CN105055479A - 海南眼树莲水提取物抗炎活性成分及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医中药技术领域，特别涉及一种海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，眼树莲水浸泡过夜，超声波辅助提取，煎煮提取，合并滤液，减压浓缩得水提取物；取水提取物加水悬浮得悬浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚及混和溶剂萃取，分别得到各萃取物。本发明工艺简单，操作合理，同时可以得到眼树莲醇提取物的抗炎有效部位，是海南眼树莲这种天然产物在抗炎作用中的新发现；为眼树莲在肺燥咳痰，咳血，百日咳，小儿疳积，痢疾，疥疮毒脓，铁打肿痛，毒蛇咬伤治疗的临床用药方面，提供了理论与实验基础。

Description

海南眼树莲水提取物抗炎活性成分及应用

技术领域

本发明涉及中医中药技术领域，特别涉及一种海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，还涉及所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分的应用。

背景技术

眼树莲(学名：Dischidiachinensis)是萝藦科眼树莲属附生藤本植物，是中国的特有植物，别名：瓜子金、瓜子藤、滴锡藤等。在我国主要分布于海南、广东、广西等省区，在海南主要产于乐东、三亚、保亭等地，生长在低海拔至中海拔的山地林谷或旷地。眼树莲全株入药，有清肺化痰，凉血解毒之效，民间用于治疗肺燥咳痰，咳血，百日咳，小儿疳积，痢疾，疥疮毒脓，铁打肿痛，毒蛇咬伤。海南黎族地区用其全草煮水熏眼，治疗眼疾。霍丽妮等从眼树莲全株中分得总酚和总酮成分，经研究显示其具有体外抗氧化活性。目前国内外尚未见有关眼树莲急性毒性和药理活性的研究报道，对其抗炎活性成分及提取，也很少有相关的研究。

发明内容

为了解决以上对眼树莲开发应用方面的不充分的问题，本发明提供了一种眼树莲水提取物抗炎活性成分。本文采用二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致小鼠毛细血管通透性增加、鸡蛋清诱导大鼠足肿胀三种炎症模型考察眼树莲水提取物与乙醇提取物的抗炎效果，为进一步开发利用该植物的药用资源提供理论依据。本文首次通过系统溶剂法，获得眼树莲水提取物不同溶剂萃取部位，通过动物药理实验初步筛选出其抗炎活性部位，为进一步寻找眼树莲抗炎作用的有效成分提供科学依据。

本发明还提供了所述的眼树莲水提取物抗炎活性成分的应用。

本发明是通过以下措施实现的：

一种海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，是通过以下步骤得到的：

(1)取干燥眼树莲，粉碎后过40目筛，以30倍量水浸泡过夜，然后以超声波提取2h，超声频率为40～50KHz，温度70-80℃，超声波1.5小时后，同时煎煮30min，重复上述浸泡、超声、煎煮3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，即得水提取物；

(2)取水提取物加水悬浮得悬浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取，分别得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、石油醚萃取物。

优选步骤(2)中悬浮液分别用乙酸乙酯和正丁醇体积比1:1的混合溶剂，乙酸乙酯和正丁醇体积比1:2的混合溶剂，乙酸乙酯、正丁醇和石油醚体积比1:2：0.1的混合溶剂萃取。

所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，优选步骤(2)中水提取物和水的重量比为1:5～10。

所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，优选步骤(2)中乙酸乙酯、正丁醇、石油醚与悬浮液的体积比分别1:1～5。

所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，优选步骤(2)中乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取时间分别为5～10min。

所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，优选步骤(1)中超声波辅助提取时间为2h。

所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分在制备抗炎药物中的应用。

所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分与医学上可接受载体制备成片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂、注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。

本发明的有益效果：

1、本发明工艺简单，操作合理，同时可以得到眼树莲醇提取物的乙酸乙酯萃取物(水)、正丁醇萃取物(水)两个抗炎有效部位，是海南眼树莲这种天然产物在抗炎作用中的新发现；

2、以本发明所述的眼树莲水提取物给小鼠灌胃后，连续观察14d，小鼠全部健存，其外观、食欲、行为活动、排泄等均未见异常；第14d脱颈处死并解剖，各个脏器官未见异常。符合不同周龄昆明种小鼠体重的增长关系，说明眼树莲在该剂量下研究其抗炎性较安全；

3、眼树莲水提取物以最大灌胃容量0.4mL/10g给小鼠灌胃，对小鼠最大耐受生药量为228.71g/kg，眼树莲水提取物最大耐受剂量为今后进行长期毒性试验、特殊毒性试验和临床研究的剂量设置提供参考；

4、通过对抗炎活性部位的筛选，海南眼树莲水提取物的不同萃取物在抗炎实验方面有一定差异，其中正丁醇和乙酸乙酯萃取物活性较好，它们高、中剂量组均对二甲苯引起的耳肿胀、醋酸引起的毛细血管通透性增加、鸡蛋清诱导的大鼠足肿胀均有明显的抑制作用，且均具有剂量依赖关系，其抑制作用与阿司匹林相当，说明其能够有效缓解炎症发生过程的早期症状；

5、本发明研究结果为眼树莲在肺燥咳痰，咳血，百日咳，小儿疳积，痢疾，疥疮毒脓，铁打肿痛，毒蛇咬伤治疗的临床用药方面，提供了理论与实验基础；

6、通过聚酰胺树脂法和硅胶快速色谱法技术对正丁醇萃取物(水)和乙酸乙酯萃取物(水)进行分离纯化，发现正丁醇萃取物(水)和乙酸乙酯萃取物(水)总黄酮和鞣质总含量大于40％，化学成分的初步确定为以后单体化合物的纯化和开发成抗炎药物奠定科学基础；

7、本发明得到乙酸乙酯萃取物(水)、正丁醇萃取物(水)两个抗炎有效部位，可以在药学上接受载体或赋形剂制备成药物制剂，这些药物制剂可以选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂、注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

实施例1：水提取

1材料

1.1药物和试剂眼树莲采自海南省海口市火山口，经中国热带农业科学院生物研究所戴好富研究员鉴定萝藦科(Asexepiadaeeae)眼树莲属(DisehidiaR.B)植物眼树莲(DischidiachinensisChamp.exBenth)全株。阿司匹林肠溶片(江苏平光制药有限责任公司，批号:140801)；伊文思蓝(BS，5g，阿拉丁试剂上海有限公司)；0.9％氯化钠注射液(药用级，湖南金健药业有限责任公司)；羧甲基纤维素(AR，500g/瓶，国药集团化学试剂厂)；二甲苯(AR，500mL/瓶，天津大茂制药化学试剂厂)；正丁醇、醋酸乙酯和石油醚均为分析纯。1.2动物昆明种小鼠，清洁级，体重质量18～22g，长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物使用许可证号：SCXK(湘)2014-0011，合格证号：43006700005502。SD大鼠，清洁级，体重质量(180±20)g，长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物使用许可证号：SCXK(湘)2014-0011，合格证号：43006700005574。根据实验性质和性别分笼喂养，适应环境1周，自由饮水进食。

1.3仪器AE100型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；T520电子天平(湖南长沙湘仪)；722N型可见分光光度计(上海精密科学仪器公司)；800C型台式低速离心机(上海安亭科学仪器有限公司)；C-YLS-Q4型耳片打孔器(北京哲成科技有限公司)；大鼠足容积测定装置(自制)。

2方法

2.1供试样品的制备取干燥眼树莲5kg，粉碎后过40目筛，以30倍量水浸泡过夜，然后以超声波提取2h，超声频率为40～50KHz，温度70-80℃，在超声波提取1.5小时后，同时开启水煎煮，共煎煮30min，重复上述浸泡、超声、煎煮3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，即得水提取物229.5g，回收率为4.59％。取适量水提取物加5倍水悬浮得悬浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取，乙酸乙酯、正丁醇、石油醚与悬浮液的体积比分别是1:5，萃取时间分别为5～10min，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物(水)、正丁醇萃取物(水)、石油醚萃取物(水)，分别加1％的羧甲基纤维素水溶液配制成所需浓度，分别作为供试样品；另外将经各种溶剂萃取后剩余水溶液浓缩，作为水液组。

2.2对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响取昆明种小鼠120只，雄性，随机分为12组：即空白对照组(1％的羧甲基纤维素水溶液)；阿司匹林组；眼树莲正丁醇萃取物(水)高(H)、中(M)、低(L)剂量组；乙酸乙酯萃取物(水)高(H)、中(M)、低(L)剂量组；石油醚萃取物(水)高(H)、中(M)、低(L)剂量组；水液组；每组10只，称重，标记。灌胃给药，各组小鼠灌胃1次/d，连续5d，给药体积0.1mL/10g，末次给药后1h，将小鼠右耳双面均匀涂抹二甲苯2μL/只，左耳不涂作为对照，1h后脱颈处死小鼠，用9mm打孔器分别在双耳相同位置打下耳片，置于电子天平上称取耳片重量，以左右耳片重量差值表示肿胀度，采用q检验比较各组间耳肿胀度，并计算肿胀抑制率。

肿胀抑制率(％)＝[(空白对照组平均耳肿胀度－给药组平均耳肿胀度)/空白组平均耳肿胀度]×100(％)

结合多次二甲苯致炎预实验结果，确定各个不同提取部位的高、中、低剂量分别48、24、12mg·Kg^-1；阿司匹林给药组给药剂量500mg·Kg^-1；空白对照组为1％羧甲基纤维素水溶液；各实验组给药量均为0.1mL/10g。实验结果(见表1)表明，与空白对照组比较，对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎性肿胀，正丁醇萃取物(水)高、中剂量组和乙酸乙酯萃取物(水)高、中剂量组均有明显抑制作用，且与空白对照组比较差异性极其显著(P＜0.01)；这两种萃取物高、中剂量抑制作用与阿司匹林组相比无显著差异(P>0.05)，表明这两种萃取物能对小鼠二甲苯致炎肿胀起一定抑制作用，且这两种萃取物间，有一定的量效关系。石油醚萃取物(水)组和水液组与空白对照组比较，无显著差异(P>0.05)。

表1眼树莲不同提取部位对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝10

2.3醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性实验取昆明种小鼠120只，雄性，分组及给药同“2.2”项。连续给药5d，末次给药后1h，各鼠均尾静脉注射0.5％伊文思蓝生理盐水溶液0.1mL/10g，并立即腹腔注射0.6％的醋酸溶液0.2mL/只。20min后脱颈处死小鼠，腹腔注射6mL生理盐水，轻柔小鼠腹部1min，剪开腹腔，收集洗涤液4mL，用离心机5000r/min离心3min，取上清液于波长590nm处比色，测定吸光度(A)值，采用q检验比较各组间吸光度，并计算小鼠腹腔毛细血管通透性增加的抑制率。

抑制率＝[(空白对照组A₅₉₀－给药组A₅₉₀)/空白组A₅₉₀]×100(％)

实验结果(见表2)表明，与空白对照组比较，正丁醇萃取物(水)高、中剂量组和乙酸乙酯萃取物(水)高、中剂量组均能降低醋酸引起的小鼠毛细血管通透性增加，使腹腔内渗出的染料明显减少(P＜0.05)，即可降低毛细血管的通透性，减少急性、早期炎症的渗出；与阿司匹林组比较差异无显著性(P>0.05)，表明这两种萃取物，对降低醋酸致小鼠毛细血管通透性有增加的作用效果，使腹腔内渗出的染料明显减少。

且这两种萃取物间，呈现一定的量效关系。石油醚萃取物(水)各剂量组和水液组与空白对照组比较，无显著差异(P>0.05)，且石油醚萃取物(水)各剂量和水液组与阳性药物组比较，差异性极其显著(P＜0.01)。说明石油醚萃取物(水)各剂量和水液组对降低醋酸致小鼠毛细管通透性抑制性较弱。

表2眼树莲不同提取部位对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝10

2.4对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀的影响实验取大鼠120只，分组同“2.2”项，共12组，每组10只，雄性，各组大鼠灌胃1次/d，给药量为1mL/100g，连续5d。第5天，大鼠禁食12h，用足容积测定装置(自制)先测得大鼠右后足的初始容积，末次给药后1h，大鼠右足掌皮下注射蛋清0.2mL致炎，使右足肿胀，分别在0.5、1、2、4、6h用足容积测定装置测量足肿胀情况，记录足肿胀后的容积，计算大鼠足肿胀率，左足不做任何处理。

大鼠足肿胀率＝[(致炎后足掌容积－致炎前足掌容积)/致炎前足掌容积]×100(％)

根据大鼠与小鼠之间用药剂量的换算^[11]，确定对于各个不同部位提取物的高、中、低剂量分别为：33.6、16.8、8.4mg·Kg^-1。实验结果(见表3)表明，与空白对照组比较，对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀，正丁醇萃取物(水)高、中剂量组(P<0.05)和乙酸乙酯萃取物(水)高、中剂量组均有明显抑制作用。且这两种萃取物的不同剂量第0.5h～4h时与阿司匹林组相比无显著差异(P>0.05)，这两种萃取物中，随着剂量的增加，抑制作用更加明显。但是正丁醇萃取物(水)高、中剂量组和乙酸乙酯萃取物(水)高、中剂量组在第在对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀实验中，与前面两个小鼠抗炎实验模型结果不同的是，两种萃取物不同剂量与阿司匹林组相比差异有些显著(P<0.05)。石油醚萃取物(水)和水液组第4～6h与阿司匹林组相比显著差异(P＜0.05)，且石油醚萃取物(水)和水液组对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀得抑制性较弱。

表3眼树莲不同提取部位对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝8

2.5数据处理采用SPSS17.0统计软件，各指标均以表示，两组间比较采用t检验和q值比较^[10]。

3讨论

炎症是机体活组织对损伤因子所发生的防御反应，急性炎症表现为炎症部位红肿，毛细血管通透性增加而引起的炎症渗出和肿胀等。通过对抗炎活性部位的筛选，海南眼树莲水提取物的不同萃取物在抗炎实验方面有一定差异，其中正丁醇萃取物(水)和乙酸乙酯萃取物(水)活性较好，它们高、中剂量组均对二甲苯引起的耳肿胀、醋酸引起的毛细血管通透性增加、鸡蛋清诱导的大鼠足肿胀均有明显的抑制作用，且均具有剂量依赖关系，其抑制作用与阿司匹林相当，说明其能够有效缓解炎症发生过程的早期症状，这可能与其明显抑制炎症早期血管通透性亢进和水肿有关，但具体的抗炎机制还需进一步研究阐明。本实验结果为眼树莲在肺燥咳痰，咳血，百日咳，小儿疳积，痢疾，疥疮毒脓，铁打肿痛，毒蛇咬伤治疗的临床用药方面，提供了理论与实验基础，但其主要有效成分尚需进一步研究。

实施例2

取干燥眼树莲5kg，粉碎后过40目筛，以30倍量水浸泡过夜，然后以超声波提取2h，超声频率为40～50KHz，温度70-80℃，在超声波提取1.5小时后，同时开启水煎煮，共煎煮30min，重复上述浸泡、超声、煎煮3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，即得水提取物229.5g，回收率为4.59％。取适量水提取物加10倍水悬浮得悬浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取，乙酸乙酯、正丁醇、石油醚与悬浮液的体积比分别是1:1，萃取时间分别为10min，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物(水)、正丁醇萃取物(水)、石油醚萃取物(水)。

实施例3

取干燥眼树莲5kg，粉碎后过40目筛，以30倍量水浸泡过夜，然后以超声波提取2h，超声频率为40～50KHz，温度70-80℃，在超声波提取1.5小时后，同时开启煎煮，共煎煮30min，重复上述浸泡、超声、煎煮3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，即得水提取物229.5g，回收率为4.59％。取适量水提取物加8倍水悬浮得悬浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取，乙酸乙酯、正丁醇、石油醚与悬浮液的体积比分别是1:2，萃取时间分别为6min，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物(水)、正丁醇萃取物(水)、石油醚萃取物(水)，

实施例4

取干燥眼树莲5kg，粉碎后过40目筛，以30倍量水浸泡过夜，然后以超声波提取2h，超声频率为40～50KHz，温度70-80℃，在超声波提取1.5小时后，同时开启煎煮，共煎煮30min，重复上述浸泡、超声、煎煮3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，即得水提取物229.5g，回收率为4.59％。取适量水提取物加5倍水悬浮得悬浮液，分别用乙酸乙酯和正丁醇体积比1:1的混合溶剂、乙酸乙酯和正丁醇体积比1:2的混合溶剂、乙酸乙酯、正丁醇和石油醚体积比1:2：0.1的混合溶剂萃取，各混合溶剂与悬浮液的体积比分别是1:5，萃取时间分别为5～10min，减压浓缩，得1:1混和溶剂萃取物(水)、1:2混和溶剂萃取物(水)、1:2：0.1混和溶剂萃取物(水)，分别加1％的羧甲基纤维素水溶液配制成所需浓度，分别作为供试样品。

上述萃取物分别按照实施例1中2.2、2.3、2.4的方法进行实验，结果见下表4、5、6。

表4眼树莲不同提取部位对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝10

表5眼树莲不同提取部位对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝10

表6眼树莲不同提取部位对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝8

在实施例1研究基础上，已经优选出提取海南眼树莲抗炎活性成分的萃取剂，为了进一步提高提取效率，进行了本实施例的试验。在试验时，选择了多种溶剂及混合溶剂的多种配比，为了节约说明书的篇幅，在此，只是列举了效果较好的混合溶剂及配比。通过本试验，发现，采用乙酸乙酯和正丁醇体积比1:1、1:2的混合溶剂，乙酸乙酯、正丁醇和石油醚体积比1:2：0.1的混合溶剂，相比较于单独的乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取效率更高，得到的抗炎活性成分抗炎效果更好。单独使用石油醚萃取，得到的成分抗炎效果不佳，但将其与乙酸乙酯和正丁醇采用特定的配比复合使用时，却能提高萃取效率，得到抗炎效果更好的抗炎活性成分。

实施例5：醇提取

1材料与仪器

1.1药物和试剂眼树莲采自海南省海口市火山口，经中国热带农业科学院生物研究所戴好富研究员鉴定萝藦科(Asexepiadaeeae)眼树莲属(DisehidiaR.B)植物眼树莲(DischidiachinensisChamp.exBenth)全株。阿司匹林肠溶片(江苏平光制药有限责任公司，批号:140401)；伊文思蓝(BS，5g，阿拉丁试剂上海有限公司)；0.9％氯化钠注射液(药用级，四川科伦药业股份有限公司)；羧甲基纤维素(AR，500g/瓶，国药集团化学试剂厂)；二甲苯(AR，500mL/瓶，天津大茂制药化学试剂厂)；正丁醇、醋酸乙酯和石油醚均为分析纯。

1.2动物昆明种小鼠，清洁级，体重质量18～22g，长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物使用许可证号：SCXK(湘)2014-0011，合格证号：43006700005502。SD大鼠，清洁级，体重质量(140±10)g，长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物使用许可证号：SCXK(湘)2014-0011，合格证号：43006700005574。根据实验性质和性别分笼喂养，适应环境1周，自由饮水进食。

1.3仪器AE100型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；T520电子天平(湖南长沙湘仪)；722N型可见分光光度计(上海精密科学仪器公司)；800C型台式低速离心机(上海安亭科学仪器有限公司)；C-YLS-Q4型耳片打孔器(北京哲成科技有限公司)；大鼠足容积测定装置(自制)。

2方法

2.1供试样品的制备

取干燥的眼树莲5kg，粉碎后过40目筛，以30倍量95％乙醇浸泡过夜，然后以超声波辅助提取2h，超声频率为40～50KHz，超声温度为40～50℃，重复上述浸泡超声提取步骤3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，获得浸膏。将浸膏进行以下步骤：a)将浸膏加水(重量比1:1)溶解，经大孔吸附树脂(包括非极性或弱极性)，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；b)用10～50％乙醇溶液洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；c)用60～90％乙醇溶液洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；d)将c)中获得的洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，用95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得乙醇提取物108.5g，回收率为2.17％。将乙醇提取物50g加入1000ml水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇与悬浮液的体积比分别为1:3)，减压浓缩，得石油醚萃取物(醇)(20.23g)、乙酸乙酯萃取物(醇)(14.87g)、正丁醇萃取物(醇)(12.15g)，分别加1％的羧甲基纤维素水溶液配制成所需浓度，作为供试样品。

2.2急性毒性实验经预实验，用眼树莲乙醇提取物以最大浓度112mg/mL，最大灌胃容量0.4mL/10g灌胃给药，连续观察1周，未见小鼠死亡，故确定本品急性毒性按最大耐受量(maximumtolerateddose，MTD)进行正式实验。取昆明种小鼠40只，随机分为2组：药物组和空白对照组，每组20只，雌雄各半。小鼠禁食不禁水12h后，给药组以最大浓度、最大灌胃容量灌胃给药1次，对照组给予等体积的1％羧甲基纤维素1次，观察小鼠急性毒性反应，记录动物的外观、行为活动、精神状态、摄食、大小便及其颜色、皮毛、肤色、呼吸，鼻、眼、口腔有无异常分泌物。给药后常规饲养14d,每天固定时间观察1次，给药后的第7天、第14天分别称重一次，记录小鼠体重。末次称重后，脱颈椎将其处死，解剖小鼠，肉眼观察其心、肝、脾、肺、肾的外观。

将眼树莲乙醇提取物用1％羧甲基纤维素水溶液配成浓度为112mg/mL，以最大灌胃容量0.4mL/10g，给药物组小鼠灌胃给药1次；同时用等体积的1％羧甲基纤维素水溶液给空白对照组灌胃1次，两组小鼠均连续观察14d。实验结果表明，小鼠全部健存，动物的外观、食欲、行为活动、排泄等均未见异常；处死后进行解剖，各器官未见异常。因此，小鼠对眼树莲乙醇提物的最大耐受生药量206.45g/kg，各组小鼠体质量增长情况见表7。

表7眼树莲乙醇提取物对小鼠体质量的影响

由表1可知，给药后第7天、第14天给药组小鼠体质量与空白对照组比较均无显著差异，说明眼树莲乙醇提取物对小鼠正常生长影响小，安全性高。

2.2对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响取昆明种小鼠140只，随机分为14组：即空白对照组(1％的羧甲基纤维素水溶液)；阿司匹林组；眼树莲石油醚萃取物(醇)高(H)、中(M)、低(L)剂量组；眼树莲正丁醇萃取物(醇)高(H)、中(M)、低(L)剂量组；乙酸乙酯萃取物(醇)高(H)、中(M)、低(L)剂量组；乙醇提取物高(H)、中(M)、低(L)剂量组，每组10只，雌雄各半，称重，标记。灌胃给药，各组小鼠灌胃1次/d，连续5d，给药体积0.1mL/10g，末次给药后1h，将小鼠右耳双面均匀涂抹二甲苯0.02mL/只，左耳不涂作为对照，40min后脱颈处死小鼠，用9mm打孔器分别在双耳相同位置打下耳片，置于电子天平上称取耳片重量，以左右耳片重量差值表示肿胀度，采用q检验比较各组间耳肿胀度，并计算肿胀抑制率。

肿胀抑制率(％)＝[(空白对照组平均耳肿胀度－给药组平均耳肿胀度)/空白组平均耳肿胀度]×100(％)

结合多次二甲苯致炎预实验结果，确定各个不同提取部位的高、中、低剂量分别48、24、12mg/Kg；阿司匹林给药组给药剂量500mg/Kg；空白对照组为1％羧甲基纤维素水溶液；各实验组给药量均为0.1mL/10g。实验结果(见表8)表明，与空白对照组比较，对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎性肿胀，正丁醇萃取物(醇)高、中、低剂量组和乙酸乙酯萃取物(醇)高、中、低剂量组均有明显抑制作用，且与空白对照组比较差异性极其显著(P＜0.01)；这两种药物抑制作用与阿司匹林组相比无显著差异(P>0.05)，表明这两种萃取物能对小鼠二甲苯致炎肿胀起抑制作用，且作用效果与阿司匹林组相当，但两种药物间抑制作用差异不明显。这两种药物中，随着剂量的增加，抑制作用更加明显。乙醇提取物各剂量组对二甲苯所致炎症有些抑制作用，但作用不是很明显。石油醚萃取物(醇)各剂量组与空白对照组比较，无显著差异(P>0.05)。

表8眼树莲不同提取部位对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝10

2.3醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性实验取昆明种小鼠140只，雌雄各半，分组及给药同“2.2”项。连续给药5d，末次给药后1h，各鼠均尾静脉注射0.5％伊文思蓝生理盐水溶液0.1mL/10g，并立即腹腔注射0.6％的醋酸溶液0.2mL/只。20min后脱颈处死小鼠，腹腔注射6mL生理盐水，轻柔小鼠腹部1min，剪开腹腔，收集洗涤液，用离心机3000r/min离心5min，取上清液于波长590nm处比色，测定吸光度(A)值，并计算小鼠腹腔毛细血管通透性增加的抑制率。

抑制率＝[(空白对照组A₅₉₀－给药组A₅₉₀)/空白组A₅₉₀]×100(％)

实验结果(见表9)表明，与空白对照组比较，正丁醇萃取物(醇)高、中、低剂量组和乙酸乙酯萃取物(醇)高、中、低剂量组均能降低醋酸引起的小鼠毛细血管通透性增加，使腹腔内渗出的染料明显减少(P＜0.01)，即可降低毛细血管的通透性，减少急性、早期炎症的渗出；与阿司匹林组比较差异无显著性(P>0.05)，表明这两种萃取物，对降低醋酸致小鼠毛细血管通透性增加的作用效果与阿司匹林相当，使腹腔内渗出的染料明显减少。而乙醇提取物各剂量组醋酸所致炎症有些抑制作用，但是作用不是很明显。石油醚萃取物(醇)各剂量组与空白对照组比较，无显著差异，且石油醚萃取物各剂量与阳性药物组比较，差异性极其显著(P＜0.01)。

表9眼树莲不同提取部位对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝10

2.4对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀的影响实验取大鼠112只，分组同“2.2”项，共14组，每组8只，雌雄各半，各组小鼠灌胃1次/d，给药量为1mL/100g，连续5d。第5天，大鼠禁食12h，用足容积测定装置(自制)先测得大鼠右后足的初始容积，末次给药后1h，大鼠右足掌皮下注射蛋清0.1mL致炎，使右足肿胀，分别在0.5、1、2、4、6h用足容积测定装置测量足肿胀情况，记录足肿胀后的容积，计算大鼠足肿胀率，左足不做任何处理。

大鼠足肿胀率＝[(致炎后足掌容积－致炎前足掌容积)/致炎前足掌容积]×100(％)

根据大鼠与小鼠之间用药剂量的换算，确定对于各个不同部位提取物的高、中、低剂量分别为：33.6、16.8、8.4mg/Kg。实验结果(见表10)表明，与空白对照组比较，对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀，正丁醇萃取物(醇)高、中、低剂量组(P<0.05)和乙酸乙酯萃取物(醇)高、中、低剂量组均有明显抑制作用，但是两者相比较看，与前面小鼠致炎实验不同，这次乙酸乙酯萃取物(醇)高、中剂量组比正丁醇萃取物(醇)高、中剂量组抑制作用略好。且这两种萃取物的不同剂量与阿司匹林组相比无显著差异(P>0.05)，这两种萃取物中，随着剂量的增加，抑制作用更加明显。乙醇提取物各剂量组二甲苯所致炎症有些抑制作用，但是作用不是很明显。石油醚萃取物(醇)各剂量组与空白对照组比较，无显著差异，且石油醚萃取物(醇)各剂量与阳性药物组比较，差异性极其显著(P＜0.01)。

表10眼树莲不同提取部位对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝8

2.5数据处理采用SPSS17统计软件，各指标均以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析和q检验。

3讨论

3.1急性毒性实验结果表明，小鼠对眼树莲醇提取物最大耐受量为生药量206.45g/kg，给药后小鼠未出现明显毒性反应和死亡情况，且该药对小鼠正常生长无明显影响，说明眼树莲毒性小，在该剂量下研究该药的抗炎作用是安全的，同时显示出该药具有良好的药用价值开发前景。

3.2炎症是机体活组织对损伤因子所发生的防御反应，急性炎症表现为炎症部位红肿，毛细血管通透性增加而引起的炎症渗出和肿胀等。抗炎活性部位筛选实验结果表明，正丁醇萃取物(醇)高、中、低剂量组和乙酸乙酯萃取物(醇)高、中、低剂量组均对二甲苯引起的耳肿胀、醋酸引起的毛细血管通透性增加、鸡蛋清诱导大鼠足肿胀均有明显的抑制作用。其抑制作用与阿司匹林相当，说明其能够有效缓解炎症发生过程的早期症状，这可能与其明显抑制炎症早期血管通透性亢进和水肿有关，但具体的抗炎机制还需进一步阐明。这两种萃取物对这三个动物抗炎实验模型均有抑制作用，而且均表现出具有剂量依赖关系。

3.3本研究表明眼树莲醇提取物中正丁醇和乙酸乙酯部位的不同剂量均具有抗炎作用。此研究也为眼树莲在肺燥咳痰，咳血，百日咳，小儿疳积，痢疾，疥疮毒脓，铁打肿痛，毒蛇咬伤治疗的民间用药方面，提供了一定的实验依据，对于治疗疾病的具体作用效果和机制还有待进一步深入研究。

实施例6

取干燥的眼树莲5kg，粉碎后过40目筛，以30倍量95％乙醇浸泡过夜，然后以超声波辅助提取2h，超声频率为40KHz，超声温度为40℃，重复上述浸泡超声提取步骤3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，获得浸膏。将浸膏进行以下步骤：a)将浸膏加水(重量比1:1)溶解，经大孔吸附树脂(包括非极性或弱极性)，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；b)用10～50％乙醇溶液洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；c)用60～90％乙醇溶液洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；d)将c)中获得的洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，用95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得乙醇提取物110.5g。将乙醇提取物50g加入500ml水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇与悬浮液的体积比分别为1:1)，减压浓缩，得石油醚萃取物(醇)、乙酸乙酯萃取物(醇)、正丁醇萃取物(醇)，分别加1％的羧甲基纤维素水溶液配制成所需浓度，作为供试样品。

实施例7

取干燥的眼树莲5kg，粉碎后过40目筛，以30倍量95％乙醇浸泡过夜，然后以超声波辅助提取2h，超声频率为50KHz，超声温度为50℃，重复上述浸泡超声提取步骤3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，获得浸膏。将浸膏进行以下步骤：a)将浸膏加水(重量比1:1)溶解，经大孔吸附树脂(包括非极性或弱极性)，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；b)用10～50％乙醇溶液洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；c)用60～90％乙醇溶液洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；d)将c)中获得的洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，用95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得乙醇提取物104.3g。将乙醇提取物50g加入800ml水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇与悬浮液的体积比分别为1:2)，减压浓缩，得石油醚萃取物(醇)、乙酸乙酯萃取物(醇)、正丁醇萃取物(醇)，分别加1％的羧甲基纤维素水溶液配制成所需浓度，作为供试样品。

实施例8

取干燥的眼树莲5kg，粉碎后过40目筛，以30倍量95％乙醇浸泡过夜，然后以超声波辅助提取2h，超声频率为40～50KHz，超声温度为40～50℃，重复上述浸泡超声提取步骤3次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，获得浸膏。将浸膏进行以下步骤：a)将浸膏加水(重量比1:1)溶解，经大孔吸附树脂(包括非极性或弱极性)，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；b)用10～50％乙醇溶液洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；c)用60～90％乙醇溶液洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；d)将c)中获得的洗脱液经脱色树脂柱D941色谱，用95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得乙醇提取物108.5g，回收率为2.17％。将乙醇提取物50g加入1000ml水悬浮，分别用乙酸乙酯和正丁醇体积比1:1的混合溶剂，乙酸乙酯和正丁醇体积比1:2的混合溶剂，乙酸乙酯、正丁醇和石油醚体积比1:2：0.1的混合溶剂萃取，减压浓缩，得1:1混合溶剂萃取物(醇)、1:2混合溶剂萃取物(醇)、1:2：0.1混合溶剂萃取物(醇)，分别加1％的羧甲基纤维素水溶液配制成所需浓度，作为供试样品。

上述萃取物分别按照实施例5中2.3、2.4、2.5中记载的方法进行实验，结果见下表11、12、13。

表11眼树莲不同提取部位对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝10

表12眼树莲不同提取部位对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝10

表13眼树莲不同提取部位对鸡蛋清诱导大鼠足肿胀的影响

与空白对照组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；与阿司匹林组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；n＝8

在实施例5研究基础上，已经优选出提取海南眼树莲抗炎活性成分的萃取剂，为了进一步提高提取效率，进行了本实施例的试验。在试验时，选择了多种溶剂及混合溶剂的多种配比，为了节约说明书的篇幅，在此，只是列举了效果较好的混合溶剂及配比。通过本试验，发现，采用乙酸乙酯和正丁醇体积比1:1、1:2的混合溶剂，乙酸乙酯、正丁醇和石油醚体积比1:2：0.1的混合溶剂，相比较于单独的乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取效率更高，得到的抗炎活性成分抗炎效果更好。单独使用石油醚萃取，得到的成分抗炎效果不佳，但将其与乙酸乙酯和正丁醇采用特定的配比复合使用时，却能提高萃取效率，得到抗炎效果更好的抗炎活性成分。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，其特征在于是通过以下步骤得到的：

（1）取干燥眼树莲，粉碎后过40目筛，以30倍量水浸泡过夜，然后以超声波提取2h，超声频率为40~50KHz，温度70-80℃，超声波1.5小时后，同时水煎煮30min，重复上述浸泡、超声、煎煮3次，冷却，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，即得水提取物；

（2）取水提取物加水悬浮得悬浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取，分别得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、石油醚萃取物。

2.根据权利要求1所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，其特征在于步骤（2）中悬浮液分别用乙酸乙酯和正丁醇体积比1:1的混合溶剂，乙酸乙酯和正丁醇体积比1:2的混合溶剂，乙酸乙酯、正丁醇和石油醚体积比1:2：0.1的混合溶剂萃取。

3.根据权利要求1所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，其特征在于步骤（2）中水提取物和水的重量比为1:5~10。

4.根据权利要求1所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，其特征在于步骤（2）中乙酸乙酯、正丁醇、石油醚与悬浮液的体积比分别1:1~5。

5.根据权利要求1所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，其特征在于步骤（2）中乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取时间分别为5~10min。

6.根据权利要求1所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分，其特征在于步骤（1）中超声波辅助提取时间为2h。

7.一种权利要求1-6中任一项所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分在制备抗炎药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于权利要求1-6中任一项所述的海南眼树莲水提取物抗炎活性成分与医学上可接受载体制备成片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂、注射乳剂、冻干粉针、缓释或控释制剂。