CN105675744B - 青钱柳的指纹图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了青钱柳的指纹图谱检测方法，该方法包括供试品溶液的制备、对照品制备、对照指纹图谱的建立和标定指纹图谱对照峰。本发明根据青钱柳中所含萜类、黄酮类、甾体类、鞣质、有机酸和生物碱等活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、洗脱方式、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的青钱柳指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价青钱柳的质量，为保证临床疗效具有重要意义。

Description

青钱柳的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及青钱柳的指纹图谱检测方法。
背景技术
青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja为胡桃科植物青钱柳属，据《中华本草》的记载，具有祛风、消炎止痛和杀虫止痒等功效。民间多以其叶作为药用部分，使用历史悠久。现代研究表明青钱柳叶具有生津止渴、降血糖、降血压、延年益寿等功效，可用于治疗糖尿病、高血压、神经衰弱等。现有文献报道以测定青钱柳中槲皮素和山柰素的含量作为药材质量控制标准，但青钱柳叶中除了含有槲皮素和山柰素外，还含有萜类、黄酮类、甾体类、鞣质、有机酸、生物碱等具有明显生理活性的化学成分。因此仅以槲皮素和山柰素作为青钱柳质量控制指标，存在一定局限性，且在实际使用中真伪易混乱，多与其他胡桃科植物的叶在许多地区被冒充青钱柳入药并在临床上使用，故有必要建立该药材质量的分析评价方法。然而，目前尚没有文献报道有关青钱柳药材HPLC指纹图谱的研究，本发明通过高效液相色谱法，建立青钱柳高效液相色谱指纹图谱，并通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其进行分析，建立对照指纹图谱，从而为区别其他品种及青钱柳的质量控制提供依据，具有重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种青钱柳的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价青钱柳的质量，对控制青钱柳的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现以上技术目的，本发明采取的技术方案为：
青钱柳的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备
精密称定青钱柳药材粉末，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度50～80％甲醇，提取30～60min，取出，取续滤液，分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并萃取液，减压蒸干，甲醇溶解，摇匀并离心，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得青钱柳药材供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备
精密称取山柰素对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，得山柰素的对照品溶液；
(3)高效液相色谱法测定青钱柳的对照指纹图谱
对10个批次的青钱柳药材的供试品溶液，进行高效液相色谱测定，测得各批次青钱柳药材的指纹图谱；
取山柰素对照品溶液进行高效液相色谱测定，测得山柰素对照品的色谱图；以山柰素色谱峰为内参照峰，计算出10批次青钱柳药材各供试品溶液中共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，经国家药典委员会“相似度评价软件(2004A)“比较10批次钱柳药材供试品的色谱图和相对保留时间，以共有指纹峰作为青钱柳药材的对照指纹图谱；
(4)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：将待测青钱柳药材供试品溶液按步骤(3)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(5)将步骤(4)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(3)得到的对照指纹图谱用国家药典委员会“相似度评价软件(2004A)”评价。
作为优选方案，以上所述的青钱柳的指纹图谱检测方法，步骤(1)供试品溶液制备：精密称定青钱柳药材粉末，置具塞锥形瓶中，加入10倍量体积浓度50％甲醇，超声提取30min，取出，取续滤液，分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并萃取液，减压蒸干，甲醇溶解，摇匀并离心，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得青钱柳药材供试品溶液。
作为优选方案，以上所述的青钱柳的指纹图谱检测方法，步骤(2)对照品溶液的制备：精密称取山柰素对照品5.25mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得0.525mg·mL山柰素的对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的青钱柳的指纹图谱检测方法，步骤(3)和步骤(4)高效液相色谱测定的色谱条件为：
色谱柱为Merck C18，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸溶液；梯度洗脱：0～11min，2％～13％A；11～16min，13％～18％A；16～50min，18％～31％A；50～62min，31％～42％A；62～82min，42％～89％A；体积流量：1.0mL·min-1，柱温：35℃，进样量10μL，检测波长：245nm。
作为优选方案，以上所述的青钱柳的指纹图谱检测方法，青钱柳药材指纹图谱中有32个共有指纹峰。
本发明将供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度评价软件(选用中国药典委推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004A版”)计算，获得指纹图谱相似度数值，依据相似度数值，应用于青钱柳的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准；本发明提供的青钱柳的指纹图谱检测方法用于生产检验质量控制，可确保产品安全有效，具有重要意义。
本发明提供的青钱柳指纹图谱检测方法的最佳条件筛选过程：
1、样品提取条件的考察
本发明提取溶剂分别采用了水、乙醇、正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚进行了考察，结果表明，采用体积浓度为50％甲醇提取后再分别用正丁醇和乙酸乙酯萃取得到的图谱的峰的信息最为丰富，所以选择50％甲醇、乙酸乙酯、正丁醇作为提取溶剂。
本发明通过比较超声提取、回流提取、索氏提取方法，考察结果表明，超声提取得到的指纹色谱峰的响应值较大、分离度好，并且在30min基本上能够提取完全，故选择超声30min提取作为样品的提取方法。
2、流动相的选择
本发明考察了以0.1％甲酸-甲醇、0.1％甲酸-乙腈、水-甲醇、水-乙腈、0.1％磷酸-甲醇以及0.1％磷酸-乙腈为流动相，对比结果表明以0.1％甲酸-甲醇、0.1％甲酸-乙腈为流动相时分离基线不平，0.1％磷酸-甲醇、水-甲醇及水-乙腈为流动相时色谱图有拖尾峰，而以乙腈-0.1％磷酸水为流动相时，色谱峰分离效果最佳。因此本发明优选乙腈-0.1％磷酸水为流动相。
3、检测波长的选择
本发明通过全波长扫描和3D等高线筛选，确定245nm为最佳波长，化学成分信息量最大，故选择245nm为最佳检测波长。
4、柱温的选择
本发明分别在25℃、30℃、35℃和40℃柱温下分析青钱柳，实验结果表明，在35℃柱温条件下，色谱峰分离情况最好，柱压也较低，因此，将35℃为最佳柱温条件。
5、色谱柱的选择
本发明通过大量实验筛选了不同的色谱柱，采用以下型号的色谱柱进行测定：
①Merck C18，规格为250mm×4.6mm，5μm
②Alltech C18柱，5μm，4.6mm×250mm
③SUPELCO25cm×4.6mm，5μm，Col:504971 54938-02
④CAPCELL PAK C18M.G 5u 250mm×4.6mm Cat.No:90104 Col.No.03169
⑤Agilent ZORBAX*80A Extend－C18 4.6×250mm 5μ PN:770450-902 SN:USHR003183
筛选实验结果表明，由于青钱柳化学成分复杂，选用Merck C18，规格为250mm×4.6mm，5μm色谱峰分离良好，重现性最好。
有益效果：本发明提供的青钱柳及其原料药材的指纹图谱检测方法具有以下优点：
本发明根据青钱柳中所含的活性成分，包括萜类、黄酮类、甾体类、鞣质、有机酸、生物碱等的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的青钱柳指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价青钱柳的质量为保证临床疗效具有重要意义。
附图说明
图1为青钱柳对照指纹图谱；
图2为对照品山柰素的HPLC图谱；
图3为10批青钱柳样品指纹图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1青钱柳对照指纹图谱的建立及应用
1、仪器与试药
Shimadzu LC-20AD高效液相色谱系统(日本岛津公司)，包括岛津LC-Solusion工作站、在线脱气机、SIL-20A自动进样器、SPD-20A紫外-可见光检测器、CTO-20A柱温箱；BS2242S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
山柰素批号：131009(南京森贝伽生物科技有限公司)，甲醇、磷酸、乙酸乙酯、正丁醇(分析纯，南京维之诚化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，美国天地公司)，水(杭州娃哈哈公司)，10个不同批次青钱柳药材购自不同的药材公司及药材市场，并经南京中医药大学陈建伟教授鉴定，为胡桃科植物青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja，具体来源见表1。
表1青钱柳药材来源
1、青钱柳的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备
步骤(1)供试品溶液制备：精密称定青钱柳药材粉末，置具塞锥形瓶中，加入10倍量体积浓度50％甲醇，超声提取30min，取出，取续滤液，分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并萃取液，减压蒸干，甲醇溶解，摇匀并离心，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得青钱柳药材供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备
精密称取山柰素对照品5.25mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得0.525mg·mL山柰素的对照品溶液；
(3)高效液相色谱法测定青钱柳的对照指纹图谱
对10个批次的青钱柳药材的供试品溶液，进行高效液相色谱测定，测得各批次青钱柳药材的指纹图谱；色谱条件为：色谱柱为Merck C18，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸溶液；梯度洗脱：0～11min，2％～13％A；11～16min，13％～18％A；16～50min，18％～31％A；50～62min，31％～42％A；62～82min，42％～89％A；体积流量：1.0mL·min-1，柱温：35℃，进样量10μL，检测波长：245nm。
取山柰素对照品溶液按上述色谱条件进行高效液相色谱测定，测得山柰素对照品的色谱图，如图2；以山柰素色谱峰为内参照峰，计算出10批次青钱柳药材各供试品溶液中共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，经国家药典委员会“相似度评价软件(2004A)“比较10批次钱柳药材供试品的色谱图和相对保留时间，以32个共有指纹峰作为青钱柳药材的对照指纹图谱，如图1；
(4)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：将10个批次青钱柳药材供试品溶液按步骤(3)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱，如图3；
(5)将步骤(4)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(3)得到的对照指纹图谱用国家药典委员会“相似度评价软件(2004A)”评价。测得各批次样品与共有模式间的具有较高的相似度(10批次相识度均大于0.99)，结果如表1。
表1各批次样品与共有模式间的相似度
2、方法学考察
2.1精密度试验
取同一份青钱柳药材供试品溶液，按上述步骤(3)色谱条件重复进样6次，以山柰素为参照峰，计算出6次色谱峰的各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于1.3％，采用国家药典委员会“相似度评价软件(2004A)”进行评价，相似度为0.99，表明仪器精密度好。
2.2重复性试验
精密称取6份同一批青钱柳的药材粉末5.0g，上述步骤(1)方法平行制得6份供试品溶液，按步骤(3)色谱条件进样，以山柰素为参照峰，计算出6次色谱峰的各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于1.4％，相似度为0.98，表明该方法重复性好。
2.3稳定性试验
取同一份青钱柳药材供试品溶液，按上述步骤(3)色谱条件于0，2，6，12，18，24h进样，以山柰素为参照峰，计算出6次色谱峰的各共有峰相对保留时间的RSD小于1.1％，相对峰面积的RSD小于2.1％，相似度为0.99，表明24h内供试品溶液的成分稳定，符合对指纹图谱的要求。
本发明用指纹图谱技术建立了青钱柳药材的HPLC指纹图谱，应用了《中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统》对青钱柳药材的指纹图谱进行数字化评价，分别从分离度、信号强度、均化程度、时间效率、化学信息量、相似度等多方面反映了样品指纹图谱的信息，丰富而且详尽，能够对图谱隐含的定性、定量信息进行多侧面、全方位的数据挖掘。该方法可以更加全面地反映青钱柳药材所含的化学信息，为青钱柳药材的质量控制提供新参考方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.青钱柳的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备
精密称定青钱柳药材粉末，置具塞锥形瓶中，加入10倍量体积浓度50％甲醇，超声提取30min，取出，取续滤液，分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并萃取液，减压蒸干，甲醇溶解，摇匀并离心，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得青钱柳药材供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备
精密称取山柰素对照品5.25mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得0.525mg/mL山柰素的对照品溶液；
(3)高效液相色谱法测定青钱柳的对照指纹图谱
对10个批次的青钱柳药材的供试品溶液，进行高效液相色谱测定，测得各批次青钱柳药材的指纹图谱；
取山柰素对照品溶液进行高效液相色谱测定，测得山柰素对照品的色谱图；以山柰素色谱峰为内参照峰，计算出10批次青钱柳药材各供试品溶液中共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，经国家药典委员会“相似度评价软件2004A”比较10批次钱柳药材供试品的色谱图和相对保留时间，以共有指纹峰作为青钱柳药材的对照指纹图谱；
(4)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：将待测青钱柳药材供试品溶液按步骤(3)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(5)将步骤(4)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(3)得到的对照指纹图谱用国家药典委员会“相似度评价软件2004A”评价；
步骤(3)和步骤(4)高效液相色谱测定的色谱条件为：
色谱柱为Merck C18，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸溶液；梯度洗脱：0～11min，2％～13％A；11～16min，13％～18％A；16～50min，18％～31％A；50～62min，31％～42％A；62～82min，42％～89％A；体积流量：1.0mL·min-1，柱温：35℃，进样量10μL，检测波长：245nm。
2.根据权利要求1所述的青钱柳的指纹图谱检测方法，其特征在于，青钱柳药材指纹图谱中有32个共有指纹峰。
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