CN112979727B - 达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用 - Google Patents

达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112979727B
CN112979727B CN202110426760.9A CN202110426760A CN112979727B CN 112979727 B CN112979727 B CN 112979727B CN 202110426760 A CN202110426760 A CN 202110426760A CN 112979727 B CN112979727 B CN 112979727B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
tetracyclic triterpene
cyclocarya paliurus
dammarane type
dammarane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110426760.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112979727A (zh
Inventor
徐康平
吴建平
陆士娟
王钰艳
王文宣
陈祖辉
李桂花
何小爱
曾普华
桂瑞
刘翊芊
欧赛玉
魏希凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Helian Biotechnology Development Co ltd
Hunan Qingya Health Service Co ltd
Central South University
Original Assignee
Hunan Helian Biotechnology Development Co ltd
Hunan Qingya Health Service Co ltd
Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Helian Biotechnology Development Co ltd, Hunan Qingya Health Service Co ltd, Central South University filed Critical Hunan Helian Biotechnology Development Co ltd
Publication of CN112979727A publication Critical patent/CN112979727A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112979727B publication Critical patent/CN112979727B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/06—Benzopyran radicals
    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及青钱柳的提取物，尤其涉及青钱柳二氯甲烷活性部位和达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法以及应用。所述活性部位为青钱柳的二氯甲烷萃取浓缩液，所述活性部位主要成分为达玛烷型四环三萜类化合物，所述达玛烷型四环三萜类化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：

Description

达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及青钱柳的提取物，尤其涉及青钱柳二氯甲烷活性部位和达玛烷型四环三萜化合物(包括3,4-裂环和非裂环两种结构形式)及其提取方法以及应用。
背景技术
青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Bata1)Iljinsk]系胡桃科(Juglaruiaceae)青钱柳属植物，是中国特有的单种属植物，广泛分布于安徽、江苏、浙江等地。20世纪80年代以来，国内外专家学者主要针对青钱柳的资源培育、化学成分、生物活性和产品开发研究等方面进行了大量研究。结果表明，青钱柳具有多种对人体有益的生理活性和药理功能。
三萜类化合物(triterpenoids)是自然界中分布广、结构类型多样的一类重要天然产物，具有降糖降压、抗炎、降血脂、抗肿瘤等多种生物活性。研究发现三萜类化合物具有很好的抗炎活性，在不影响细胞活力的情况下，可以抑制NO产生，且其效果优于一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，此外对LPS诱导的TNF-α和IL-1β有抑制活性。有研究发现三萜皂苷能显著降低动脉血压，降低自发性高血压大鼠血浆中的肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)含量，对肾性高血压及自发性高血压大鼠心肌肥厚具有一定的抑制作用，并且可以逆转自发性高血压大鼠左心室重构的病理状态，其机制分别与调控，AngⅡ/p38MAPK通路诱导的炎症反应和抑制心肌组织炎症因子TGF-β1的表达有关。
青钱柳叶含有多种药用化学成分，包括胡萝卜素、蛋白质、黄酮类、多糖类、三萜类等化合物，其中达玛烷型三萜和异戊烯基黄酮因其结构和药理活性的多样性而受到广泛关注。目前关于这两类成分多集中于降糖和炎症的研究，关于其他方面的活性以及机制研究较少，因此具体阐明达玛烷型三萜和异戊烯基黄酮其他应用活性及作用机制对广泛的临床应用和创新药物研发具有重大意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的是提供青钱柳二氯甲烷活性部位和达玛烷型四环三萜化合物的提取方法及应用，对抗类风湿性关节炎活性成分和药效物质基础进行系统研究。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种达玛烷型四环三萜化合物(包括3,4-裂环和非裂环两种结构形式)，其结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：
Figure BDA0003029814550000021
其中，R1选自氢、C1-C6烷基；R2选自氢、L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖；R3选自
Figure BDA0003029814550000022
Figure BDA0003029814550000023
R4和R5独立的选自L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-呋喃阿拉伯糖；R6选自
Figure BDA0003029814550000024
优选的，所述达玛烷型四环三萜化合物，结构式如下：
Figure BDA0003029814550000025
Figure BDA0003029814550000031
本发明还提供一种从青钱柳提取上述达玛烷型四环三萜化合物的方法，包括以下步骤：
S1、将青钱柳叶用乙醇/水加热回流提取，浓缩得浸膏；
S2、将浸膏用水分散，用二氯甲烷萃取，并将萃取液浓缩，得二氯甲烷萃取浓缩液；
S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行分析及分离纯化。
优选的，S1中，青钱柳叶经过干燥粉碎处理。
优选的，S1中，乙醇的浓度为70％，青钱柳叶质量与乙醇的比值为1:10，加热的温度为120℃，加热的时间为2h，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为2-3天。
优选的，S2中，利用二氯甲烷萃取三次，青钱柳叶质量与每次使用的二氯甲烷体积的比值为1:10，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为24-48小时。
优选的，S3中，二氯甲烷部位经硅胶柱层析CH2Cl2:CH3OH(100:1-0:100)梯度洗脱，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到9个部位(A-I)；
A-I部位TLC薄层分析，10％浓硫酸/乙醇加热显色，其中Fr.I薄层板显示紫红色条带，HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定I部位为三萜类富集部位；
首先对FrI采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，接着采用硅胶柱层析、小孔树脂柱层析和反向ODS柱层析，整个分离过程用UPLC-MS/MS方法对三萜进行追踪，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色及HPLC-DAD对样品进行分析，对达玛烷型四环三萜化合物有效分离；最后采用半制备高效液相对目标化合物进行纯化。
本发明还要求保护一种活性部位，所述活性部位为如上述的二氯甲烷萃取浓缩液。
本发明还要求保护如上述的活性部位在制备抗类风湿性关节炎的药物中的应用。
进一步的，达玛烷型四环三萜化合物的分离纯化过程为：
本发明采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。二氯甲烷部位取400g样品采用硅胶柱层析并以CH2Cl2:CH3OH系统(100:1-0:100)梯度洗脱，得到的流份用10％EtOH-H2SO4显色剂对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，最终浓缩合并得到10个馏分(I-X)。对这10个馏分依次进行TLC薄层分析及HPLC分析，发现IX和X两个部位薄层板显示紫红色条带，而HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定这两个部位为三萜类富集部位，所以在该课题的进行中主要对这两部分进行分离。将IX部位通过聚酰胺柱(乙醇/水,0-95％)洗脱，得到五个组分(A-E)。IXA(33.2g)进一步用硅胶柱色谱纯化(CH2Cl2-MeOH,50:1-0:100),接着用C18反相柱色谱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(20％-100％)得到化合物1(2.3mg)和化合物14(4.5mg)。将IXB,IXC合并,继续用C18反相柱分离,使用MeOH/H2O的梯度系统分离,得到五个馏分(IXBC-1-IXBC-5)。IXBC-2(3.5g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXBC-2-a-IXBC-2-f)。IXBC-2-b通过半制备液相色谱分离得到化合物3(2.0mg),化合物4(3.2mg)；IXBC-2-c通过半制备液相色谱分离得到化合物20(1.8mg),化合物22(1.5mg)。将组分IXD(78.2g)采用硅胶柱层析,用EtOAc-MeOH体系洗脱,得到8个亚组分(IXD-1-IXD-8)。IXD-3(18.4g)通过硅胶柱色谱用CH2Cl2-MeOH体系洗脱进一步纯化,得到四个组分(IXD-3-a-IXD-3-d)。随后，IXD-3-b通过半制备液相色谱分离出化合物18(3.8mg)，IXD-3-c通过半制备液相色谱分离出化合物23(3.8mg)和15(4.8mg)。IXD-4(23.0g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXD-4-a-IXD-4-e)。通过半制备HPLC从IXD-4-c分离化合物13(8.4mg)和26(4.5mg)，从IXD-4-d分离化合物9(5.6mg)和化合物12(3.8mg)。将馏分X(60g)同样通过聚酰胺色谱柱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(0-100％)进行梯度洗脱，根据HPLC分析合并得到5个馏分(Fr.A-Fr.E)。XB(13.2g)进一步采用硅胶柱柱层析(CH2Cl2/MeOH,10:0-0:10)和C18反相柱柱层析(MeOH/H2O,10％-100％)得到化合物19(4.2mg)和化合物24(4.5mg)。XC用C18反相柱,MeOH/H2O体系梯度洗脱,得到五个馏分(XC-1-XC-5)。IXC-2通过半制备液相色谱分离出化合物2(2.8mg),化合物5(3.6mg)。IXC-3(4.5g)通过MCI凝胶柱纯化,用MeOH-H2O系统洗脱(20％-100％),得到四个亚组分(XC-3-a-XC-3-d)。XC-3-c通过半制备HPLC从中分离出化合物6(1.8mg)，化合物21(1.5mg)，XC-3-d通过半制备HPLC从中分离出化合物8(4.8mg)，化合物10(2.5mg)。将馏分XD进一步通过硅胶柱处理,CH2Cl2-MeOH体系洗脱,得到四个馏分(XD-1-XD-4)。随后,通过半制备型液相色谱从XD-3分离出化合物25(4.8mg),化合物7(5.3mg),化合物11(3.6mg),化合物16(3.5mg)和化合物17(5.8mg)。
所述达玛烷型四环三萜化合物1-26为：
Figure BDA0003029814550000051
Figure BDA0003029814550000061
本发明还提供上述达玛烷型四环三萜化合物1-26在制备抗类风湿性关节炎的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明提供了一种全新的从青钱柳中提取达玛烷型四环三萜化合物1-26的方法，该方法简单可重复。
2、本发明为青钱柳二氯甲烷活性部位和达玛烷型四环三萜化合物1-26提供了新的应用，并研究了其药物机理，有望成为新的抗类风湿性关节炎的药物。
附图说明
图1为化合物23的DEPT 135谱图；
图2为化合物24的DEPT 135谱图；
图3为化合物24的HMBC谱图；
图4为化合物5的DEPT 135谱图；
图5为化合物5的HMBC谱图；
图6为化合物5的NOESY谱图；
图7为化合物5的关键的H-H-COSY，HMBC,NOESY相关图；
图8为化合物6的DEPT 135谱图；
图9为化合物7的DEPT 135谱图；
图10为化合物7的NOESY谱图；
图11为化合物25的DEPT 135谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
1.1青钱柳药材处理：青钱柳干燥叶(10Kg)，粉碎后用70％乙醇120℃加热回流提取(100L；2×2h)，60℃浓缩得浸膏，浓缩时间为2天。浸膏进一步用水分散，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每次10L，萃取3次，萃取液60℃浓缩，浓缩时间为24小时，分别得不同极性部位的萃取浓缩液。二氯甲烷部位中主要为达玛烷型四环三萜类化合物(标注为QQL-ST)。
1.2生物活性导向筛选青钱柳活性部位：采用佐剂性关节炎大鼠动物模型对青钱柳活性部位改善类风湿性关节炎的活性部位进行追踪和筛选：
1.3活性部位成分研究
1.3.1三萜提取分离与纯化：运用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、HW-40C凝胶、SephadexLH-20凝胶、ODS及PrepHPLC、PrepTLC等现代色谱分离技术对活性部位进行系统的化学成分研究。根据达玛烷型四环三萜类化合物的特征UV吸收和TLC显色反应，采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法进行追踪、分析及分离纯化。
本实验采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。二氯甲烷部位取400g样品采用硅胶柱层析并以CH2Cl2:CH3OH系统(100:1-0:100)梯度洗脱，得到的流份用10％EtOH-H2SO4显色剂对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，最终浓缩合并得到10个馏分(I-X)。对这10个馏分依次进行TLC薄层分析及HPLC分析，发现IX和X两个部位薄层板显示紫红色条带，而HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定这两个部位为三萜类富集部位，所以在该课题的进行中主要对这两部分进行分离。将IX部位通过聚酰胺柱(乙醇/水,0-95％)洗脱，得到五个组分(A-E)。IXA(33.2g)进一步用硅胶柱色谱纯化(CH2Cl2-MeOH,50:1-0:100),接着用C18反相柱色谱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(20％-100％)得到化合物1(2.3mg)和化合物14(4.5mg)。将IXB,IXC合并,继续用C18反相柱分离,使用MeOH/H2O的梯度系统分离,得到五个馏分(IXBC-1-IXBC-5)。IXBC-2(3.5g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXBC-2-a-IXBC-2-f)。IXBC-2-b通过半制备液相色谱分离得到化合物3(2.0mg),化合物4(3.2mg)；IXBC-2-c通过半制备液相色谱分离得到化合物20(1.8mg),化合物22(1.5mg)。将组分IXD(78.2g)采用硅胶柱层析,用EtOAc-MeOH体系洗脱,得到8个亚组分(IXD-1-IXD-8)。IXD-3(18.4g)通过硅胶柱色谱用CH2Cl2-MeOH体系洗脱进一步纯化,得到四个组分(IXD-3-a-IXD-3-d)。随后，IXD-3-b通过半制备液相色谱分离出化合物18(3.8mg)，IXD-3-c通过半制备液相色谱分离出化合物23(3.8mg)和15(4.8mg)。IXD-4(23.0g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXD-4-a-IXD-4-e)。通过半制备HPLC从IXD-4-c分离化合物13(8.4mg)和26(4.5mg)，从IXD-4-d分离化合物9(5.6mg)和化合物12(3.8mg)。将馏分X(60g)同样通过聚酰胺色谱柱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(0-100％)进行梯度洗脱，根据HPLC分析合并得到5个馏分(Fr.A-Fr.E)。XB(13.2g)进一步采用硅胶柱柱层析(CH2Cl2/MeOH,10:0-0:10)和C18反相柱柱层析(MeOH/H2O,10％-100％)得到化合物19(4.2mg)和化合物24(4.5mg)。XC用C18反相柱,MeOH/H2O体系梯度洗脱,得到五个馏分(XC-1-XC-5)。IXC-2通过半制备液相色谱分离出化合物2(2.8mg),化合物5(3.6mg)。IXC-3(4.5g)通过MCI凝胶柱纯化,用MeOH-H2O系统洗脱(20％-100％),得到四个亚组分(XC-3-a-XC-3-d)。XC-3-c通过半制备HPLC从中分离出化合物6(1.8mg)，化合物21(1.5mg)，XC-3-d通过半制备HPLC从中分离出化合物8(4.8mg)，化合物10(2.5mg)。将馏分XD进一步通过硅胶柱处理,CH2Cl2-MeOH体系洗脱,得到四个馏分(XD-1-XD-4)。随后,通过半制备型液相色谱从XD-3分离出化合物25(4.8mg),化合物7(5.3mg),化合物11(3.6mg),化合物16(3.5mg)和化合物17(5.8mg)。
1.3.3结构确证：运用UV、IR、NMR、MS、CD、ORD、ECD及单晶X-rays等现代光谱技术确证各化合物的平面结构和立体构型，进行谱学表征和光谱数据的系统归属。
首先通过紫外吸收确认化合物的吸收类型以及其是否存在共轭片段。接着采用1D/2D NMR对化合物的平面结构进行确定，并通过质谱对其分子量进行确认。对于化合物的绝对构型采用NOESY，ROESY以及CD、ECD等确认。
1.4化学结构
分离到达玛烷型四环三萜类化合物26个(1-26)，具体见表1。
表1.化合物1-26分子信息
Figure BDA0003029814550000081
Figure BDA0003029814550000091
Figure BDA0003029814550000101
新结构表征结果为：
化合物23：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029814550000102
HPLC-UV(ACN-H2O)λmax：230nm。HRESIMS，m/z：754.5123[M+NH4]+。
化合物24：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029814550000103
HPLC-UV(ACN-H2O)λmax：230nm。HRESIMS，m/z：788.5159[M+NH4]+。
结构式如下所示：
Figure BDA0003029814550000104
表2.化合物23-24的表征数据
Figure BDA0003029814550000105
Figure BDA0003029814550000111
Figure BDA0003029814550000121
Figure BDA0003029814550000131
化合物5：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029814550000132
HPLC-UV(ACN-H2O)λmax:203nm。HRESIMS，m/z:637.3953[M-H]-。
化合物6：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029814550000133
HPLC-UV(CH3CN-H2O)λmax:203nm。HRESIMS，m/z:695.4378[M+CH3COO]-。
结构如下所示：
Figure BDA0003029814550000134
表3.化合物5-6的表征数据
Figure BDA0003029814550000135
Figure BDA0003029814550000141
Figure BDA0003029814550000151
Figure BDA0003029814550000161
化合物7：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029814550000162
HPLC-UV(CH3CN-H2O)λmax:203nm。HRESIMS，675.4082[M+Na]+。
化合物25：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029814550000163
HPLC-UV(ACN-H2O)λmax：230nm。HRESIMS，m/z：799.4904[M+HCOO]-。
结构如下所示：
Figure BDA0003029814550000164
表4.化合物7和25的表征数据
Figure BDA0003029814550000165
Figure BDA0003029814550000171
Figure BDA0003029814550000181
Figure BDA0003029814550000191
表征图谱如图1-11所示。
实施例2
QQL-ST和达玛烷型四环三萜化合物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用
1.生物活性导向筛选活性部位：
佐剂性大鼠模型抗RA作用实验SD大鼠若干只，雄性，体重180～220g，取10只作为正常对照组，其余动物为模型对照组，模型对照组大鼠右后足跖部位皮下注射弗式完全佐剂0.1mL/只，造模7d后，采用足趾容积仪测定足趾肿胀度，根据足趾肿胀度随机分为模型对照组，阳性对照组，QQL-ST组，每6只动物，给药剂量都是150mL/kg。每日给药前将各化合物用0.5％CMC-Na配制成相应浓度混悬液，各组大鼠按10mL/kg灌胃给予相应浓度的混悬液，1次/日，连续21天，模型对照组灌胃给予等体积0.5％CMC-Na，正常对照组灌胃给予等体积蒸馏水。
(1)各组大鼠分别于给药7天、14天及21天后，用足肿胀仪测量足肿胀度，观察并记录全身关节病变程度，同时计算关节炎指数评分(AI)。全身病变按5级评分法评价，根据未注射佐剂的其余3个肢体的病变程度累计积分，计算出多发性关节炎指数。0分：无红肿；1分：趾关节红肿；2分：趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀，各个关节的累计积分即为每只大鼠的AI。
(2)各组大鼠麻醉后，从致炎测踝关节上方0.5cm处剪下肿胀足趾，纵向切开，用5mL生
理盐水充分冲洗肿胀关节内部，并将肿胀足趾放置于冲洗液中浸泡2h，3000rpm离心，取上清液，采用ELISA试剂盒检测上清液中类风湿因子RF、TNF-α、IL-1和PGE2水平。
(3)取肿胀足趾关节，福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，进行关节及滑膜的组
织病理学检查，并进行病理学评分。
(4)用免疫组化ABC法检测滑膜组织中核转录因子COX-2的蛋白表达水平。
统计方法：采用SPSS 25.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为P<0.05。计量资料采用均数±标准差(±s)。用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(One-way ANOVA)和post Hoc LSD进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P<0.05)，则用Dunnett’s Test(非参数方法)进行比较分析。
实验结果：
2.1生物活性导向筛选青钱柳活性部位
如表5，表6，表7，表8所示，QQL-ST可改善佐剂性大鼠足趾容积、关节液细胞因子含量与模型对照组相比有较显著差异(P<0.05或P<0.01)，与阳性对照药物塞来昔布效果相当。
2.1.1对大鼠足趾容积的影响
如表5所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠给药前、给药7天及给药14天后足趾容积均显著增加(P<0.01)，提示模型复制成功。连续给药7天，与模型对照组比较，QQL-ST组大鼠足趾容积均显著降低(P<0.05或P<0.01)，QQL-ST组大鼠足趾肿胀度均显著降低(P<0.05或P<0.01)；连续给药14天，与模型对照组比较，QQL-ST组大鼠足趾肿胀度显著降低(P<0.05或P<0.01)，且效果优于阳性对照组。
表5青钱柳对SD大鼠左后侧足趾容积的影响(
Figure BDA0003029814550000201
n＝6)
Figure BDA0003029814550000202
注：与正常对照组比较++P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01。
2.1.2对大鼠关节液中炎症因子的影响
如表6所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠关节液中PGE2、COX-2水平升高(P<0.05或P<0.01)，提示模型复制成功；与模型对照组比较，阳性对照组、QQL-ST组，PGE2、COX-2水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。
表6青钱柳对SD大鼠关节液中炎症因子的影响(
Figure BDA0003029814550000203
n＝6)
Figure BDA0003029814550000204
Figure BDA0003029814550000211
注：与正常对照组比较++P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01。
2..2候选化合物抗RA活性及初步作用机制研究
2.2.1对LPS诱导RAW.264.7产生PGE2的影响
由表7可见，药物组与模型组比较化合物1、2、6、15、20均能够抑制LPS诱导RAW.264.7细胞分泌PGE2，降低炎性因子的释放，其中以化合物6效果最好。
表7对LPS诱导RAW.264.7细胞产生PGE2的影响
Figure BDA0003029814550000212
Figure BDA0003029814550000213
与模型组对比,#p<0.05,##p<0.01
2.2.2活性化合物对COX-2活性的抑制作用
根据候选化合物抗RA活性研究基础，采用COX-2酶活性抑制剂筛选试剂盒检测化合物1～9，化合物14～16，化合物18，化合物20，化合物26。
对COX-2活性的抑制作用。结果如表8所示，候选化合物均能在一定程度上抑制COX-2，其中化合物2、6、15表现出较好的COX-2活性的抑制作用。
表8对COX-2活性的抑制作用
Figure BDA0003029814550000221
3.小结
本研究从青钱柳的活性部位中分离得到26个达玛烷型四环三萜化合物，并对这一系列化合物进行了抗类风湿性关节炎的活性测定，同时进行初步机制研究，发现化合物1～9，化合物14～16，化合物18，化合物20、QQL-ST均能显著抑制COX-2，其中QQL-ST、化合物2、6、15效果显著，表现出很好的COX-2和PGE2抑制剂活性，由此推测达玛烷型四环三萜对经LPS诱导的RAW.264.7细胞的保护作用可能是通过抑制COX-2蛋白，发挥改善RA作用。这一研究结果表明达玛烷型四环三萜类化合物是青钱柳抗类风湿性关节炎的药效物质基础，为后面深入的分子作用机制研究提供思路与方向。且单体化合物的抑制类风湿性关节炎的效果明显优于现有技术中已经公开的类似的达玛烷型四环三萜类化合物的活性，其性能的优异是未能预期的。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (2)

1.一种活性部位在制备抗类风湿性关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述活性部位为青钱柳的二氯甲烷萃取浓缩液，所述活性部位含有达玛烷型四环三萜类化合物，所述达玛烷型四环三萜化合物的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种达玛烷型四环三萜化合物在制备抗类风湿性关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述达玛烷型四环三萜化合物的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
CN202110426760.9A 2020-04-20 2021-04-20 达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用 Active CN112979727B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010312247 2020-04-20
CN2020103122472 2020-04-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112979727A CN112979727A (zh) 2021-06-18
CN112979727B true CN112979727B (zh) 2022-08-19

Family

ID=76341365

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110424558.2A Active CN113004354B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 达玛烷型四环三萜化合物及其抗痛风应用
CN202210609872.2A Active CN115154476B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 青钱柳的提取物及其抗痛风和降尿酸应用
CN202110424563.3A Active CN113150048B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 青钱柳的提取物及其抗类风湿性关节炎应用
CN202110424554.4A Active CN113004353B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 青钱柳的提取物及其应用
CN202110426760.9A Active CN112979727B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用
CN202110424564.8A Active CN113150049B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 青钱柳的提取物及其抗痛风和降尿酸应用

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110424558.2A Active CN113004354B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 达玛烷型四环三萜化合物及其抗痛风应用
CN202210609872.2A Active CN115154476B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 青钱柳的提取物及其抗痛风和降尿酸应用
CN202110424563.3A Active CN113150048B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 青钱柳的提取物及其抗类风湿性关节炎应用
CN202110424554.4A Active CN113004353B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 青钱柳的提取物及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110424564.8A Active CN113150049B (zh) 2020-04-20 2021-04-20 青钱柳的提取物及其抗痛风和降尿酸应用

Country Status (1)

Country Link
CN (6) CN113004354B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113004354B (zh) * 2020-04-20 2022-08-19 中南大学 达玛烷型四环三萜化合物及其抗痛风应用
CN114349808B (zh) * 2022-03-01 2023-09-29 广西师范大学 一种大萼香茶菜皂苷a和b单体的分离纯化方法及其应用
CN116082146A (zh) * 2022-12-01 2023-05-09 湖南中医药大学 青钱柳提取物及其提取方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011201788A (ja) * 2010-03-24 2011-10-13 Nippon Menaade Keshohin Kk 抗炎症剤
CN108235686A (zh) * 2015-06-24 2018-06-29 阿纳里蒂科探索有限责任公司 新型三萜苷作为甜味剂或甜味增强剂
CN109364119A (zh) * 2018-12-26 2019-02-22 浙江大学 从青钱柳叶中制备具有降血糖作用的总三萜的方法及应用
CN110746474A (zh) * 2019-11-14 2020-02-04 广西师范大学 达玛烷型三萜皂苷类化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用
CN111100175A (zh) * 2020-01-03 2020-05-05 中南大学 一种3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002003996A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-17 RAJKUMAR, Sujatha Use of dammarane-type tritepenoid saporins
US20110144206A1 (en) * 2008-08-22 2011-06-16 Steven Lewitzky Use of a cox-2 inhibitor for the treatment of a cox-2 dependent disorder in a patient not carrying hla alleles associated with hepatotoxicity
CN102212093B (zh) * 2010-04-01 2013-11-06 中国人民解放军第二军医大学 黄酮苷类化合物及其制备方法和用途
CN102382092B (zh) * 2011-07-15 2014-04-23 北京大学 新的异戊烯基黄酮类化合物及其应用
CN102302555A (zh) * 2011-09-21 2012-01-04 中国人民解放军第二军医大学 一种治疗痛风性关节炎的中药提取物及其制备方法和应用
CN102935090A (zh) * 2012-04-28 2013-02-20 上海中医药大学 一种富含三萜类皂苷元的海参提取物的用途
CN104971090A (zh) * 2015-08-03 2015-10-14 中国药科大学 青钱柳有效部位在制备防治非酒精性脂肪肝药物中的应用
CN105232623A (zh) * 2015-11-16 2016-01-13 吴申龙 一种青钱柳提取物在制备胃癌药物中的应用
CN105560262A (zh) * 2016-01-04 2016-05-11 中国科学院昆明植物研究所 Graveobioside A在制备抗高尿酸血症和抗痛风的药物或保健食品中的应用
CN107080010A (zh) * 2017-03-29 2017-08-22 广西凌云县盘古生态产业发展有限公司 一种可降尿酸的青钱柳茶及其制备方法
CN107087697A (zh) * 2017-03-29 2017-08-25 广西凌云县盘古生态产业发展有限公司 一种可降尿酸的助眠型青钱柳茶及其制备方法
CN106977403B (zh) * 2017-03-31 2019-10-01 湖南中医药大学 一种具有抗癌活性的化合物及其制备方法与应用
CN110051726A (zh) * 2019-04-16 2019-07-26 浙江大学 一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法及应用
CN113004354B (zh) * 2020-04-20 2022-08-19 中南大学 达玛烷型四环三萜化合物及其抗痛风应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011201788A (ja) * 2010-03-24 2011-10-13 Nippon Menaade Keshohin Kk 抗炎症剤
CN108235686A (zh) * 2015-06-24 2018-06-29 阿纳里蒂科探索有限责任公司 新型三萜苷作为甜味剂或甜味增强剂
CN109364119A (zh) * 2018-12-26 2019-02-22 浙江大学 从青钱柳叶中制备具有降血糖作用的总三萜的方法及应用
CN110746474A (zh) * 2019-11-14 2020-02-04 广西师范大学 达玛烷型三萜皂苷类化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用
CN111100175A (zh) * 2020-01-03 2020-05-05 中南大学 一种3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"3,4-seco-Dammarane Triterpenoid Saponins with Anti-Inflammatory Activity Isolated from the Leaves of Cyclocarya paliurus";Wei Liu et al.;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;20200122;第68卷;第2041-2053页 *
"Cyclocarioside O-Q, three novel seco-dammarane triterpenoid glycosides from the leaves of Cyclocarya paliurus";Tongyao Xuan et al.;《Natural Product Research》;20190614;第35卷(第1期);第167-173页 *
"Hypoglycemic triterpenoid glycosides from Cyclocarya paliurus (Sweet Tea Tree)";Huihui Sun et al.;《Bioorganic Chemistry》;20191217;第95卷;第1-8页 *
"前列腺素E2合成酶与类风湿关节炎";郭素堂等;《中国药物与临床》;20020831;第2卷(第4期);第225-227页 *
Huihui Sun et al.."Hypoglycemic triterpenoid glycosides from Cyclocarya paliurus (Sweet Tea Tree)".《Bioorganic Chemistry》.2019,第95卷第1-8页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113150048A (zh) 2021-07-23
CN113004353B (zh) 2022-08-19
CN115154476B (zh) 2023-10-27
CN113004353A (zh) 2021-06-22
CN115154476A (zh) 2022-10-11
CN112979727A (zh) 2021-06-18
CN113150048B (zh) 2022-08-19
CN113150049B (zh) 2022-08-19
CN113004354B (zh) 2022-08-19
CN113150049A (zh) 2021-07-23
CN113004354A (zh) 2021-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112979727B (zh) 达玛烷型四环三萜化合物及其提取方法和应用
Yesilada et al. Anti-ulcerogenic activity and isolation of the active principles from Sambucus ebulus L. leaves
WO2017220042A2 (zh) 氨力农的药物组合物及其在高血压治疗中的应用
CN108516965B (zh) 一种5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F及其制备方法
Liu et al. Comparative metabolism of schaftoside in healthy and calcium oxalate kidney stone rats by UHPLC-Q-TOF-MS/MS method
CN101591321B (zh) 5，6，7，4′-四羟基黄酮的制备方法
CN110305235A (zh) 一种甘草均一多糖gup及其制法和用途
Wang et al. New saikosaponins from the roots of Bupleurum chinense
CN114057764B (zh) 具有抗炎活性的乌药烷型二聚倍半萜及其制备方法和用途
CN101717419A (zh) 一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D及其制备方法与用途
CN103191143B (zh) 一种强心苷化合物的用途
CN113214214B (zh) 关苍术中一种萜类化合物的制备方法和应用
CN113827629A (zh) 艾叶在治疗和预防由幽门螺旋杆菌引起的胃部疾病中的应用
CN101375937A (zh) 一种柘木提取物、其制备及应用
CN113679727A (zh) 天然三萜-环烯醚萜苷二聚体杂合物在制备乙酰辅酶a羧化酶1抑制剂中的用途
CN112194704A (zh) 一种甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用
CN101375938A (zh) 一种柘木提取物、其制备及应用
CN113999245B (zh) 具有抗胰腺癌活性的天然化合物及其分离方法及应用
CN113072492B (zh) 一种异喹啉生物碱类化合物、制备方法及用途
CN104398532B (zh) 一种强心苷化合物的用途
Cao et al. Investigation of the effect of rice wine on the metabolites of the main components of herbal medicine in rat urine by ultrahigh-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry: a Case Study on Cornus officinalis
CN105906494A (zh) 西尼地平的药物组合物及其心肌保护的医药用途
CN101704856A (zh) 一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷C及其制备方法与用途
CN108530505A (zh) 一种黄酮苷类化合物及其制备方法和应用
CN101693731A (zh) 从结石草中提取纯化车前醚苷的方法及其产品和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant