CN107759653B

CN107759653B - 一类三萜化合物、其制备方法及用途

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Publication number: CN107759653B
Application number: CN201610674266.3A
Authority: CN
Inventors: 岳建民; 左建平; 范耀月; 唐炜; 吴艳
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2036-08-16
Also published as: CN107759653A

Abstract

本发明涉及如下所示的一类三萜化合物及其制备方法和用途。该类化合物经多次体外免疫抑制活性测试具有明显的抑制小鼠淋巴细胞增殖的作用，有望在制备免疫抑制药物中应用。本发明可为研制新的治疗自身免疫疾病和器官移植排斥反应等方面的药物提供先导化合物。

Description

一类三萜化合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于药物应用技术领域，具体涉及一类骨架较稀有的三萜化合物，以及该类化合物的制备方法和在制备具有强效免疫抑制作用的药物中的用途。

背景技术

人类免疫功能的失调可导致多种疾病的产生，如红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症、干燥综合症和自身免疫性肝炎等。随着基础和临床免疫学的发展，许多原因不明的疾病也可以通过自身免疫反应来解释。自身免疫反应不仅能导致自身免疫疾病的产生，而且其本身存在恶性循环，可使疾病迁延不愈，预后不良。一直以来，人们主要应用免疫耐受的原理，采用免疫抑制剂来治疗自身免疫疾病，并且在改善症状方面取得了一定的效果。另一方面，随着外科手术技术的改进和治疗水平的提高，器官移植日渐普及，免疫抑制剂在器官移植排斥反应的预防和治疗中起着极其重要的作用。

免疫抑制剂(Immunosuppressor)是对免疫有抑制作用的药物，目前已广泛用于器官移植、抗排斥反应、自身免疫性疾病、新生儿的Rh溶血和过敏反应的治疗。目前临床应用的免疫抑制剂主要分为以下几种：(1)化学制剂类，如烷化剂类的氮芥；(2)激素类，如糖皮质激素；(3)真菌代谢产物，如环孢素A(Cyclosporin A,CsA)；(4)中药及其有效成分，如雷公藤、红花。大部分免疫抑制药物对免疫的多个环节均有抑制作用，使其具有明显的毒副作用，主要是骨髓抑制，肝、肾毒性等。长期应用还可能导致机体的免疫功能下降，并且可能提高肿瘤发病率。因此，寻找新的高效低毒的免疫抑制剂具有重要意义。

中药是我国传统文化的瑰宝。随着现代医药技术的不断发展，中药的应用和研究又爆发出新的生命力。对中药的现代医学研究主要是从中药中提取有效部位和单体成分。目前已发现一些有免疫抑制作用的中药，如雷公藤、红花、青藤、山茱萸、白芍。同时，天然产物具有结构骨架多样性的特点，使其成为药物先导结构的重要来源之一。

大戟科叶下珠属植物全世界共有600多种，主要分布于热带及温带地区。我国有33个种4个变种，主要分布于长江以南各省区，北方较罕见，是传统的中草药，有平肝清热、利水解毒之功效，民间常用来治疗痢疾、腹泻、肠炎、肾炎水肿、黄疸性肝炎、尿路感染和小儿疳积，糖尿病和乙型肝炎等疾病。近年来，学者们对该属植物的兴趣大大增加，并在其化学和药理性质以及临床研究方面有了实质性的进展。海南叶下珠(PhyllanthushainanensisMerr.)也是叶下珠属的一种，产于海南三亚、白沙、保亭、东方、昌江等地，生于低海拔山地疏林下或灌木丛中。

发明内容

本发明涉及的化合物为一类骨架非常稀有的三萜化合物，在免疫抑制生物学实验中，被发现对小鼠的淋巴细胞增殖具有强效抑制作用，由此可能对免疫系统疾病具有治疗作用，从而在制药领域有巨大的潜在用途。

本发明的一个目的是提供一类具有药用价值的三萜化合物。

本发明的另一目的是提供一种从海南叶下珠植物中提取本发明化合物的方法。

本发明进一步的目的是提供一种治疗免疫性疾病的药物组合物。

本发明的另一目的是提供上述化合物和组合物在制备免疫抑制药物方面的用途。

本发明通过对大量植物提取物和天然单体化合物的筛选中，从一大戟科叶下珠属的植物海南叶下珠中分离出三种三萜化合物，所述三萜化合物的结构特征是达玛烷骨架三萜的侧链形成螺环片段(1,6-dioxaspiro[4.4]nonan-2-one)，尤其是其A环上延伸连接了一个四元环接五元环的新颖螺环片段(3H-spiro[benzofuran-2,1'-cyclobutan]-3-one)的一类非常稀有的碳骨架。

本发明一方面提供选自以下化合物的三萜化合物：

本发明另一方面提供了所述三萜化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)干燥的海南叶下珠全草粉末用乙醇室温提取，提取液蒸去乙醇得浸膏；

(2)向步骤(1)中的浸膏中加入乙酸乙酯和水溶解，分液，有机相蒸干后得粗提物，所述粗提物在大孔吸附树脂柱(MCI)上用体积比为约3:7～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用约80％v/v甲醇-水混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3；

(3)将步骤(2)中的组分F3通过正相硅胶柱分离，用体积比为约10:1～1:2的石油醚-丙酮混合溶剂进行洗脱，收集用体积比为约4:1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e，收集用体积比为约3:1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3f；

(4)将步骤(3)中的组分F3e过反相柱，用体积比为约1:1～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用约80％v/v甲醇-水混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e4；将组分F3e4过正相硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行洗脱，收集用体积比为约80:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e4b；组分F3e4b经过高效液相色谱(HPLC)，用约65％v/v乙腈-水混合溶剂等度洗脱，得到化合物H-2；或

将步骤(3)中的组分F3f过反相柱，用体积比为约1:1～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用约70％v/v甲醇-水混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3f2；将组分F3f2经过凝胶柱层析纯化，然后经高效液相色谱(HPLC)，用约65％v/v乙腈-水混合溶剂等度洗脱，得到化合物H-1和H-3。

在上述方法中，步骤(1)中所述的乙醇可以为约70％v/v以上的乙醇水溶液，优选为约85％v/v以上的乙醇水溶液，更特别为约95％v/v以上的乙醇水溶液；室温提取的时间没有特殊限制，例如可以为4小时以上，10小时以上，或24小时以上；提取可以进行一次或多次，例如1、2、3次或3次以上。

步骤(4)中所述反相柱可以为C18反相柱或C8反相柱，优选为RP-18柱；所述的凝胶柱层析可以使用购买自GE-Healthcare公司的SephadexLH-20；所述的高效液相色谱可以为半制备HPLC。

本发明的三萜化合物在小鼠淋巴细胞的非特异性毒性作用及增殖反应实验中，显示出很强的抑制小鼠淋巴细胞增殖的作用，且活性与临床上使用的环孢素A相当甚至强好多倍。

本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其采用选自上述三萜化合物中的一种或多种作为原料，包含治疗有效量的选自上述三萜化合物中的一种或多种作为活性成分，该组合物可以进一步包括药剂学上可接受的药物辅料，例如载体、赋形剂、佐剂和/或稀释剂等。所述药物组合物可以用作免疫抑制剂，例如T细胞增殖抑制剂和/或B细胞增殖抑制剂，用于治疗例如自身免疫疾病和器官移植排斥反应等。

本发明的又一方面提供了上述三萜化合物或药物组合物用于制备免疫抑制药物的用途。所述免疫抑制药物，例如为T细胞增殖抑制剂和/或B细胞增殖抑制剂。

本发明的又一方面提供了一种治疗自身免疫疾病和器官移植排斥反应的方法，所述方法包括向需要该治疗的对象给药治疗有效量的选自上述三萜化合物中的一种或多种或者上述药物组合物。

有益效果

基于该类三萜化合物在化学结构新颖、生物活性显著等方面的优点，使其具有很好的开发前景，有望发展成为结构新颖的针对性治疗自身免疫疾病和器官移植排斥反应等方面的药物。

附图说明

图1a是本发明化合物H-1的¹H-¹H COSY(-)和HMBC(H→C)图；

图1b是本发明化合物H-1的

图；

图2a是本发明化合物H-2¹H-¹H COSY(-)和HMBC(H→C)图；

图2b是本发明化合物H-2的

图；

图3a是本发明化合物H-3的¹H-¹H COSY(-)和HMBC(H→C)图；

图3b是本发明化合物H-3的

图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明化合物的制备步骤和药理实验过程。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围，本领域的技术人员可以对此做出种种修改和变化。

海南叶下珠全草采自海南，经阴干后粉碎制成海南叶下珠全草粉末；除非另有规定，否则原料通常是从市售来源可获得的，比如95％乙醇(分析纯，上海化学试剂公司)；乙酸乙酯(分析纯，上海化学试剂公司)；二氯甲烷(分析纯，上海化学试剂公司)；甲醇(分析纯，上海化学试剂公司)；石油醚(60-90℃，分析纯，上海化学试剂公司)；丙酮(分析纯，上海化学试剂公司)。除非另有说明，所有温度以℃(摄氏度)表示，室温或环境温度是指20～25℃。

化合物的结构通过核磁共振谱(NMR)和/或质谱(MS)来确定。核磁共振氢谱位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。核磁共振氢谱用Bruker(AV-400)400MHz型核磁共振仪测定，用氘代氯仿(CDCl₃)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标。

高分辨质谱采用LCT Premier XE质谱仪(Waters,Milford,MA,U.S.)测定，如果描述含氯或溴的离子的强度，则观察到预计的强度比，且仅给出较低质量的离子的强度。

层析柱一般使用200～300目硅胶为载体；

反相柱为购买自Merck公司的RP-18；

凝胶柱层析购为买自GE-Healthcare公司的Sephadex LH-20；

大孔吸附树脂柱(MCI)为购买自Merck的CHP 20P型；

半制备HPLC为购买自Waters。

半制备HPLC测定条件

色谱紫外检测仪：Waters2489

色谱双相泵：Waters1525

色谱柱:YMC C18柱5μm,10×250mm

色谱条件:

流动相A：水溶液

流动相B：乙腈溶液

进样量：20μL，流速：3.0mL/min，柱温:室温，检测波长：210和254nm。

实施例1 本发明中化合物的制备

干燥的海南叶下珠全草粉末(5Kg)用95％乙醇室温提取3次，蒸去乙醇得300g浸膏。该浸膏用乙酸乙酯和水溶解，分液，有机相蒸干后得103g粗提物。该粗提物在MCI柱上用体积比为3:7～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用80％v/v甲醇-水混合溶剂洗脱的洗脱液得到10g组分F3。

组分F3经正相硅胶柱分离，用体积比为10:1～1:2的石油醚-丙酮混合溶剂进行洗脱，收集用体积比为4:1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e，收集用体积比为3:1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3f。

组分F3e过RP-18反相柱，用体积比为1:1～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用80％v/v甲醇-水混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e4；将组分F3e4过正相硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行洗脱，收集用体积比为80:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e4b；组分F3e4b经半制备HPLC，用65％v/v乙腈-水混合溶剂等度洗脱，得到化合物H-2(2.6mg)。

组分F3f过RP-18反相柱，用体积比为1:1～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用70％v/v甲醇/水混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3f2；将组分F3f2经过Sephadex LH-20凝胶柱层析纯化，然后经半制备HPLC，用65％v/v乙腈-水混合溶剂等度洗脱，得到化合物H-1(2.9mg)和H-3(2.1mg)。

化合物的部分理化数据如下：

H-1：分子式：C₄₀H₄₄O₁₀，分子量：684，白色粉末；[α]_D ²⁵＝+3.3(c＝0.60，CHCl₃)；¹H和¹³C NMR数据见表1和表2；IR(KBr):ν_max＝3491cm^-1(O-H)，1747，1721cm^-1(C＝O)；UV/Vis(EtOH):λ_max(logε)＝215.0(4.03),253.2(3.51)nm；CD(EtOH):λ(ε)＝221(10.96)，241(1.12)，290(2.31)，330(0.68)，350(1.52)nm；LRESI(±)MS：m/z 685.4[M+H]⁺,729.5[M+HCO₂]^-HRESI(±)MS：m/z 729.2922[M+HCO₂]^-(C₄₁H₄₅O₁₂理论值为729.2911)。

H-2：分子式：C₄₃H₅₀O₁₁，分子量：742，白色粉末；[α]_D ²⁵＝+19.1(c＝0.83，CHCl₃)；¹H和¹³C NMR数据见表1和表2；IR(KBr)：ν_max＝3425cm^-1(O-H)，1783，1712cm^-1(C＝O)；UV/Vis(EtOH)：λ_max(logε)＝219(4.29)，253(3.80)nm；CD(EtOH)：λ(ε)＝222(24.67)，241(2.19)，284(4.38)，330(2.13)，351 3.09)nm；LRESI(±)MS：m/z 743.4[M+H]⁺，787.9[M+HCO₂]^-；HRESI(+)MS：m/z 765.3237[M+Na]⁺(C₄₃H₅₀O₁₁Na理论值为765.3245)。

H-3:分子式：C₃₈H₄₂O₉，分子量：642；白色粉末；[α]_D ²⁵＝10.3(c＝0.90，CHCl₃)；¹H和¹³C NMR数据见表1和表2；IR(KBr)：ν_max＝3438cm^-1(O-H)，1765，1712cm^-1(C＝O)；UV/Vis(EtOH)：λ_max(logε)＝218(4.08),254(3.58)nm；CD(EtOH)：λ(ε)＝222(25.36)，241(2.09)，284(4.38)，330(2.71)，351(3.40)nm；LRESI(±)MS：m/z 643.3[M+H]⁺，687.8[M+HCO₂]^-HRESI(±)MS：m/z 687.2826[M+HCO₂]^-(C₃₉H₄₃O₁₁理论值为687.2805)。

同时，化合物H-1、H-2和H-3的化学结构通过二维H-H相关谱(DQF-COSY)、H-C相关谱(HMQC)、H-C远程相关谱(HMBC)以及旋转坐标系NOE谱(ROESY)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构，化合物H-1、H-2和H-3的HMBC和ROESY谱见图1-3。

表1化合物H-1–H-3的¹H NMR数据(CDCl₃，400MHz)

表2.化合物H-1–H-3的¹³CNMR数据(CDCl₃,125MHz)

实施例2 本发明中化合物的体外免疫抑制活性测试

对实施例1的化合物H-1、H-2和H-3的体外免疫抑制活性进行测试。

刀豆蛋白A(ConA)、细菌脂多糖(LPS)、CCK-8试剂盒以及RPMI 1640培养液购买于美国的Gibco BRL生物制剂公司。³H-胸腺嘧啶核苷酸购买于上海原子能研究所。

实验原理：(1)T、B淋巴细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。刀豆蛋白A(ConA)和细菌脂多糖(LPS)是一种丝裂原，可分别刺激T、B淋巴细胞发生增殖和分化，这一过程与体内淋巴细胞的活化过程相似，因此，丝裂原诱导的淋巴细胞增殖常被用来作为评价淋巴细胞功能的指标。[³H]-胸腺嘧啶脱氧核苷(³H-TdR)掺入法是一种用来检测细胞增殖的方法，反映细胞DNA的合成。在细胞培养基中加入氚(³H)标记的DNA前身物质胸腺嘧啶核苷(TdR)，则³H-TdR被作为合成DNA的原料被摄入细胞，掺入到新合成的DNA中。根据同位素掺入细胞的量可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位素³H，经液体闪烁测量法测出，将³H每分脉冲数(cpm)加以计算，可反映淋巴细胞增殖的程度。(2)CCK-8试剂盒中含有WST–8[其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜染料(Formazan dye)。生成的甲臜物与活细胞的数量成正比，可用于细胞毒性分析。

配制待测样品：将实施例1的化合物H-1、H-2和H-3溶解于DMSO配制成5μM的储备液。

淋巴细胞毒性评价：脊椎法处死小鼠，无菌取其脾脏，磨碎制成单细胞悬液，红细胞裂解液去除红细胞，调节细胞浓度。小鼠脾脏淋巴细胞悬液1×10⁶/孔接种于96孔板，同时加入不同浓度化合物，另设相应的溶媒(DMSO)对照及培养液(RPMI 1640)本底对照，总体积为200μL。在37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养48小时。结束培养前8-10小时加入CCK-8溶液。至培养结束，于酶标仪450nM(参比650nM)处测定光密度(OD)值。

淋巴细胞增殖实验：小鼠脾脏淋巴细胞悬液5×10⁵/孔接种于96孔板，加入ConA(终浓度5μg/mL)或LPS(终浓度10μg/mL)，待测化合物的储备液，使药物测试的浓度为0.01～5μM范围内的5种浓度(0.01，0.05，0.1，0.5，1，5μM)。并设相应的无ConA、LPS对照孔以及无药物对照孔。在37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养48小时。培养结束前8小时，每孔加入25μL ³H-胸腺嘧啶核苷酸(10μCi/mL)。继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪(MicroBeta Trilux，PerkinElmer)读取掺入细胞DNA的³H-TdR量，以cpm值代表细胞增殖的情况。

表3.本发明中化合物的体外免疫抑制活性测试结果

从测试结果(表3所示)可以看出，该类化合物对小鼠淋巴细胞的增殖具有显著抑制作用，其中化合物H-2抑制T淋巴细胞增殖作用与环孢素A相当，而抑制B淋巴细胞增殖作用却是环孢素A的42倍都多。同时，这类化合物与活性之间具有一定的构效关系，为今后的药物结构优化以及改造提供了依据。

这类化合物在制备预防与治疗类风湿关节炎、多发性硬化症、自身免疫性肝炎药物及相关免疫抑制药物中具有很好的开发前景，有望成为一种新型的免疫抑制剂。

Claims

1.选自以下化合物的三萜化合物：

2.权利要求1所述三萜化合物的制备方法，包括以下步骤：

(2)向步骤(1)中的浸膏中加入乙酸乙酯和水溶解，分液，有机相蒸干后得粗提物，所述粗提物在大孔吸附树脂柱上用体积比为3:7～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用80％v/v甲醇-水混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3；

(3)将步骤(2)中的组分F3通过正相硅胶柱分离，用体积比为10:1～1:2的石油醚-丙酮混合溶剂进行洗脱，收集用体积比为4:1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e，收集用体积比为3:1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3f；

(4)将步骤(3)中的组分F3e过反相柱，用体积比为1:1～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用80％v/v甲醇-水混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e4；将组分F3e4过正相硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行洗脱，收集用体积比为80:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3e4b；组分F3e4b经过高效液相色谱，用65％v/v乙腈-水混合溶剂等度洗脱，得到化合物H-2；或

将步骤(3)中的组分F3f过反相柱，用体积比为1:1～1:0的甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，收集用70％v/v甲醇-水混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分F3f2；将组分F3f2经过凝胶柱层析纯化，然后经高效液相色谱，用65％v/v乙腈-水混合溶剂等度洗脱，得到化合物H-1和H-3。

3.一种药物组合物，其采用选自权利要求1所述三萜化合物中的一种或多种作为原料，包含治疗有效量的选自权利要求1所述三萜化合物中的一种或多种作为活性成分。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其进一步包括药剂学上可接受的药物辅料。

5.权利要求1所述的三萜化合物或权利要求3或4所述的药物组合物用于制备免疫抑制药物的用途。

6.权利要求5所述的用途，其中，所述免疫抑制药物为T细胞增殖抑制剂和/或B细胞增殖抑制剂。