CN113072492B - 一种异喹啉生物碱类化合物、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种异喹啉生物碱类化合物、制备方法及用途。本发明还提供了所述的异喹啉生物碱类化合物在制备抗炎、预防或治疗炎症相关疾病、抗肿瘤、抗菌、镇痛、调节免疫功能、抗血小板凝聚、抗心律失常或降压药物中的应用。

Description

一种异喹啉生物碱类化合物、制备方法及用途
技术领域
本发明属于化学药物领域，具体涉及一种异喹啉生物碱类化合物、制备方法及用途。
背景技术
炎症是机体应对外来刺激时发生的一种具有保护性的重要免疫反应。炎症之于机体是一把双刃剑，通常情况下，适度的炎症反应是人体的自动防御反应，有利于机体对抗外界病原微生物的感染。而失调的炎症是有害的，过度或持续存在的炎症反应是导致机体组织损伤和器质性病变的主要原因。局部组织长期、慢性的炎症反应会诱发除了炎性因子以外多种信号通路中众多基因、蛋白、非编码RNA等分子的参与，这种调控网络在多种疾病的发生发展过程中发挥了重要的作用，如恶性肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、消化系统疾病、呼吸系统疾病、代谢性疾病、心脑血管疾病、泌尿生殖系统疾病、感染性疾病等，可见几乎所有疾病的发展过程都存在炎症反应[2]。
巨噬细胞被认为是调控炎症过程进展的关键因素。不同表型的巨噬细胞在炎症反应和组织重塑中发挥不同的作用[3-5]。迄今为止，至少有两种不同的巨噬细胞表型被报道：典型激活的巨噬细胞(Classically activatedmacrophage,M1)和交替激活的巨噬细胞(Alternatively activatedmacrophage,M2)。M1巨噬细胞在炎症反应后2天内趋化激活，在炎症早期起主导作用，通过产生IL-1、TNF-α、IL-6、IL-23、活性氧(ROS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)等促炎因子促进炎症反应。脂多糖(LPS)可通过激活NF-κB信号通路促进M1巨噬细胞的活化从而增加其数量，是经典的M1巨噬细胞激动剂，因而通过开发NF-κB通路抑制剂来抑制LPS诱导的炎性巨噬细胞的激活，是新型抗炎药物研发的新思路之一。
山鸡椒Litsea cubeba，为樟科木姜子属Litsea植物。该科多种植物是我国重要的药用资源，常用于炎症疾病的治疗。例如：木姜子L.pungens和宜昌木姜子L.ichangensis均用于风寒湿痛、跌打肿痛和食积气滞的治疗，外用于疮毒肿痛；豺皮樟L.rotundifolia对风湿性关节炎、腰腿疼、痛经和消化不良有疗效[6]。瑶山润楠M.yaoshansis是瑶族常用的草药，用于治疗各种皮肤病和风湿性疾病、疮毒等；滇润楠M.yunnanensis用来治疗风湿、烧烫伤、腮腺炎等；红楠M.thunbergii用于风湿痹痛、风寒感冒、麻疹和湿疹的治疗[7-9]。山鸡椒全株可入药，其干燥成熟果实又称毕澄茄，根又称豆豉姜，均收载于2015版《中国药典》[10]，具有祛风除湿，理气止痛之功效，主治风湿痹痛、跌打损伤及脑血栓等，临床疗效非常显著[11-12]。本发明中的化合物为从传统中药山鸡椒中分离获取得到的具有明显抗炎作用的新型天然产物。到目前为止，本发明涉及的新型异喹啉类生物碱及其衍生物，目前尚无其他研究小组从山鸡椒或其他动植物及微生物中分离得到或通过化学合成及生物合成等方法制备得到；更无人报道这些化合物或其衍生物具有抗炎的功能。
参考文献：
[1]Matzinger,P.,The dangermodel:Arenewedsense ofself.Science 2002,296,301-305.
[2]Robbins,G.R.；Wen,H.；Ting,J.P.,Inflammasomes andmetabolicdisorders:old genes inmodern diseases.Molecular Cell2014,54(2),297-308.
[3]Yitong Liu,et al.Aspirin inhibits LPS-induced macrophageactivation via the NF-κBpathway.SciRep,7,11549.(2017).
[4]Gordon S,et al.Monocyte andmacrophage heterogeneity.NatRevImmunol.5,953-964.(2005).
[5]Gordon S.Macrophageheterogeneity andtissue lipids.J ClinInvest.117,89-93.(2007).
[6]严小红；张凤仙；谢海辉；魏孝义.,木姜子属化学成分研究概况.热带亚热带植物学报2000,8(2),171-176.
[7]刘波；刘明韬；甘茂罗；赵峰；吴秀丽；于洋；岳正刚；林生；王素娟；朱承根；石建功,瑶山润楠根的化学成分研究.中国中药杂志2012,37(9),1227-1231.
[8]江香梅；俞湘,红楠及其研究进展.江西农业大学学报2001,23(2),231-235.
[9]徐振东；杨曼；胡蝶；丁琼；费永俊,润楠属主要树种的资源状况、研究现状和开发利用前景.长江大学学报(自然科学版)2016,13(3),13-17.
[10]中国药典,一部.2015,235.
[11]张水英；郭强；高小力；郭志琴；赵云芳；柴兴云；屠鹏飞,樟科药用植物山鸡椒的化学成分和药理活性研究进.中国中药杂志2014,39(5),769-776.
[12]中国科学院昆明植物所云南植物志编辑委员会,云南植物志.第三卷.北京：科学出版社.2003.
发明内容
本发明第一方面提供了一种异喹啉生物碱类化合物，所述的化合物的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003018581360000031
其中：
R1为CH3；R2为H或CH3；R3为H，CH3，OCH3或OH；或
R1为CH3；R2为OCH3；R3为H，CH3或OH。
进一步，所述的化合物为7-羟基-6-甲氧基-1-甲基-3,4-二氢异喹啉2-氧化物，结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0003018581360000032
本发明第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括从山鸡椒中提取所述的异喹啉生物碱类化合物。
进一步，所述的方法包括如下步骤：
(1)将山鸡椒回流提取，浓缩得浸膏；
(2)向(1)中的浸膏加入水，再加入溶剂萃取，收集水相部位；
(3)将(2)中的水相部位上大孔树脂，分别用水、乙醇水溶液洗脱，收集乙醇部位；
(4)从(3)中的乙醇部位分离出所述的化合物。
本文中所述的大孔树脂包括非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型的树脂，包括但不限于HP20、D4020、S-8、HZ-806、D4006、X-5、NKA-II、NKA-9。
进一步，步骤(1)中所述的回流提取为乙醇回流提取。
进一步，所述的溶剂包括低级性溶剂。
进一步，所述的低级性溶剂包括烷烃类、酯类或醚类溶剂。
进一步，所述的酯类溶剂为乙酸乙酯。
进一步，步骤(3)中所述的乙醇水溶液为30％乙醇水溶液。
进一步，步骤(4)中所述的分离的方法包括色谱法、质谱法。
进一步，所述的分离的方法为色谱法。
进一步，所述的色谱法包括如下步骤：将步骤(3)中所述的乙醇部位经反向中压色谱，甲醇水溶液洗脱，洗脱液减压浓缩得到浸膏组分B；将组分B经Sephadex LH-20柱色谱，甲醇洗脱得到组分B1；将B1经反相半制备液相氰基柱纯化得到所述的化合物。
进一步，所述的甲醇水溶液洗脱包括先用5％甲醇水溶液洗脱，再用30％甲醇水溶液洗脱。
本发明第三方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物或其药学上可接受的盐。
进一步，所述的药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、注射剂、酒剂、膏剂、外用散剂、外用膜剂、外用贴剂或凝胶剂。
本发明所述的化合物可以单独与其他任何中西药物或食品按任意比例配伍用于制备药物、营养制品或功能性食品。
“包含”或“包括”或“具有”无论在本文中何处使用都不意味着仅限于该术语后面所述的要素，而是包括一种或多种未特别提及的具有或没有功能重要性的其它成分，即所列的步骤、要素或选项无需穷尽。与此相比，可以使用“含有”，其中要素限于“含有”后面具体的那些。
本发明所述的药物组合物还包含有效量的用于抗菌、预防或治疗炎症相关疾病、抗肿瘤、抗菌、镇痛、调节免疫功能、抗血小板凝聚、抗心律失常或降压的药物及药学上可接受载体和/或辅料。
本文中使用的术语“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。
本文中使用的术语“药学上可接受载体和/或辅料”，是指这样的载体和/或辅料，其并不引起对生物体的显著刺激，并且并不废除所给予化合物的生物活性和性质。
进一步，所述的药物组合物与用于抗菌、预防或治疗炎症相关疾病、抗肿瘤、抗菌、镇痛、调节免疫功能、抗血小板凝聚、抗心律失常或降压的药物可以制备成单独的制剂联合应用，也可将两者制备成一种制剂以组合物的形式应用。
进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物(例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油)，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液，诸如此类的也可加入其中，适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。
本发明的所述的药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
本文中使用的术语“赋形剂”，是指惰性物质，其被加入药物组合物用来进一步促进活性成分的给予。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
本文中所述的异喹啉生物碱又称苄基异喹啉生物碱，这一类生物碱的特点是具有异喹啉骨架。异喹啉类生物碱类药物有多方面的生物活性，包括抗肿瘤、抗菌、镇痛、调节免疫功能、抗血小板凝聚、抗心律失常、降压等。
本发明第四方面提供了如下任一项所述的应用：
(1)本发明第一方面所述的的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备抗炎药物中的应用；
(2)本发明第一方面所述的的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备预防或治疗炎症相关疾病的药物中的应用；
(3)本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备镇痛药物中的应用；
(4)本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备抗菌药物中的应用；
(5)本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用；
(6)本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备调节免疫药物中的应用；
(7)本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备降压药物中的应用；
(8)本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备抗血小板凝集药物中的应用；
(9)本发明第一方面所述的异喹啉生物碱类化合物或本发明第三方面所述的药物组合物在制备抗心率失常药物中的应用。
本发明中使用的术语“炎症”是指一个针对生理、化学或生物剂导致的创伤或异常刺激而产生的、受影响的血管和邻近组织的细胞和化学反应的基础常规复合过程。炎症通常会导致体液和血细胞在创伤部位的累积，这通常为一个愈合过程。如果没有炎症过程，伤口和感染将不能愈合，而且组织的渐进性损伤可能会威胁生命。
本发明所述的炎症相关疾病包括急性炎症相关疾病、慢性炎症相关疾病。
本文中使用的术语“急性炎症”，根据常规的医疗用语，指的是发生快速并伴有严重症状的炎症。发病的持续时间，从患者的正常状态到炎症症状非常明显的状态，通常会持续达72小时。急性炎症与慢性炎症相反，慢性炎症是一个长期的炎症状态，这指的是一种变化很小或进展缓慢的疾病。对医学领域内人员而言急性和慢性的区别是熟知的。
急性炎症相关疾病包括但不限于乳腺炎、呼吸疾病、滞留胎盘膜、子宫炎、子宫积脓、肠炎、肝炎、肾炎、败血症、冻疮、梗阻性肠道疾病、肠绞痛、盲肠扭转、内毒素血症、流行性出血热，钩端螺旋体病、鼠疫、肾结核、输尿管结核、膀胱结核、淋巴管炎、菌血症、毒血症、败血症、脓毒败血症、盆腔炎、阴道炎、宫颈炎、尿道炎、结膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、中心性视网膜炎、外耳炎、急性化脓性中耳炎、乳突炎、迷路炎、慢性鼻炎、急性鼻炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、接触性皮炎、皮肤神经机能病、糖尿病性多发性神经炎、多肌炎、骨化性肌炎、退化性关节炎、类风湿关节炎、肩周炎和变形性骨炎。
慢性炎症相关疾病包括但不限于类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、白塞病、硬皮病、幼年特发性关节炎、牛皮癣、慢性胰腺炎、腹腔疾病、桥本氏甲状腺炎\克罗恩病、红斑狼疮、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎和血管炎。
本文中所述的“菌”包括致病菌，致病菌是一类可以侵犯机体引起感染甚至传染病的微生物。致病菌包括但不限于脑膜炎奈瑟球菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、肺炎克雷白菌、沙雷菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、布氏杆菌、芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌属、肺炎链球菌、肠球菌、产单核李斯特菌、产气荚膜菌、淋病奈瑟球菌、肺炎克雷白菌、沙雷菌、大肠埃希菌、变形杆菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肠球菌、链球菌、卡塔莫拉峻、脑膜炎奈瑟球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷白菌、假单胞菌、军团菌、多杀巴斯德菌、白喉棒状杆菌、结核分枝杆菌、放线菌、诺卡菌、结核分支杆菌。
本文中使用的术语“肿瘤”是指机体细胞在内外致瘤因素长期协同作用下导致其基因水平的突变和功能调控异常，从而促使细胞持续过度增殖并导致发生转化而形成的新生物。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。良性肿瘤包括但不限于脂溢性角化病肿瘤、光化性角化病肿瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、肝血管瘤、胃肠息肉、神经纤维瘤、皮脂腺囊肿、甲状腺乳头状瘤、错构瘤、肾囊肿、骨囊肿、骨软骨瘤、骨瘤、表皮痣、老年疣、基底细胞瘤、表皮囊肿、粟丘疹、皮样囊肿、毛鞘囊肿、毛囊痣、皮脂腺毛囊瘤、毛发上皮瘤、毛鞘瘤、皮脂腺痣、大汗腺痣、汗管瘤、圆柱瘤、皮肤混合瘤、皮肤纤维瘤、皮赘、瘢痕疙瘩、肥大性瘢痕、粘液样囊肿、皮肤不典型纤维黄色瘤、血管瘤、单侧痣样毛细血管扩张、化脓性肉芽肿、淋巴管瘤、脂肪瘤、冬眠瘤、平滑肌瘤、神经瘤、胃平滑肌瘤、胃腺肌瘤、胃纤维瘤、胃神经纤维瘤、乳头状瘤、腺瘤。恶性肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、鼻咽癌、白血病、淋巴癌、卵巢癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、皮肤癌、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病、威尔姆氏瘤、枯根勃士瘤、尤文氏瘤、恶性血管内皮细胞瘤、乳房派杰氏病、鳞状细胞癌、基底细胞癌、尿路上皮癌、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、恶性淋巴瘤、精原细胞瘤、何杰金氏病。
本发明的化合物可采用本领域已知的或者本文公开的途径给药。给药途径包括但不局限于下述几种：外用(包括眼、鼻)；吸入(包括气管内、口腔内、过皮或皮外的乳化剂或喷雾剂)；口服；注射或点滴(包括静脉、动脉、皮下腹腔或肌肉内)；颅内给药(包括鞘膜、脑室内)。
本发明的有益效果
基于山鸡椒的传统用途，本发明分离得到异喹啉生物碱类化合物或其药学上可接受的盐，该化合物或其药学上可接受的盐可用于抗炎、预防或治疗炎症相关疾病、抗肿瘤、抗菌、镇痛、调节免疫功能、抗血小板凝聚、抗心律失常或降压。
附图说明
图1是式(Ⅱ)化合物干预后斑马鱼尾部伤口处早期的炎性巨噬细胞募集情况及局部组织中的TNF-α,iNOS及IL-1β的表达量变化实验结果图。其中，图A是式(Ⅱ)化合物干预后斑马鱼伤口局部组织中巨噬细胞的荧光变化实验结果图；图B是式(Ⅱ)化合物干预后斑马鱼伤口局部组织中巨噬细胞募集数量统计图；图C是式(Ⅱ)化合物干预后斑马鱼伤口局部组织中iNOS的相对表达量变化实验结果图；图D是式(Ⅱ)化合物干预后斑马鱼伤口局部组织中TNF-α的相对表达量变化实验结果图；图E是式(Ⅱ)化合物干预后斑马鱼伤口局部组织中IL-1β的相对表达量变化实验结果图。
图2是式(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的巨噬细胞TNF-α及IL-1β的分泌量变化实验结果图。其中，图A是式(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的巨噬细胞TNF-α的分泌量变化实验结果图；图B是式(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的巨噬细胞IL-1β的分泌量变化实验结果图。
图3是式(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的iNOS表达量变化实验结果图。其中，图A是式(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的巨噬细胞iNOS的相对表达量变化实验结果图；图B是式(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的原代巨噬细胞iNOS的相对表达量变化实验结果图；图C是Westernblot检测式(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS的表达量变化实验结果图；图D是Western blot检测式(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的原代巨噬细胞iNOS的表达量变化实验结果图；图E是免疫组化检测(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS的表达量变化实验结果图；图F是免疫组化检测(Ⅱ)化合物干预后LPS诱导的原代巨噬细胞iNOS的表达量变化实验结果图。
图4是式(Ⅱ)化合物干预后M1型巨噬细胞的激活情况及对下游分子机制的验证实验结果图。其中，图A是通过模拟靶点对接计算预测与式(Ⅱ)化合物相关的信号通路实验结果图；图B是Westernblot检测式(Ⅱ)化合物和/或IκK抑制剂干预后LPS诱导的巨噬细胞iNOS和IκK表达量变化实验结果图；图C是Western blot检测式(Ⅱ)化合物和/或iNOS抑制剂干预后LPS诱导的巨噬细胞iNOS表达量变化实验结果图；图D是式(Ⅱ)化合物和/或iNOS抑制剂干预后LPS诱导的巨噬细胞NO分泌量变化实验结果图；图E是式(Ⅱ)化合物和/或IκK抑制剂干预后LPS诱导的巨噬细胞NO分泌量变化实验结果图；图F是式(Ⅱ)化合物和/或IκK抑制剂干预后LPS诱导的巨噬细胞IL-1β分泌量变化实验结果图；图G是式(Ⅱ)化合物和/或iNOS抑制剂干预后LPS诱导的巨噬细胞IL-1β分泌量变化实验结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。
实施例1式(Ⅱ)化合物的制备及结构解析
1、式(Ⅱ)化合物的制备方法
山鸡椒12kg，阴干粉碎，用95％乙醇回流提取3次，每次3h，提取液减压浓缩得浸膏，加去离子水2000mL，乙酸乙酯萃取5次，每次2000mL，水相部位直接上大孔树脂，分别用水，30％乙醇-水(等于体积浓度30％的乙醇水溶液，以下同)依次洗脱洗脱，减压回收溶剂得相应洗脱部位。30％乙醇部位(35.4g)经反相中压柱色谱，5％甲醇-水、30％甲醇-水洗脱，其中30％甲醇-水洗脱液减压浓缩得到浸膏组分B。组分B经Sephadex LH-20柱色谱，用甲醇洗脱，得到组分B1。组分B1经硅胶柱色谱用二氯甲烷-甲醇15∶1、10：1分别洗脱)，得到组分B1-1。组分B1-1经反相半制备液相氰基柱纯化(5％乙腈/水，流速2ml/min，检测波长254nm)得化合物(8.6mg，tR＝16.8min)。
2、式(Ⅱ)化合物的结构解析
通过理化常数和现代波谱学手段(MS、NMR)，结合文献相关数据，鉴定了式(Ⅱ)化合物的结构。
式(Ⅱ)化合物的理化性质及波谱特征：
紫红色粉末；HR-ESI-MS：m/z 208.09669[M+H]+(calcd for C11H14NO3，208.09682)；IR(KBr)Cor C318.2，2920.2，2850.8，1702.9，1601.9，1516.5，1454.6，1431.6，1388.8，1285.3，1210.0，1142.5，1034.4，854.3，808.3；1HNMR(600MHz，DMSO)和13CNMR(150MHz，DMSO)数据见表1。
表1化合物11H NMR(600MHz)数据(DMSO中测定)
Figure BDA0003018581360000111
实例2化合物显著抑制LPS诱导的炎性巨噬细胞
1、实验方法
体内实验中摸索斑马鱼对化合物静脉注射的最大耐受量(MTD)，随后根据实验结果建立斑马鱼断尾模型并给予不同浓度梯度的化合物，在术后26h时观察伤口局部组织中的巨噬细胞募集数量及巨噬细胞的荧光表达强度，并与同剂量经典抗炎阳性对照药地塞米松的药效进行对比。
体外实验中分别提取培养小鼠原代巨噬细胞及巨噬细胞系RAW264.7，利用real-time PCR，Western blot，ELISA，免疫组化等手段探讨不同浓度的化合物对LPS诱导的M1型巨噬细胞标记物iNOS，TNF-α及IL-1β表达的影响，并筛选出化合物体外作用的最佳有效浓度，用于后续分子机制的研究。
在最佳有效浓度化合物的干预下，利用模拟靶点对接计算手段、Westernblot及iNOS活性试剂盒和NO分泌试剂盒探讨化合物作用的通路和靶点，并进一步利用IκK抑制剂及iNOS抑制剂对化合物的作用靶点进行验证。
2、实验结果
20ng/尾(MTD)的化合物可以在体内有效抑制斑马鱼尾部伤口处早期的炎性巨噬细胞募集和激活，并抑制了局部组织中的TNF-α，iNOS及IL-1β的表达(如图1(图中*表示P<0.05,**表示P<0.01)、表2、表3所示)。在体外实验中，100nM的化合物有效的抑制了LPS诱导的巨噬细胞激活，并下调了包括iNOS，TNF-α及IL-1β的表达(如图2(图中*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)、图3(图中**表示P<0.01,***表示P<0.001)、表4、表5、表6所示)。通过模拟对接结果，iNOS活性检测，NO分泌量检测以及Western blot的检测，证实化合物通过抑制NFκB信号通路抑制了M1型巨噬细胞的激活，从而抑制了一系列炎症因子的表达，并可以进一步通过直接对接抑制iNOS蛋白酶的活性，抑制NO的生成，从而进一步达到抑制炎症的效果(如图4所示，图中N表示P>0.05,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)。实验图中，C表示对照组、LPS表示LPS诱导组、W1a表示化合物组。
表2体内注射化合物后断尾处巨噬细胞数量变化(表中P值为实验组与断尾模型对照组进行比较)
Figure BDA0003018581360000121
表3体内注射化合物后断尾处组织内各炎症因子相对表达量(表中P值为实验组与断尾模型对照组进行比较)
Figure BDA0003018581360000131
表4体外不同浓度化合物干预后M1巨噬细胞标志物iNOS相对表达量(表中P值为化合物组与LPS诱导组进行比较)
Figure BDA0003018581360000132
表5体外化合物干预后抑制LPS诱导的巨噬细胞IL-1β分泌量(表中P值为化合物组与LPS诱导组进行比较)
Figure BDA0003018581360000133
表6体外化合物干预后抑制LPS诱导的巨噬细胞TNF-α分泌量(表中P值为化合物组与LPS诱导组进行比较)
Figure BDA0003018581360000134
通过实验结果可知，本发明涉及的化合物可用于抗炎、预防或治疗炎症相关疾病。
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。

Claims (6)

1.一种异喹啉生物碱类化合物，其特征在于，所述的化合物的结构式如式（I）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）。
2.一种制备权利要求1所述的异喹啉生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
（1）将山鸡椒回流提取，浓缩得浸膏；
（2）向（1）中的浸膏加入水，再加入溶剂进行萃取，收集水相部位；
（3）将（2）中的水相部位上大孔树脂，分别用水、乙醇水溶液洗脱，收集乙醇部位；
（4）从（3）中的乙醇部位分离出所述的化合物；
步骤（1）中所述的回流提取为乙醇回流提取；
步骤（2）中所述的溶剂为乙酸乙酯；
步骤（4）中所述的分离的方法为色谱法，所述的色谱法包括如下步骤：将步骤（3）中所述的乙醇部位经反向中压色谱，甲醇水溶液洗脱，洗脱液减压浓缩得到浸膏组分B；将组分B经Sephadex LH-20柱色谱，甲醇洗脱得到组分B1；将B1经反相半制备液相氰基柱纯化得到所述的化合物，所述的甲醇水溶液洗脱为依次使用5%甲醇水溶液、30%甲醇水溶液洗脱。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的乙醇水溶液为30%乙醇水溶液。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1所述的异喹啉生物碱类化合物及其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、注射剂、酒剂、膏剂、外用散剂、外用膜剂、外用贴剂或凝胶剂。
6.权利要求1所述的异喹啉生物碱类化合物或权利要求4或5所述的药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
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