CN111100175A - 一种3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用 - Google Patents
一种3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及青钱柳研究领域,尤其涉及一种3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用。
背景技术
青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Bata1)Iljinsk]属于双子叶植物胡桃科青钱柳属,是中国特有的单属种植物,是第四冰川世纪幸存下来的孑遗植物,国家重点保护的濒危植物之一,十分珍贵,被誉为“植物界大熊猫”、“植物界活化石”。青钱柳又称金钱柳、山麻柳、摇钱树、甜茶树、一串钱等,仅零星分布于我国长江以南地区,《中国中药资源志要》、《中华本草》、《全国中草药汇编》、《药用植物辞典》及《湖南药物志》等权威典籍均收载了青钱柳用于糖尿病、高血脂、高血压、关节痛、神经衰弱等疾病治疗;现代众多药理学研究也证明,青钱柳叶降血糖效果明显,且对正常机体的血糖无影响,不会引起低血糖反应,安全可靠,因此被医学界称之为“天然植物胰岛素”。青钱柳叶提取物可通过改善胰岛素抵抗、抑制α-葡萄糖苷酶活性、抑制肝糖异升、修复受损的胰岛细胞、调节胰岛素代谢等多条途径来调节血糖血脂,其中改善胰岛素抵抗的作用最为明显和突出:青钱柳叶水提物能改善胰岛素受体及受体底物的表达,增加2型糖尿病的胰岛素敏感性的作用,促进外周组织糖代谢。但是,目前青钱柳降血糖研究还多集中于简单粗提物和萃取物,生物活性研究也只是一些简单的体外实验,对其活性成分的追踪和系统研究则远远滞后,药效物质基础及分子作用机制研究还不够深入,严重制约了其更为科学、广泛的临床应用和创新药物研发,亟需进一步研究和阐明。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:解决上述现有技术存在的问题,而提供一种3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用,对青钱柳的活性成分、药效物质基础及分子作用机制进行系统研究。
本发明采用的技术方案是:
一种3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物,结构式如式(1)-式(4) 所示:
本发明的另一方面涉及一种上述3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物的提取方法,包括以下步骤:
S1、将青钱柳叶用乙醇、加热回流提取,浓缩得浸膏;
S2、将浸膏用水分散,依次用二氯甲烷、正丁醇萃取,并将萃取液浓缩,分别得二氯甲烷萃取浓缩液、正丁醇萃取浓缩液;
S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液、正丁醇萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。
S1中,青钱柳叶经过干燥粉碎处理。
S1中,采用乙醇的浓度为70%,青钱柳叶质量与乙醇的比值为 1:10,加热的温度为120℃,加热的时间为2-3h,浓缩的温度为60℃,浓缩的时间为2-3天。
S2中,利用二氯甲烷、正丁醇萃取三次,青钱柳叶质量与每次使用的二氯甲烷体积的比值为1:10,青钱柳叶质量与每次使用的正丁醇体积的比值为1:10,浓缩的温度为60℃,浓缩的时间为24-48小时。
本发明的另一方面涉及上述3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物在制备治疗糖尿病、高血脂、高血压、关节痛、神经衰弱的药物中的应用。
本发明的另一方面涉及一种治疗糖尿病的药物,含上述3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物或其药学上可用的盐。
本发明具有以下优点:
(1)分析得到青钱柳的改善IR活性部位为二氯甲烷和正丁醇部位,并从二氯甲烷活性部位分离得到7个3,4-裂环达玛烷型四环三萜类化合物,其中本发明得到的4个3,4-裂环达玛烷型四环三萜类化合物是新化合物。
(2)对胰岛抵抗3T3-L1脂肪细胞糖代谢脂代谢的影响:药物组与模型组比较,Comp.2能够显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗量;且与空白组比较,IR模型组对FFA含量显著增加(P<0.01);药物组与模型组比较Comp.2能够抑制IR脂肪细胞FFA的产生,降低细胞中游离脂肪酸的含量,效果与罗格列酮相当。
(3)改善IR活性筛选及机制初探:三萜类化合物均能在一定程度上激活PPARγ,其中以本发明的Comp.2激活PPARγ的作用最强,其效果与PPARγ激动剂ROS效果相当。
综上所述,3,4-裂环达玛烷型四环三萜有较好的降糖效果,而该类化合物侧链上含有的羟基数目多少与降糖效果强弱存在一定联系。 3,4-裂环达玛烷型四环三萜侧链上含有的羟基数目越多,其降糖效果愈明显,猜测可能是羟基数目变多增加了与PPARγ的结合位点。
附图说明
图1为萃取浓缩液对大鼠2型糖尿病模型体重(g)的影响示意图;
图2为萃取浓缩液对大鼠2型糖尿病模型摄水量(g/kg)的影响示意图;
图3为萃取浓缩液对大鼠2型糖尿病模型空腹血糖(mmol/L)的影响示意图;
图4为萃取浓缩液对大鼠2型糖尿病模型空腹胰岛素(uIU/L)的影响示意图。
具体实施方案
为了更好的理解上述技术方案,下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案做详细的说明。
实施例
1.1青钱柳药材处理:青钱柳干燥叶(10Kg),粉碎后用70%乙醇120℃加热回流提取(100L;2×2h),60℃浓缩得浸膏。浸膏进一步用水分散,依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,每次10L,萃取3次,萃取液60℃浓缩,分别得不同极性部位的萃取浓缩液。
本实验采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。二氯甲烷部位经硅胶柱层析 CH2Cl2:CH3OH(100:1-0:100)梯度洗脱,10%EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色,不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析,浓缩合并得到9个部位(A-I)。A-I部位TLC薄层分析,10%浓硫酸/乙醇加热显色,其中Fr.I薄层板显示紫红色条带,HPLC-DAD 分析主要为末端吸收,初步确定I部位为三萜类富集部位。首先对FrI 采用聚酰胺柱色谱,以EtOH:H2O(0%,30%,70%,95%)梯度洗脱去除色素,鞣质等干扰性成分。接着采用多次硅胶柱层析、小孔树脂柱层析和反向ODS柱层析,整个分离过程用UPLC-MS/MS方法对三萜进行追踪,10%EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色及HPLC-DAD对样品进行分析,从而对3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物进行有效分离,最后采用半制备高效液相对目标化合物进行纯化。
1.2生物活性导向筛选青钱柳活性部位:采用T2DM大鼠模型对青钱柳改善IR作用的活性部位进行追踪和筛选:以罗格列酮为对照药,设置浓度为3mg/kg,以大鼠体重、摄水量、空腹血糖值、空腹胰岛素值为指标,于造模后7天、给药后14天(造模21天)、给药后28天(造模35天)、给药后42天(造模49天)分别测定上述四个指标,综合评价二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水部位的降糖作用。青钱柳的临床拟用量为12g生药/天,根据体表面积法换算成大鼠等效剂量为12*0.018/0.2≈1.2g生药/kg。
1.3活性部位成分研究
1.3.1提取分离与纯化:运用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、HW-40C 凝胶、Sephadex LH-20凝胶及PrepHPLC、PrepTLC等现代色谱分离技术对活性部位进行系统的化学成分研究。根据3,4-裂环达玛烷型四环三萜类化合物的特征UV吸收和TLC显色反应,采用HPLC-DAD、 TLC和UPLC-MS/MS方法进行追踪、分析及分离纯化。
二氯甲烷部位经硅胶柱层析CH2Cl2:CH3OH(100:1-0:100)梯度洗脱,10%EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色,不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析,浓缩合并得到9个部位(A-I)。 A-I部位TLC薄层分析,10%浓硫酸/乙醇加热显色,其中Fr.I薄层板显示紫红色条带,HPLC-DAD分析主要为末端吸收,初步确定I部位为三萜类富集部位。首先对FrI采用聚酰胺柱色谱,以EtOH:H2O(0%, 30%,70%,95%)梯度洗脱去除色素,鞣质等干扰性成分,其中得到4 个馏分(FrIA-FrID)。FrIB经硅胶柱层析CH2Cl2:CH3OH(100:1-0:100)梯度洗脱,10%EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色及HPLC-DAD对样品进行分析,浓缩合并得6组馏分(1-6),FrIB-2经多次硅胶柱层析,在该过程中结晶得到化合物1(9.4mg),化合物2(9.7mg)。FrIB-3经硅胶柱层析后,得到4组馏分(FrIB-3-a-FrIB-3-d),FrIB-3-c通过硅胶柱层析,聚酰胺柱层析,小孔树脂柱层析结晶得到混晶1,混晶1经半制备高效液相分离得到化合物3(2.1mg)。FrIC通过反向ODS柱层析 CH3OH:H2O(0%,30%,50%,70%,95%)梯度洗脱得到5个馏分(1-5)。 FrIC-3经聚酰胺柱层析,小孔树脂柱层析结晶得到混晶2,混晶2经半制备高效液相分离得到化合物4(3.1mg),化合物5(10.8mg)。FrIC-4经聚酰胺柱层析分离,多次小孔树脂柱层析,最后通过多次半制备高效液相分离得到化合物6(9.2mg),化合物7(12mg)。
1.3.2结构确证:运用UV、IR、NMR、MS、CD、ORD、ECD 及单晶X-rays等现代光谱技术确证各化合物的平面结构和立体构型,进行谱学表征和光谱数据的系统归属。
首先通过紫外吸收确认化合物的吸收类型以及其是否存在共轭片段。接着采用1D/2D NMR对化合物的平面结构进行确定,并通过质谱对其分子量进行确认。对于化合物的绝对构型采用NOESY, ROESY以及CD、ECD等确认。
1.4降血糖作用与机制研究
1.4.1对胰岛抵抗3T3-L1脂肪细胞糖代谢的影响:取诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,设置空白对照组、模型组。空白组给予(含 10%胎牛血清)DMEM高糖培养基,模型组给予含0.5mmol/L的棕榈酸和33mmol/L的葡萄糖的诱导液进行造模48h,采用GOD-POD 法测定细胞上清液中葡萄糖含量的变化,确定造模是否成功。取造模成功的脂肪细胞,分组给药,设置空白对照组(完全培养基)、IR模型组、IR模型溶媒组、三萜化合物处理组、阳性药物罗格列酮(ROS) 组。各组药物处理48h后提取细胞上清液,GOD-POD法检测葡萄糖消耗。
1.4.2对胰岛抵抗3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响:同上取造模成功的脂肪细胞,分组给药,设置空白对照组(完全培养基)、IR模型组、IR模型溶媒组、三萜化合物处理组、阳性药物罗格列酮(ROS) 组。各组药物处理48h后提取细胞上清液,采用ACS-POD试剂盒测定游离脂肪酸含量。
1.4.3对3T3-L1脂肪细胞PPARγ活性的影响:使用PPARγ酶联免疫吸附检测脂肪细胞PPARγ蛋白,将3T3-L1脂肪细胞以5×106 个/mL接种于6孔培养板,每孔0.2mL,37℃、5%CO2孵育48h,随机分为:空白对照组、溶媒对照组、三萜化合物处理组、阳性药物ROS 组。每组做3个复孔,37℃、5%CO2培养48h。收集上述细胞于离心管内,4℃1000r离心20min,离心后弃上清,细胞沉淀加入细胞裂解液裂解细胞。在包被过一抗的酶标板上加样分别设空白孔、标准孔、样本孔。空白孔加样品稀释液100μL,标准孔分别加0.16、0.31、 0.63、1.25、2.5、5.0、10ng/mL的PPARγ标准品(供制备标准曲线),样本孔加各组实验药物组细胞上清液各100μL于包被过一抗的酶标板,轻轻混匀。给酶标板覆膜,37℃孵育90min。弃去液体,甩干,不用洗涤,每个孔中加入生物素化抗体(二抗)工作液100μL(使用前 15min配制)。覆膜,37℃,1h。弃液,甩干,洗板3次,每次浸泡 1-2min,甩干液体。加酶结合物工作液(临用前15min配)100μL,覆膜。37℃,30min。弃液,甩干,洗板5次。加底物溶液(TMB)100μ L,覆膜,避光15min,不超过30min。加入中止液50μL,终止反应,此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度 (OD值),通过标准曲线计算各药物组细胞液PPARγ浓度。
1.5统计方法:
采用SPSS 25.0进行统计分析,统计学意义的水平设定为P<0.05。计量资料采用均数±标准差(±s)。用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性,用单因素方差分析 (One-way ANOVA)和post Hoc LSD进行统计分析;如果不符合正态性和方差不齐,则用Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P<0.05),则用Dunnett’s Test(非参数方法)进行比较分析。
2.结果
2.1生物活性导向筛选青钱柳活性部位
如表1,表2,表3,表4所示,二氯甲烷和正丁醇部位均可不同程度改善T2DM大鼠体重、摄水量、空腹血糖值、空腹胰岛素值,与模型对照组相比有较显著差异(P<0.05或P<0.01),与阳性对照药物罗格列酮(ROS)效果相当,而水部位及乙酸乙酯作用微弱(P>0.05)。结果表明青钱柳的改善IR活性部位为二氯甲烷和正丁醇部位。
表1青钱柳对大鼠2型糖尿病模型体重(g)的影响
其中DCM表示二氯甲烷、EA表示乙酸乙酯、Bu表示正丁醇,下同。
表2.青钱柳对大鼠2型糖尿病模型摄水量(g/kg)的影响
表3.青钱柳对大鼠2型糖尿病模型空腹血糖(mmol/L)的影响
表4.青钱柳对大鼠2型糖尿病模型空腹胰岛素(uIU/L)的影响
2.2化学部分:
对活性部位进行目标成分分离,得到了7个3,4-裂环达玛烷型四环三萜,其中4个为新化合物,结构如下式所示:
化合物1:白色无定形粉末,易溶于甲醇,不溶于水;[α]25D+8.1(c 0.06, MeOH);HPLC-UV(ACN-H2O)λmax:203nm;HRESIMS,m/z 637.3956[M-H]-。
化合物2:白色无定形粉末,易溶于甲醇,不溶于水;[α]25D–10.6(c 0.10,MeOH);HPLC-UV(ACN-H2O)λmax:203nm;HRESIMS,m/z 635.4157[M-H]-。
化合物3:白色无定形粉末,易溶于甲醇,不溶于水;[α]25D+12.0(c 0.01,MeOH);HPLC-UV(ACN-H2O)λmax:203nm;HRESIMS,m/z 637.3956[M– H]–。
化合物4:白色无定形粉末,易溶于甲醇,不溶于水;[α]25D–87.5(c 0.056,MeOH);HPLC-UV(ACN-H2O)λmax:203nm;HRESIMS,m/z 673.4293[M +Na]+。
其余3个3,4-裂环达玛烷型四环三萜为已知化合物,结构式如下式所示:
表5.化合物1、2、3、4的1H NMR和13C NMR信号归属
2.3降血糖作用与机制研究
2.3.1对胰岛抵抗3T3-L1脂肪细胞糖代谢的影响
由表6可见,药物组与模型组比较,Comp.2、Comp.5-7能够显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗量(P<0.05或P<0.01),其中以Comp.2效果最好。
与模型组对比,#p<0.05,##p<0.01
2.3.2对胰岛素抵抗脂肪细胞脂代谢的影响
由表7可见,与空白组比较,IR模型组对FFA含量显著增加 (P<0.01);药物组与模型组比较Comp.2、Comp.5-7能够抑制IR脂肪细胞FFA的产生,降低细胞中游离脂肪酸的含量,其中以Comp.2效果最好。
与模型组对比,#p<0.05,##p<0.01
2.3.3改善IR活性筛选及机制初探
PPARγ酶联免疫吸附检测各药物组吸光值结果见表8,候选化合物均能在一定程度上激活PPARγ,其中Comp.2激活PPARγ的作用最强,其效果与PPARγ激动剂ROS效果相当。此外,Comp.2、 Comp.5-7能显著激活PPARγ,结果表明达玛烷型四环三萜(Comp.2、Comp.5-7)对经高糖高脂诱导的3T3-L1脂肪细胞的保护作用可能是通过激活PPARγ蛋白,发挥改善IR作用。
表8.酶联免疫吸附检测各药物组PPARγ蛋白量(ng/μL)
与模型组对比,#p<0.05,##p<0.01
本发明从青钱柳的活性部位中分离得到7个3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物,其中4个是新化合物。同时对这一系列化合物进行了降糖降脂的活性测定,并对其进行了初步机制研究,发现Comp.2能够显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗量;且与空白组比较, IR模型组对FFA含量显著增加(P<0.01);药物组与模型组比较Comp.2 能够抑制IR脂肪细胞FFA的产生,降低细胞中游离脂肪酸的含量,效果与罗格列酮相当。Comp.2、Comp.5-7均能在一定程度上激活 PPARγ,其中以Comp.2激活作用最强,其效果与PPARγ激动剂 ROS效果相当。
Claims (7)
2.一种权利要求1所述的3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物的提取方法,其特征在于包括以下步骤:
S1、将青钱柳叶用70%乙醇/水加热回流提取,浓缩得浸膏;
S2、将浸膏用水分散,依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取,并将萃取液浓缩,分别得二氯甲烷萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液、正丁醇萃取浓缩液和水萃取浓缩液;
S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。
二氯甲烷部位经硅胶柱层析CH2Cl2:CH3OH(100:1-0:100)梯度洗脱,10%EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色,不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析,浓缩合并得到9个部位(A-I)。A-I部位TLC薄层分析,10%浓硫酸/乙醇加热显色,其中Fr.I薄层板显示紫红色条带,HPLC-DAD分析主要为末端吸收,初步确定I部位为三萜类富集部位。首先对FrI采用聚酰胺柱色谱,去除色素,鞣质等干扰性成分。接着采用硅胶柱层析、小孔树脂柱层析和反向ODS柱层析,整个分离过程用UPLC-MS/MS方法对三萜进行追踪,10%EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色及HPLC-DAD对样品进行分析,从而对3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物进行有效分离。最后采用半制备高效液相对目标化合物进行纯化。
3.如权利要求2所述的3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物的提取方法,其特征在于:S1中,青钱柳叶经过干燥粉碎处理。
4.如权利要求2所述的3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物的提取方法,其特征在于:S1中,采用乙醇的浓度为70%,青钱柳叶质量与乙醇的比值为1:10,加热的温度为120℃,加热的时间为2h,浓缩的温度为60℃,浓缩的时间为2-3天。
5.如权利要求2所述的3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物的提取方法,其特征在于:S2中,利用二氯甲烷萃取三次,青钱柳叶质量与每次使用的二氯甲烷体积的比值为1:10,青钱柳叶质量与每次使用的正丁醇体积的比值为1:10,浓缩的温度为60℃,浓缩的时间为24-48小时。
6.一种权利要求1所述的3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物在制备治疗糖尿病、高血脂、高血压、关节痛、神经衰弱的药物中的应用。
7.一种治疗糖尿病的药物,含权利要求1所述的至少一种3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物或其药学上可用的盐。
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CN108235686A (zh) * | 2015-06-24 | 2018-06-29 | 阿纳里蒂科探索有限责任公司 | 新型三萜苷作为甜味剂或甜味增强剂 |
CN110746474A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-02-04 | 广西师范大学 | 达玛烷型三萜皂苷类化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用 |
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2020
- 2020-01-03 CN CN202010006769.XA patent/CN111100175A/zh not_active Withdrawn
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