CN113004353A - 青钱柳的提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及青钱柳的提取物，尤其涉及1号活性部位和2号活性部位及其提取方法以及应用。所述1号活性部位为青钱柳的二氯甲烷萃取浓缩液，该1号活性部位主要成分为达玛烷型四环三萜化合物。本发明还提供了1号活性部位、2号活性部位、达玛烷型四环三萜化合物和异戊烯基黄酮类化合物的提取方法，以及它们对改善记忆力活性成分和药效物质基础、降脂活性成分和药效物质基础、增强免疫力活性成分和药效物质基础进行系统研究。实验表明，1号活性部位、2号活性部位能有效改善记忆力、降脂、增强免疫力。达玛烷型四环三萜化合物和异戊烯基黄酮类化合物作为它们的活性组分，其作用也明显。

Description

青钱柳的提取物及其应用
技术领域
本发明涉及青钱柳的提取物，尤其涉及1号活性部位和2号活性部位及其提取方法以及应用。
背景技术
青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Bata1)Iljinsk]系胡桃科(Juglaruiaceae)青钱柳属植物，是中国特有的单种属植物，广泛分布于安徽、江苏、浙江等地。20世纪80年代以来，国内外专家学者主要针对青钱柳的资源培育、化学成分、生物活性和产品开发研究等方面进行了大量研究。结果表明，青钱柳具有多种对人体有益的生理活性和药理功能。
三萜类化合物(triterpenoids)是自然界中分布广、结构类型多样的一类重要天然产物，具有降糖降压、抗炎、降血脂、抗肿瘤等多种生物活性。研究发现三萜类化合物具有很好的抗炎活性，在不影响细胞活力的情况下，可以抑制NO产生，且其效果优于一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，此外对LPS诱导的TNF-α和IL-1β有抑制活性。有研究发现三萜皂苷能显著降低动脉血压，降低自发性高血压大鼠血浆中的肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)含量，对肾性高血压及自发性高血压大鼠心肌肥厚具有一定的抑制作用，并且可以逆转自发性高血压大鼠左心室重构的病理状态，其机制分别与调控，AngⅡ/p38MAPK通路诱导的炎症反应和抑制心肌组织炎症因子TGF-β1的表达有关。
青钱柳叶含有多种药用化学成分，包括胡萝卜素、蛋白质、黄酮类、多糖类、三萜类等化合物，其中达玛烷型三萜和异戊烯基黄酮因其结构和药理活性的多样性而受到广泛关注。目前关于这两类成分多集中于降糖和炎症的研究，关于其他方面的活性以及机制研究较少，因此具体阐明达玛烷型三萜和异戊烯基黄酮其他应用活性及作用机制对广泛的临床应用和创新药物研发具有重大意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的是提供1号活性部位、2号活性部位、达玛烷型四环三萜化合物和异戊烯基黄酮类化合物的提取方法及应用，对改善记忆力活性成分和药效物质基础、降脂活性成分和药效物质基础、增强免疫力活性成分和药效物质基础进行系统研究。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种达玛烷型四环三萜化合物，其结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：
Figure BDA0003029322140000011
其中，R1选自氢、C1-C6烷基；R2选自氢、L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖；R3选自
Figure BDA0003029322140000021
Figure BDA0003029322140000022
R4和R5独立的选自L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-呋喃阿拉伯糖；R6选自
Figure BDA0003029322140000023
优选的，所述达玛烷型四环三萜化合物，结构式如下：
Figure BDA0003029322140000024
Figure BDA0003029322140000031
一种异戊烯基黄酮类化合物，结构通式如下：
Figure BDA0003029322140000032
其中，R7选自L-鼠李糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-木糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(4→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-脱氧呋喃糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-鸡纳糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(3→1)-L-鼠李糖、L-鼠李糖；
R8选自氢、D-葡萄糖、L-鼠李糖-(2→1)-D-葡萄糖、D-木糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(4→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-脱氧呋喃糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-鸡纳糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(3→1)-L-鼠李糖、L-鼠李糖；
R9选自羟基，甲氧基、乙氧基、丙氧基；
R10选自
Figure BDA0003029322140000033
优选的，所述异戊烯基黄酮类化合物化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003029322140000041
本发明还提供一种从青钱柳提取上述达玛烷型四环三萜化合物及异戊烯基黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
S1、将青钱柳叶用乙醇/水加热回流提取，浓缩得浸膏；
S2、将浸膏用水分散，用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并将萃取液浓缩，得二氯甲烷萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液、正丁醇萃取浓缩液；
S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液和正丁醇萃取浓缩液进行分析及分离纯化。
优选的，S1中，青钱柳叶经过干燥粉碎处理。
优选的，S1中，乙醇的浓度为70％，青钱柳叶质量与乙醇的比值为1:10，加热的温度为120℃，加热的时间为2h，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为2-3天。
优选的，S2中，利用二氯甲烷萃取三次，青钱柳叶质量与每次使用的二氯甲烷体积的比值为1:10，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为24-48小时。
优选的，S2中，利用正丁醇萃取三次，青钱柳叶质量与每次使用的正丁醇体积的比值为1:10，浓缩的温度为65℃，浓缩的时间为72-96小时。
优选的，S3中，二氯甲烷部位经硅胶柱层析CH2Cl2:CH3OH(100:1-0:100)梯度洗脱，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到9个部位(A-I)；
A-I部位TLC薄层分析，10％浓硫酸/乙醇加热显色，其中Fr.I薄层板显示紫红色条带，HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定I部位为三萜类富集部位；
首先对FrI采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，接着采用硅胶柱层析、小孔树脂柱层析和反向ODS柱层析，整个分离过程用UPLC-MS/MS方法对三萜进行追踪，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色及HPLC-DAD对样品进行分析，对达玛烷型四环三萜化合物有效分离；最后采用半制备高效液相对目标化合物进行纯化。
优选的，S3中，正丁醇萃取部位经大孔树脂EtOH:H2O(0:100-0:95)梯度洗脱，HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到5个部位(a-e)；
a-e部位TLC薄层分析，10％浓硫酸/乙醇加热显色，其中Fr.C薄层板显示黄色条带。
首先对Fr.C采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，HPLC-DAD分析合并，得到6个部位Fr.C1-C6，Fr.C1主要为黄酮类吸收，初步确定Fr.C1部位为黄酮类富集部位；接着采用HW-40C和反向ODS柱层析，整个分离过程用UPLC-MS/MS方法对异戊烯基黄酮进行追踪，通过紫外特征吸收峰对异戊烯基黄酮类化合物有效分离；最后采用半制备高效液相对目标化合物进行纯化。
本发明还提供了一种1号活性部位，所述1号活性部位为青钱柳的二氯甲烷萃取浓缩液，该1号活性部位主要成分为上述达玛烷型四环三萜化合物。
本发明还提供了1号活性部位在在制备改善记忆力的药物中的应用。
本发明还提供上述1号活性部位在制备降脂的药物中的应用。
本发明还提供上述1号活性部位在制备增强免疫力的药物中的应用。
本发明还提供了一种2号活性部位，所述2号活性部位为青钱柳的正丁醇萃取浓缩液，该2号活性部位主要成分为异戊烯基黄酮类化合物。
本发明还提供了上述2号活性部位在在制备改善记忆力的药物中的应用。
本发明还提供上述2号活性部位在制备降脂的药物中的应用。
本发明还提供上述2号活性部位在制备增强免疫力的药物中的应用。
进一步的，达玛烷型四环三萜化合物的分离纯化过程为：
本发明采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。二氯甲烷部位取400g样品采用硅胶柱层析并以CH2Cl2:CH3OH系统(100:1-0:100)梯度洗脱，得到的流份用10％EtOH-H2SO4显色剂对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，最终浓缩合并得到10个馏分(I-X)。对这10个馏分依次进行TLC薄层分析及HPLC分析，发现IX和X两个部位薄层板显示紫红色条带，而HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定这两个部位为三萜类富集部位，所以在该课题的进行中主要对这两部分进行分离。将IX部位通过聚酰胺柱(乙醇/水,0-95％)洗脱，得到五个组分(A-E)。IXA(33.2g)进一步用硅胶柱色谱纯化(CH2Cl2-MeOH,50:1-0:100),接着用C18反相柱色谱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(20％-100％)得到化合物1(2.3mg)和化合物14(4.5mg)。将IXB,IXC合并,继续用C18反相柱分离,使用MeOH/H2O的梯度系统分离,得到五个馏分(IXBC-1-IXBC-5)。IXBC-2(3.5g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXBC-2-a-IXBC-2-f)。IXBC-2-b通过半制备液相色谱分离得到化合物3(2.0mg),化合物4(3.2mg)；IXBC-2-c通过半制备液相色谱分离得到化合物20(1.8mg),化合物22(1.5mg)。将组分IXD(78.2g)采用硅胶柱层析,用EtOAc-MeOH体系洗脱,得到8个亚组分(IXD-1-IXD-8)。IXD-3(18.4g)通过硅胶柱色谱用CH2Cl2-MeOH体系洗脱进一步纯化,得到四个组分(IXD-3-a-IXD-3-d)。随后，IXD-3-b通过半制备液相色谱分离出化合物18(3.8mg)，IXD-3-c通过半制备液相色谱分离出化合物23(3.8mg)和15(4.8mg)。IXD-4(23.0g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXD-4-a-IXD-4-e)。通过半制备HPLC从IXD-4-c分离化合物13(8.4mg)和26(4.5mg)，从IXD-4-d分离化合物9(5.6mg)和化合物12(3.8mg)。将馏分X(60g)同样通过聚酰胺色谱柱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(0-100％)进行梯度洗脱，根据HPLC分析合并得到5个馏分(Fr.A-Fr.E)。XB(13.2g)进一步采用硅胶柱柱层析(CH2Cl2/MeOH,10:0-0:10)和C18反相柱柱层析(MeOH/H2O,10％-100％)得到化合物19(4.2mg)和化合物24(4.5mg)。XC用C18反相柱,MeOH/H2O体系梯度洗脱,得到五个馏分(XC-1-XC-5)。IXC-2通过半制备液相色谱分离出化合物2(2.8mg),化合物5(3.6mg)。IXC-3(4.5g)通过MCI凝胶柱纯化,用MeOH-H2O系统洗脱(20％-100％),得到四个亚组分(XC-3-a-XC-3-d)。XC-3-c通过半制备HPLC从中分离出化合物6(1.8mg)，化合物21(1.5mg)，XC-3-d通过半制备HPLC从中分离出化合物8(4.8mg)，化合物10(2.5mg)。将馏分XD进一步通过硅胶柱处理,CH2Cl2-MeOH体系洗脱,得到四个馏分(XD-1-XD-4)。随后,通过半制备型液相色谱从XD-3分离出化合物25(4.8mg),化合物7(5.3mg),化合物11(3.6mg),化合物16(3.5mg)和化合物17(5.8mg)。
所述达玛烷型四环三萜化合物1-26为：
Figure BDA0003029322140000071
Figure BDA0003029322140000081
进一步的，所述异戊烯基黄酮分离纯化具体过程为：
本发明采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对正丁醇萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。正丁醇部位445g经大孔树脂层析柱，采用乙醇-水系统(0:100,30:70,50:50,70:30,95:5)等度洗脱，综合HPLC-DAD分析结果，将青钱柳正丁醇部位初步划分位五个部位(Fr.a-e)。Fr.b(106g)经聚酰胺层析柱，采用乙醇-水系统(0:100-95:5)洗脱，根据HPLC-DAD分析结果分为六个部分(Fr.b1-b6)。
Fr.c(107g)经聚酰胺层析柱，采用乙醇-水系统(0:100-95:5)洗脱，根据HPLC-DAD分析结果分为六个部分(Fr.c1-c6)，Fr.c1(22.9g)经HW-40C柱层析采用甲醇-水系统(0:100-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，合并相同馏分后得到Fr.c1.1-Fr.c1.12。Fr.c1.2经ODS-AA中压柱，采用甲醇-水系统(5:95-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，得到Fr.c1.2.1-Fr.c1.2.45。Fr.c1.2.23-Fr.c1.2.25经半制备液相(ACN-H2O 21％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物28(8.6mg),29(5.9mg)and 30(7.4mg)。Fr.c1.2.29-Fr.c1.2.30经半制备液相(ACN-H2O 24％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物27(13.6mg),35(11.7mg)and 40(15.7mg).Fr.c1.2.35-Fr.c1.2.36经半制备液相(ACN-H2O 31％,v/v,220nm,3mL/min)分离得到32(13.6mg)and 33(6.4mg)。Fr.c1.3经ODS-AA中压柱，采用甲醇-水系统(5:95-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，得到Fr.c1.3.1-Fr.c1.3.28。Fr.c1.3.13经半制备液相(ACN-H2O 18％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物36(10.8mg),37(4.9mg)。Fr.c1.3.15经半制备液相(ACN-H2O 22％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物38(7.4mg),39(11.3mg)。Fr.c1.8经半制备液相(ACN-H2O 29％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物43(750.6mg),44(107.5mg),45(59.3mg)。
Fr.c2(20.5g)经HW-40C柱层析采用甲醇-水系统(0:100-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，合并相同馏分后得到Fr.c2.1-Fr.c2.10。Fr.c2.4经ODS-AA中压柱，采用甲醇-水系统(5:95-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，得到Fr.c2.4.1-Fr.c2.4.40。Fr.c2.4.18经半制备液相(ACN-H2O 20％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物53(33.7mg)；Fr.c2.4.24-Fr.c2.4.25经半制备液相(ACN-H2O 22％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物34和化合物51的混合物，混合物经薄层制备层析(展开剂：水饱和正丁醇)分离得到化合物34(7.6mg),化合物51(28.5mg)；Fr.c2.4.26经半制备液相(ACN-H2O 25％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物50(26.4mg),化合物51(76.2mg)；Fr.c2.4.28经半制备液相(ACN-H2O25％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物49(13.1mg)。Fr.c2.6经ODS-AA中压柱，采用甲醇-水系统(15:85-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，合并相同馏分后得到Fr.c2.6.1-Fr.c2.6.35。Fr.c2.6.16经半制备液相(ACN-H2O 28％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物31(10.6mg)；Fr.c2.6.20经半制备液相(ACN-H2O 27％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物46(33.7mg),47(21.9mg),48(9.4mg)；Fr.c2.6.22经半制备液相(ACN-H2O 32％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物41(104.2mg)；Fr.c2.6.25经半制备液相(ACN-H2O39％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物52(7.5mg)；Fr.c2.6.28经半制备液相(ACN-H2O44％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物42(7.5mg)。
所述化合物27-53的结构式为：
Figure BDA0003029322140000101
Figure BDA0003029322140000111
本发明还提供上述达玛烷型四环三萜化合物1-26和异戊烯基黄酮类化合物27-53在制备改善记忆力的药物中的应用。
本发明还提供上述达玛烷型四环三萜化合物1-26和异戊烯基黄酮类化合物27-53在制备降脂的药物中的应用。
本发明还提供上述达玛烷型四环三萜化合物1-26和异戊烯基黄酮类化合物27-53在制备增强免疫力的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明提供了一种全新的从青钱柳中提取达玛烷型四环三萜化合物1-26的方法，该方法简单可重复。
2、本发明为达玛烷型四环三萜化合物1-26提供了多种应用，并研究了其药物机理，为达玛烷型四环三萜化合物1-26提供了多种应用思路。
附图说明
图1为QQL-HT和QQL-ST对大鼠的运动轨迹的影响。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
1.1青钱柳药材处理：青钱柳干燥叶(10Kg)，粉碎后用70％乙醇120℃加热回流提取(100L；2×2h)，60℃浓缩得浸膏，浓缩时间为2天。浸膏进一步用水分散，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每次10L，萃取3次，萃取液60℃浓缩，浓缩时间为24小时，分别得不同极性部位的萃取浓缩液。二氯甲烷部位中主要为达玛烷型四环三萜类化合物，也就是1号活性部位(也称为二氯甲烷活性部位)，标注为QQL-ST，正丁醇部位中主要为黄酮类化合物，也就是2号活性部位(也称为正丁醇活性部位)，标注为QQL-HT。
1.2生物活性导向筛选青钱柳活性部位：采用模型对青钱柳活性部位改善记忆力、降脂、增强免疫力的活性部位进行追踪和筛选：
1.3活性部位成分研究
1.3.1三萜提取分离与纯化：运用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、HW-40C凝胶、SephadexLH-20凝胶、ODS及PrepHPLC、PrepTLC等现代色谱分离技术对活性部位进行系统的化学成分研究。根据达玛烷型四环三萜类化合物的特征UV吸收和TLC显色反应，采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法进行追踪、分析及分离纯化。
本实验采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。二氯甲烷部位取400g样品采用硅胶柱层析并以CH2Cl2:CH3OH系统(100:1-0:100)梯度洗脱，得到的流份用10％EtOH-H2SO4显色剂对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，最终浓缩合并得到10个馏分(I-X)。对这10个馏分依次进行TLC薄层分析及HPLC分析，发现IX和X两个部位薄层板显示紫红色条带，而HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定这两个部位为三萜类富集部位，所以在该课题的进行中主要对这两部分进行分离。将IX部位通过聚酰胺柱(乙醇/水,0-95％)洗脱，得到五个组分(A-E)。IXA(33.2g)进一步用硅胶柱色谱纯化(CH2Cl2-MeOH,50:1-0:100),接着用C18反相柱色谱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(20％-100％)得到化合物1(2.3mg)和化合物14(4.5mg)。将IXB,IXC合并,继续用C18反相柱分离,使用MeOH/H2O的梯度系统分离,得到五个馏分(IXBC-1-IXBC-5)。IXBC-2(3.5g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXBC-2-a-IXBC-2-f)。IXBC-2-b通过半制备液相色谱分离得到化合物3(2.0mg),化合物4(3.2mg)；IXBC-2-c通过半制备液相色谱分离得到化合物20(1.8mg),化合物22(1.5mg)。将组分IXD(78.2g)采用硅胶柱层析,用EtOAc-MeOH体系洗脱,得到8个亚组分(IXD-1-IXD-8)。IXD-3(18.4g)通过硅胶柱色谱用CH2Cl2-MeOH体系洗脱进一步纯化,得到四个组分(IXD-3-a-IXD-3-d)。随后，IXD-3-b通过半制备液相色谱分离出化合物18(3.8mg)，IXD-3-c通过半制备液相色谱分离出化合物23(3.8mg)和15(4.8mg)。IXD-4(23.0g)通过MCI小孔树脂柱层析,甲醇-水体系(20％-100％)洗脱,得到六个亚组分(IXD-4-a-IXD-4-e)。通过半制备HPLC从IXD-4-c分离化合物13(8.4mg)和26(4.5mg)，从IXD-4-d分离化合物9(5.6mg)和化合物12(3.8mg)。将馏分X(60g)同样通过聚酰胺色谱柱柱层析,甲醇-水体系梯度洗脱(0-100％)进行梯度洗脱，根据HPLC分析合并得到5个馏分(Fr.A-Fr.E)。XB(13.2g)进一步采用硅胶柱柱层析(CH2Cl2/MeOH,10:0-0:10)和C18反相柱柱层析(MeOH/H2O,10％-100％)得到化合物19(4.2mg)和化合物24(4.5mg)。XC用C18反相柱,MeOH/H2O体系梯度洗脱,得到五个馏分(XC-1-XC-5)。IXC-2通过半制备液相色谱分离出化合物2(2.8mg),化合物5(3.6mg)。IXC-3(4.5g)通过MCI凝胶柱纯化,用MeOH-H2O系统洗脱(20％-100％),得到四个亚组分(XC-3-a-XC-3-d)。XC-3-c通过半制备HPLC从中分离出化合物6(1.8mg)，化合物21(1.5mg)，XC-3-d通过半制备HPLC从中分离出化合物8(4.8mg)，化合物10(2.5mg)。将馏分XD进一步通过硅胶柱处理,CH2Cl2-MeOH体系洗脱,得到四个馏分(XD-1-XD-4)。随后,通过半制备型液相色谱从XD-3分离出化合物25(4.8mg),化合物7(5.3mg),化合物11(3.6mg),化合物16(3.5mg)和化合物17(5.8mg)。
1.3.2异戊烯基黄酮提取分离与纯化：本实验采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对正丁醇萃取浓缩液进行追踪、分析及分离纯化。正丁醇部位445g经大孔树脂层析柱，采用乙醇-水系统(0:100,30:70,50:50,70:30,95:5)等度洗脱，综合HPLC-DAD分析结果，将青钱柳正丁醇部位初步划分位五个部位(Fr.A-E)。Fr.B(106g)经聚酰胺层析柱，采用乙醇-水系统(0:100-95:5)洗脱，根据HPLC-DAD分析结果分为六个部分(Fr.B1-B6)。
Fr.c(107g)经聚酰胺层析柱，采用乙醇-水系统(0:100-95:5)洗脱，根据HPLC-DAD分析结果分为六个部分(Fr.c1-c6)，Fr.c1(22.9g)经HW-40C柱层析采用甲醇-水系统(0:100-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，合并相同馏分后得到Fr.c1.1-Fr.c1.12。Fr.c1.2经ODS-AA中压柱，采用甲醇-水系统(5:95-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，得到Fr.c1.2.1-Fr.c1.2.45。Fr.c1.2.23-Fr.c1.2.25经半制备液相(ACN-H2O 21％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物28(8.6mg),29(5.9mg)and 30(7.4mg)。Fr.c1.2.29-Fr.c1.2.30经半制备液相(ACN-H2O 24％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物27(13.6mg),35(11.7mg)and 40(15.7mg).Fr.c1.2.35-Fr.c1.2.36经半制备液相(ACN-H2O 31％,v/v,220nm,3mL/min)分离得到32(13.6mg)and 33(6.4mg)。Fr.c1.3经ODS-AA中压柱，采用甲醇-水系统(5:95-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，得到Fr.c1.3.1-Fr.c1.3.28。Fr.c1.3.13经半制备液相(ACN-H2O 18％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物36(10.8mg),37(4.9mg)。Fr.c1.3.15经半制备液相(ACN-H2O 22％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物38(7.4mg),39(11.3mg)。Fr.c1.8经半制备液相(ACN-H2O 29％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物43(750.6mg),44(107.5mg),45(59.3mg)。
Fr.c2(20.5g)经HW-40C柱层析采用甲醇-水系统(0:100-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，合并相同馏分后得到Fr.c2.1-Fr.c2.10。Fr.c2.4经ODS-AA中压柱，采用甲醇-水系统(5:95-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，得到Fr.c2.4.1-Fr.c2.4.40。Fr.c2.4.18经半制备液相(ACN-H2O 20％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物53(33.7mg)；Fr.c2.4.24-Fr.c2.4.25经半制备液相(ACN-H2O 22％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物34和化合物51的混合物，混合物经薄层制备层析(展开剂：水饱和正丁醇)分离得到化合物34(7.6mg),化合物51(28.5mg)；Fr.c2.4.26经半制备液相(ACN-H2O 25％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物50(26.4mg),化合物51(76.2mg)；Fr.c2.4.28经半制备液相(ACN-H2O25％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物49(13.1mg)。Fr.c2.6经ODS-AA中压柱，采用甲醇-水系统(15:85-75:5)洗脱，经HPLC-DAD分析，合并相同馏分后得到Fr.c2.6.1-Fr.c2.6.35。Fr.c2.6.16经半制备液相(ACN-H2O 28％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物31(10.6mg)；Fr.c2.6.20经半制备液相(ACN-H2O 27％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物46(33.7mg),47(21.9mg),48(9.4mg)；Fr.c2.6.22经半制备液相(ACN-H2O 32％,0.1％CH3COOH,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物41(104.2mg)；Fr.c2.6.25经半制备液相(ACN-H2O39％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物52(7.5mg)；Fr.c2.6.28经半制备液相(ACN-H2O44％,v/v,220nm,3mL/min)得到化合物42(7.5mg)。
1.3.3结构确证：运用UV、IR、NMR、MS、CD、ORD、ECD及单晶X-rays等现代光谱技术确证各化合物的平面结构和立体构型，进行谱学表征和光谱数据的系统归属。
首先通过紫外吸收确认化合物的吸收类型以及其是否存在共轭片段。接着采用1D/2D NMR对化合物的平面结构进行确定，并通过质谱对其分子量进行确认。对于化合物的绝对构型采用NOESY，ROESY以及CD、ECD等确认。
1.4化学结构
分离到达玛烷型三萜26个(1-26)，异戊烯基黄酮27个(27-53)，具体见表1。
表1.化合物1-26分子信息
Figure BDA0003029322140000141
Figure BDA0003029322140000151
Figure BDA0003029322140000161
新结构表征结果为：
化合物23：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029322140000162
HPLC-UV(ACN-H2O)λmax：230nm。HRESIMS，m/z：754.5123[M+NH4]+。
化合物24：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029322140000163
HPLC-UV(ACN-H2O)λmax：230nm。HRESIMS，m/z：788.5159[M+NH4]+。
表2.化合物23-24的表征数据
Figure BDA0003029322140000164
Figure BDA0003029322140000171
Figure BDA0003029322140000181
化合物5：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029322140000182
HPLC-UV(ACN-H2O)λmax:203nm。HRESIMS，m/z:637.3953[M-H]-。
化合物6：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029322140000183
HPLC-UV(CH3CN-H2O)λmax:203nm。HRESIMS，m/z:695.4378[M+CH3COO]-。
结构如下所示：
表3.化合物5-6的表征数据
Figure BDA0003029322140000184
Figure BDA0003029322140000191
Figure BDA0003029322140000201
化合物7：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029322140000203
HPLC-UV(CH3CN-H2O)λmax:203nm。HRESIMS，675.4082[M+Na]+。
化合物25：白色无定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水；
Figure BDA0003029322140000204
HPLC-UV(ACN-H2O)λmax：230nm。HRESIMS，m/z：799.4904[M+HCOO]-。
表4.化合物7和25的表征数据
Figure BDA0003029322140000202
Figure BDA0003029322140000211
Figure BDA0003029322140000221
化合物27：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000222
UV(MeOH)λmax(logε)nm:204(3.88),270(1.42),320(0.77),and 349(0.71)nm。HRESIMS,m/z：841.3125[M+H]+(calculated for 841.3130)。
化合物28：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000223
UV(MeOH)λmax(logε)nm:204(3.87),270(1.39),320(0.76)and 349(0.70)nm。HRESIMS,m/z 827.2974[M+H]+(calculated for 827.2974)。
化合物29：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000224
UV(MeOH)λmax(logε)nm:204(4.00),271(1.66),316(0.91),and 350(0.83)nm。HRESIMS,m/z 857.3074[M+H]+(calculated for 857.3079)。
化合物30：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000225
UV(MeOH)λmax(logε)nm:204(4.15),271(2.44),316(1.37),and 350(1.12)nm。HRESIMS,m/z 857.3074[M+H]+(calculated for 857.3079)。
化合物31：黄色无定型粉末，
Figure BDA0003029322140000231
UV(MeOH)λmax(logε)nm:204(3.95),270(1.52),320(0.83),and 349(0.76)nm。HRESIMS,m/z:807.2701[M+H]+(calculated for 807.2712)。
化合物32：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000232
UV(MeOH)λmax(logε)nm:204(4.10),271(2.30),316(1.29),and 350(1.05)nm。HRESIMS,m/z:823.3011[M+H]+(calculated for 823.3025)。
化合物33：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000233
UV(MeOH)λmax(logε)nm:204(3.95),270(1.52),321(0.65),and 349(0.76)nm。HRESIMS,m/z:955.3442[M+H]+(calculated for 955.3447)。
化合物34：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000234
UV(MeOH)λmax(logε)nm:203(3.86),270(1.20),321(0.65),and 349(0.60)nm。HRESIMS,m/z:825.2827[M+H]+(calculated for 825.2817)。
化合物35：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000235
UV(MeOH)λmax(logε)nm:204(4.10),271(2.30),316(1.29),and 350(1.05)nm。HRESIMS,m/z:711.2500[M+H]+(calculated for 711.2500)。
化合物36：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000236
UV(MeOH)λmax(logε)nm:200(3.70),271(1.05),316(0.59),and 350(0.48)nm。HRESIMS,m/z:711.2505[M+H]+(calculated for 711.2500)。
化合物37：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000237
UV(MeOH)λmax(logε)nm:199(3.75),271(1.13),316(0.63),and 350(0.52)nm。HRESIMS,m/z 857.3083[M+H]+(calcd for C39H53O21,857.3079)。
化合物38：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000238
UV(MeOH)λmax(logε)nm:199(3.75),271(1.13),316(0.63),and 350(0.52)nm。HRESIMS,m/z:825.2822[M+H]+(calcd for C38H49O20,825.2817)。
化合物39：黄色无定型粉末；
Figure BDA0003029322140000241
UV(MeOH)λmax(logε)nm:199(3.75),271(1.13),316(0.63),and 350(0.52)nm。HRESIMS,m/z:839.2982[M+H]+(calcd for 839.2974)。
表5化合物27-29的1H NMR和13C NMR信号归属
Figure BDA0003029322140000242
Figure BDA0003029322140000251
a Measured in DMSO-d6 at 400MHz；b Measured in DMSO-d6 at 500MHz；Overlapped signals indicated by(o)
表6化合物34-34的1H NMR和13C NMR信号归属
Figure BDA0003029322140000252
Figure BDA0003029322140000261
Figure BDA0003029322140000271
a Measured in DMSO-d6 at 400MHz；b Measured in DMSO-d6 at 500MHz；Overlapped signals indicated by(o)
表7化合物35-37的1H NMR和13C NMR信号归属
Figure BDA0003029322140000272
Figure BDA0003029322140000281
aMeasured in DMSO-d6 at 400MHz；Overlapped signals indicated by(o).
表8化合物38-39的1H NMR和13C NMR信号归属
Figure BDA0003029322140000282
Figure BDA0003029322140000291
Figure BDA0003029322140000301
a Measured in DMSO-d6 at 400MHz；b Measured in DMSO-d6 at 500MHz；Overlapped signals indicated by(o)
实施例2
2.1青钱柳二氯甲烷活性部位和正丁醇活性部位的增强免疫力活性评价
2.1.1实验分组
实验动物128只，体重18～22克，小鼠经适应性喂养一周后，随机分成4组，每组32只。第1组进行脏器/体重值测定，血清溶血素测定和抗体生成细胞数测定；第2组进行迟发型变态反应实验；第3-4组，分别进行碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。实验设150mg/kg QQL-HT，QQL-ST组和1个空白对照组,每组8只动物。实验前将受试物用蒸馏水配成10mg/mL浓度的混悬液，按0.2mL/10g BW的体积给予相应剂量组动物灌胃,空白对照组给予等体积的蒸馏水，每天灌胃1次，连续灌胃30～35天，进行各项免疫指标的测定。
3.2.2生化指标的测定
3.2.2.1脏器/体重比值测定
脏器/体重比值测定试验结束处死小鼠,取出胸腺和脾脏,称重后计算脏/体比值。脏器体重比值(％)＝脏器重(g)/终体重(g)×100。
用青钱柳总黄酮和青钱柳总三萜连续灌胃小鼠30d后，结果见表9，空白对照组与QQL-HT、QQL-ST组小鼠的脾脏/体重比值分别为0.28±0.13，0.26±0.10，0.34±0.22，与空白对照组相比，小鼠脾脏/体重比值差异有统计学意义(P＞0.05)。空白对照组与QQL-HT、QQL-ST组的胸腺/体重比值分别0.14±0.02、0.21±0.05、0.24±0.07，QQL-HT、QQL-ST组与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。
表9对小鼠的脏器/体重比值影响(x±s)
Figure BDA0003029322140000302
与空白对照组比较，*P＜0.05
2.2.2.2ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)
无菌取脾，分离单个脾细胞，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为3×106个/mL。按MTT法用酶标仪,以570nm波长测定光密度(OD值)。用加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值表示淋巴细胞的增殖能力。
青钱柳活性部位对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响:空白对照组、QQL-HT与QQL-ST组的OD差值分别为0.252±0.086、0.341±0.099、0.400±0.058，QQL-ST组和QQL-HT组的OD差值与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，见表10。
表10青钱柳活性部位对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响(x±s)
Figure BDA0003029322140000311
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
2.2.2.3二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应(DTH)(耳肿胀法)
实验结束前5天将小鼠腹部皮肤脱毛后，用DNFB溶液均匀涂抹致敏，5天后将DNFB均匀涂抹于小鼠右耳两面，24h后处死小鼠,取8mm直径的耳片称重,左右耳重量之差表示DTH的程度。
由表11可知，空白组小鼠的耳廓肿胀度为(7.45±1.81)mg，空白对照组、QQL-HT与QQL-ST组的小鼠耳廓肿胀度分别为(7.5±1.81)mg、(11.17±2.88)mg和(14.04±3.28)mg，QQL-HT与QQL-ST组能明显提高小鼠的耳廓肿胀度(P＜0.05)，说明其能增强小鼠的迟发型变态反应。
表11青钱柳活性部位对小鼠耳廓肿胀度的影响(x±s)
Figure BDA0003029322140000312
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
2.2.2.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
实验结束前5天,每只小鼠腹腔注射0.2mL 2％绵羊红细胞(SRBC)悬液进行免疫。5天后处死小鼠，无菌取脾，制成脾细胞悬液，按Jerne改良玻片法进行抗体生成细胞测定，用空斑数/106脾细胞表示抗体生成细胞数。
由表12可知，QQL-HT和QQL-ST能增强小鼠抗体生成细胞数量，与空白对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)；因此，可判定QQL-HT和QQL-ST的体液免疫功能测定结果为阳性。
表12对小鼠抗体生成细胞的影响
Figure BDA0003029322140000313
注：各实验组与空白对照组比较，*表示P＜0.05
2.2.2.5血清溶血素的测定(凝集法)
实验结束前5天，每只小鼠腹腔注射0.2mL 2％SRBC悬液,免疫5天后，摘除小鼠的眼球取血，分离血清。用生理盐水倍比稀释，分别置于微量血凝板内,37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度，利用血球凝集程度检测溶血素(SRBC抗体)水平。血球凝集程度分0～Ⅳ级).计算抗体积数。
由表13可知，QQL-HT和QQL-ST能增强小鼠血清溶血素水平，与空白对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)；因此，可判定QQL-HT和QQL-ST的体液免疫功能测定结果为阳性。
表13对小鼠溶血素水平的影响
Figure BDA0003029322140000321
注：各实验组与空白对照组比较，*表示P＜0.05。
2.2.2.6小鼠碳廓清实验
末次给受试物1h后,经小鼠左眼内眦静脉注入稀释的印度墨汁(用生理盐水稀释4倍),每10g体重注射0.1mL，墨汁注入后立即计时,于注入墨汁后第2分钟和第10分钟分别从右眼内眦取血20μL，加入到2mL0.1％Na2CO3溶液中摇匀。以Na2CO3溶液空白对照，用半自动生化仪以600nm波长测光密度值(OD)。处死小鼠，取肝脏和脾脏称重，计算吞噬指数a。
由表14可知，QQL-HT和QQL-ST组能提高小鼠碳廓清吞噬指数，与空白对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。
表14对小鼠碳廓清功能的影响
Figure BDA0003029322140000322
注：各剂量组与空白对照组比较，*表示P＜0.05。
2.2.2.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
末次给受试物1h后，给小鼠腹腔注射鸡红细胞悬液，注射后30min处死小鼠，腹腔注入2ML生理盐水，吸出腹腔液制片，置37℃孵箱温育30min。取出玻片于生理盐水中漂洗后晾干，用甲醇:丙酮(1:1)溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗，油镜下每片计数100个巨噬细胞，观察记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及被吞噬的鸡红细胞数,计算吞噬率和吞噬指数。
表15可知，QQL-HT和QQL-ST组能提高巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬百分率和吞噬指数，与空白对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。
表15对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
Figure BDA0003029322140000323
注：实验组与空白对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.05。
2.2.2.8 NK细胞活性测定(LDH测定法)
将小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液2×107个/mL，取传代后24h生长良好的YAC-1细胞，此为靶细胞，取靶细胞4×105个/mL和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL。上述各项各设3个平行孔，置5％CO2、37℃二氧化碳孵箱中培养4h。然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入，LDH基质液100μL，反应8分钟，每孔加30μL 1mol/L的HCL,在酶标仪490nm处测定光密度(OD)值，计算NK细胞活性。
由表16可知，QQL-HT和QQL-ST组小鼠NK细胞活性显著高于对照组(P＜0.05)，青钱柳二氯甲烷活性部位和正丁醇活性部位具有增强小鼠NK细胞活性的功能。
表16 NK细胞活性测定结果
Figure BDA0003029322140000331
注：实验组与空白对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.05。
2.3结果处理
阳性结果为：(1)细胞免疫功能：受试物各剂量组小鼠的淋巴细胞转化能力均高于阴性对照组,且高、中剂量组与阴性对照组比较差异具有显著性(P<0.05)，表明该受试物具有促进小鼠淋巴细胞增殖、转化能力的作用；受试物各剂量组小鼠的左右耳片重量差值均高于阴性对照组,且高、中剂量组与阴性对照组比较差异具有显著性(P<0.05),表明该受试物具有促进小鼠的迟发型变态反应的作用。
(2)体液免疫功能：受试验物高剂量组小鼠的抗体生成细胞数高于阴性对照组,且差异具有显著性(P<0.05),表明该受试物具有促进小鼠的抗体生成细胞增殖的作用；受试物各剂量组小鼠的抗体积数均高于阴性对照组,其中高剂量组与阴性对照组比较差异具有非常显著性(P<0.01),表明该受试物具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。
(3)单核-巨噬细胞功能：受试物各剂量组小鼠的吞噬指数均高于阴性对照组,且高、中剂量组与阴性对照组比较差异具有显著性(P<0.05),表明该受试物具有促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用；受试物各剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数高于阴性对照组，差异具有显著性意义(P<0.05),表明该样品对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能有明显的促进作用。
(4)NK细胞活性：受试物各剂量组小鼠的NK细胞活性均高于阴性对照组,与阴性对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05),表明该受试物对小鼠的NK细胞活性有明显的提高作用。
应用SPSS统计软件进行方差分析统计处理。与阴性对照组对比，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性4个方面中任2个结果阳性，可判定该受试物具有增强免疫力功能作用。
实施例3
青钱柳二氯甲烷活性部位和正丁醇活性部位的在制备降脂的药物中的应用。
3.2降脂活性评价
3.2.1高脂动物模型的建立与分组
小鼠经适应性喂养一周后，随机分成空白对照组和模型组。模型组用高脂乳剂(1mL/kg)对小鼠进行灌胃，空白对照组灌胃等体积的无菌水。以空白对照组为参考，按照与空白组TC值差异极显著(P<0.01)选取造模成功的小鼠，并将其随机分别为模型对照组、QQL-ST组和QQL-HT组。实验期间，各组小鼠自由饮水摄食，每天观察并记录动物的活动、进食状况。每周称量一次体重，以便合理地调整给药剂量。
3.2.2生化指标的测定
第4周灌喂结束后，禁食(不禁水)12h，空腹眼眶静脉采血700μL，在4℃，3500r/min离心10min，分离血清，采用酶标仪按试剂盒使用说明测定总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-L)、低密度脂蛋白(LDL-L)值TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA、LPS值。实验结束后，用乙醚麻醉小鼠，迅速解剖小鼠，摘取肝脏于-80℃保存备用，另取一份小鼠肝脏右叶部分组织，生理盐水清理后，浸泡于10％中性甲醛溶液中固定备用(48h以上)。
由表17、18可知，与正常对照组比较，模型对照组大鼠给药前及给药后TG、LDL-C、CHO显著升高，HDL-C降低(P<0.01)，提示大鼠高脂血症模型复制成功；给药28天后，与模型对照组比较，QQL-HT、QQL-ST组能降低高脂血症大鼠TG、LDL-C、CHO水平同时对HDL-C有升高作用(P<0.05)，提示青钱柳总黄酮和总三萜均对高脂血症具有治疗作用。
表17对大鼠高脂血症模型LDL、CHO的影响(
Figure BDA0003029322140000341
n＝10)
Figure BDA0003029322140000342
注：与正常对照组比较+P<0.05，++P<0.01，模型组比较＊P<0.05，＊＊P<0.01。
表18对大鼠高脂血症模型TG、HDL的影响(
Figure BDA0003029322140000343
n＝10)
Figure BDA0003029322140000344
Figure BDA0003029322140000351
注：与正常对照组比较++P<0.01，模型组比较＊P<0.05，＊＊P<0.01。
以上数据说明QQL-HT、QQL-ST对小鼠降脂作用明显。
实施例4QQL-HT、QQL-ST在制备改善记忆力的药物中的应用。
4.1试验方法
对记忆障碍小鼠进行Morris水迷宫实验，对比模型对照组、QQL-HT组和QQL-ST组小鼠找到平台时间、游泳总路程、平均速度等指标评价小鼠的学习记忆能力，进而评价青钱柳提取物改善记忆活性。
4.1.1东莨菪碱致记忆障碍小鼠模型的建立与分组
小鼠经适应性喂养一周后，随机分成空白对照组和模型组。模型组用东莨菪碱(1mg/kg)对小鼠进行腹腔注射，空白对照组腹腔注射等体积的无菌水。选取造模成功的小鼠，并将其随机分别为模型对照组、QQL-HT组、QQL-ST组。实验期间，各组小鼠自由饮水摄食，每天固定时间给药，每天一次，空白和模型组给予等量生理盐水，观察并记录动物的活动、进食状况。每周称量一次体重，以便合理地调整给药剂量。
4.2.2 Morris水迷宫实验
历时4天。将平台固定于第2象限的中央，水池中注入自来水，倒入墨汁使平台不可见，水位高于平台1.5cm。水温稳定在25℃±1℃。每天每只动物测试1次，测试前先将动物放在平台上适应10s，随机选取3个入水点，检测90s，若成功找到平台则让其在平台上停留10s再归笼，若未找到平台则引导动物至平台，停留10s。记录动物找到平台的时间(逃避潜伏期/总时间)、游泳总路程、平均速度等指标评价小鼠学习记忆能力。第4天进行空间探索，检测动物运动总路程、速度、平台象限时间和距离以及穿过平台次数等指标。
4.3实验结果
4.3.1对大鼠定位航行的影响
如表19、20、21所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠D1定位航行各指标无明显变化，D2-3天潜伏期明显增加(P<0.01)；与模型对照组比较，D2-3定位航行，QQL-HT、QQL-ST组大鼠潜伏期明显减少(P<0.05或P<0.01)。
表19对小鼠定位航行测试潜伏期的影响(s，x±s，n＝10)
Figure BDA0003029322140000352
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
表20对大鼠定位航行的影响(D2)
Figure BDA0003029322140000361
Figure BDA0003029322140000362
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
表21对大鼠定位航行的影响(D3)
Figure BDA0003029322140000363
Figure BDA0003029322140000364
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
4.3.2对大鼠空间探索的影响
如表22所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠穿越平台次数明显减少(P<0.01)；与模型对照组比较，QQL-HT和QQL-ST组大鼠穿越平台次数明显增加(P<0.01)。
表22对大鼠空间探索的影响
Figure BDA0003029322140000365
Figure BDA0003029322140000366
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
4.3.3对大鼠运动轨迹的影响
如图1所示，以平台所在象限为第一象限，顺时针命名其他象限，如图可知空白组大鼠运动轨迹最为密集，尤其是第一象限，而模型组大鼠运动轨迹稀；与模型相比，QQL-HT和QQL-ST组运动轨迹更密集，且集中于第一象限。
小结
实验表明，1号活性部位、2号活性部位能有效改善记忆力、降脂、增强免疫力。达玛烷型四环三萜化合物和异戊烯基黄酮类化合物作为它们的活性组分，其作用也明显。且本发明公开的达玛烷型四环三萜化合物和异戊烯基黄酮类化合物在改善记忆力、降脂、增强免疫力的活性明显优于现有技术中已经公开的类似结果。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (8)

1.一种1号活性部位，其特征在于，所述1号活性部位为青钱柳的二氯甲烷萃取浓缩液，该1号活性部位含有达玛烷型四环三萜化合物。
2.如权利要求1所述的1号活性部位在在制备改善记忆力的药物、制备降脂的药物或制备增强免疫力的药物中的应用。
3.一种2号活性部位，其特征在于，所述2号活性部位为青钱柳的正丁醇萃取浓缩液，该2号活性部位含有异戊烯基黄酮类化合物。
4.如权利要求3所述的2号活性部位在在制备改善记忆力的药物、制备降脂的药物或制备增强免疫力的药物中的应用。
5.如权利要求1所述的1号活性部位和如权利要求3中所述的2号活性部位的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将青钱柳叶用乙醇/水加热回流提取，浓缩得浸膏；
S2、将浸膏用水分散，用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并将萃取液浓缩，得二氯甲烷萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液、正丁醇萃取浓缩液；
S1中，乙醇的浓度为70％，青钱柳叶质量与乙醇的比值为1:10，加热的温度为120℃，加热的时间为2h，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为2-3天；优选的，S2中，利用二氯甲烷萃取三次，青钱柳叶质量与每次使用的二氯甲烷体积的比值为1:10，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为24-48小时；优选的，S2中，利用正丁醇萃取三次，青钱柳叶质量与每次使用的正丁醇体积的比值为1:10，浓缩的温度为65℃，浓缩的时间为72-96小时。
6.一种从青钱柳提取达玛烷型四环三萜化合物和异戊烯基黄酮类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将青钱柳叶用乙醇/水加热回流提取，浓缩得浸膏；
S2、将浸膏用水分散，用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并将萃取液浓缩，得二氯甲烷萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液、正丁醇萃取浓缩液；
S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对二氯甲烷萃取浓缩液和正丁醇萃取浓缩液进行分析及分离纯化；
S1中，乙醇的浓度为70％，青钱柳叶质量与乙醇的比值为1:10，加热的温度为120℃，加热的时间为2h，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为2-3天；优选的，S2中，利用二氯甲烷萃取三次，青钱柳叶质量与每次使用的二氯甲烷体积的比值为1:10，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为24-48小时；
优选的，S3中，二氯甲烷部位经硅胶柱层析CH2Cl2:CH3OH(100:1-0:100)梯度洗脱，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到9个部位(A-I)；
A-I部位TLC薄层分析，10％浓硫酸/乙醇加热显色，其中Fr.I薄层板显示紫红色条带，HPLC-DAD分析主要为末端吸收，初步确定I部位为三萜类富集部位；
首先对FrI采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，接着采用硅胶柱层析、小孔树脂柱层析和反向ODS柱层析，整个分离过程用UPLC-MS/MS方法对三萜进行追踪，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色及HPLC-DAD对样品进行分析，对3,4-裂环达玛烷型四环三萜化合物有效分离；最后采用半制备高效液相对目标化合物进行纯化。
优选的，S3中，正丁醇萃取部位经大孔树脂EtOH:H2O(0:100-0:95)梯度洗脱，HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到5个部位(a-e)；
a-e部位TLC薄层分析，10％浓硫酸/乙醇加热显色，其中Fr.c薄层板显示黄色条带；
首先对Fr.c采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，HPLC-DAD分析合并，得到6个部位Fr.c1-c6，Fr.c1主要为黄酮类吸收，初步确定Fr.c1部位为黄酮类富集部位；接着采用HW-40C和反向ODS柱层析，整个分离过程用UPLC-MS/MS方法对异戊烯基黄酮进行追踪，通过紫外特征吸收峰对异戊烯基黄酮类化合物有效分离；最后采用半制备高效液相对目标化合物进行纯化；
所述达玛烷型四环三萜化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：
Figure FDA0003029322130000021
其中，R1选自氢、C1-C6烷基；R2选自氢、L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖；R3选自
Figure FDA0003029322130000022
Figure FDA0003029322130000023
R4和R5独立的选自L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-呋喃阿拉伯糖；R6选自
Figure FDA0003029322130000024
所述异戊烯基黄酮类化合物的结构通式如下：
Figure FDA0003029322130000025
其中，R7选自L-鼠李糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-木糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(4→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-脱氧呋喃糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-鸡纳糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(3→1)-L-鼠李糖、L-鼠李糖；
R8选自氢、D-葡萄糖、L-鼠李糖-(2→1)-D-葡萄糖、D-木糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(4→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-脱氧呋喃糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-鸡纳糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(3→1)-L-鼠李糖、L-鼠李糖；
R9选自羟基，甲氧基、乙氧基、丙氧基；
R10选自
Figure FDA0003029322130000031
7.一种达玛烷型四环三萜化合物在制备改善记忆力的药物、制备降脂的药物或制备改善记忆力的药物中的应用，其特征在于，所述达玛烷型四环三萜化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：
Figure FDA0003029322130000032
其中，R1选自氢、C1-C6烷基；R2选自氢、L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖；R3选自
Figure FDA0003029322130000033
Figure FDA0003029322130000034
R4和R5独立的选自L-阿拉伯糖、D-鸡纳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-呋喃阿拉伯糖；R6选自
Figure FDA0003029322130000035
8.一种异戊烯基黄酮类化合物在制备改善记忆力的药物、制备降脂的药物或制备改善记忆力的药物中的应用，其特征在于，所述异戊烯基黄酮类化合物的结构通式如下：
Figure FDA0003029322130000041
其中，R7选自L-鼠李糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-木糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(4→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-脱氧呋喃糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-鸡纳糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(3→1)-L-鼠李糖、L-鼠李糖；
R8选自氢、D-葡萄糖、L-鼠李糖-(2→1)-D-葡萄糖、D-木糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(4→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-脱氧呋喃糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-鸡纳糖-(2→1)-L-鼠李糖、D-葡萄糖-(3→1)-L-鼠李糖、L-鼠李糖；
R9选自羟基，甲氧基、乙氧基、丙氧基；
R10选自
Figure FDA0003029322130000042
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