗脱，得洗脱液II备用；所述高压制备液相色谱柱I中的填料为聚苯乙烯；所述低极性流动相I为乙腈、甲醇、乙醇中的一种和四氢呋喃的混合溶剂，其中乙腈、甲醇或乙醇体积分数为10～20%，高极性流动相II为乙腈、甲醇、乙醇中的一种和水的混合溶剂，乙腈、甲醇或乙醇体积占比为25～40%；

（6）色谱分离B：调节洗脱液II为弱碱性，注入高压制备液相色谱柱II，以高极性流动相II洗脱，得到洗脱液III，浓缩干燥得到青钱柳苷III；在高极性流动相II中加入弱酸，调节高极性流动相II为弱酸性，继续洗脱，得到洗脱液IV，浓缩干燥得到青钱柳苷II；所述高压制备液相色谱柱II中填料含有硼酸基团或偏硼酸；所述高压制备液相色谱柱II中的填料为苯硼酸改性的丙烯酸树脂；所述苯硼酸改性的聚丙烯酸树脂是在聚丙烯酸树脂中加入10-20wt%的4-氨基苯硼酸的乙醇溶液，在羧基活化剂作用下改性得到。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，石油醚、环己烷、正己烷、6#溶剂油、120#溶剂油中任意一种与乙酸乙酯的体积比为6～9：1，单位为L/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述低碳醇选自甲醇、乙醇、丙醇中的至少一种；低碳醇的体积用量是步骤(1)不溶物质量的1-3倍，单位为L/kg；

和/或所述反相硅胶的类型为C4、C6、C8、C12、C18中的一种或几种；所述反相硅胶的用量为青钱柳总三萜皂苷样品质量的1～2倍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述反相硅胶的用量为青钱柳总三萜皂苷样品质量的8～12倍，所述反相硅胶层析柱的高径比为8～20:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述洗脱剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮的水溶液中的一种或几种，洗脱剂的体积百分比浓度为20～90%，洗脱剂的用量为5～20BV，洗脱的流速为0.5～2BV/小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述高压制备液相色谱柱I的柱压为3～6Mpa；色谱填料的粒径为5～20μm；所述色谱填料的用量为青钱柳苷粗品重量的20～40倍，单位为L/kg；所述色谱填料装柱的高径比为2～3：1；所述低极性流动相I洗脱的流速为20～40 BV/小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述调节洗脱液II为弱碱性，是指用NaOH和/或KOH稀溶液调节洗脱液II的pH为9-10。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述高压制备液相色谱柱II的柱压为5～8Mpa；色谱填料的粒径为5～20μm；所述色谱填料的用量为青钱柳苷粗品重量的20～40倍，单位为L/kg；所述色谱填料装柱的高径比为2～3：1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述弱酸为醋酸，加入量为使高极性流动相II中醋酸浓度为1-3wt%。