CN108426967B - 一种青钱柳颗粒hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，包括供试品的制备、色谱条件的确定，使用高效液相色谱仪进行测定，得到青钱柳颗粒的HPLC指纹图谱，全面准确的表达了青钱柳颗粒的化学信息，该指纹图谱有共有峰的分离度及峰型较好、重复性好、可操作性强等特点，能够有效地控制青钱柳颗粒的质量。

Description

一种青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及中药制剂质量控制领域，具体涉及一种青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法。
背景技术
青钱柳为胡桃科植物青钱柳属，据《中华本草》的记载，具有祛风、消炎止痛和杀虫止痒等功效。民间多以其叶作为药用部分，使用历史悠久。现代研究表明青钱柳叶具有生津止渴、降血糖、降血压、延年益寿等功效，可用于治疗糖尿病、高血压、神经衰弱等。现有文献报道以测定青钱柳中槲皮素和山柰素的含量作为药材质量控制标准，但青钱柳叶中除了含有槲皮素和山柰素外，还含有萜类、黄酮类、甾体类、鞣质、有机酸、生物碱等具有明显生理活性的化学成分。因此仅以槲皮素和山柰素作为青钱柳质量控制指标，存在一定局限性，且在实际使用中真伪易混乱，多与其他胡桃科植物的叶在许多地区被冒充青钱柳入药并在临床上使用，故有必要建立该药材质量的分析评价方法。然而，目前尚没有文献报道有关青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的研究，本发明通过高效液相色谱法，建立青钱柳颗粒高效液相色谱指纹图谱，并通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其进行分析，从而为区别其他品种及青钱柳的质量控制提供依据，具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供一种青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的指纹图谱。该指纹图谱可以全面的体现青钱柳颗粒的整体化学信息，可用于评价和控制青钱柳颗粒的质量，确保青钱柳颗粒的安全性和有效性。
本发明提供一种青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取青钱柳颗粒1g，置于圆底烧瓶中，加入50mL石油醚，回流提取2-3h，弃去石油醚，药渣挥干，精密加入乙腈20mL，称定质量，超声溶解30min，乙腈补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照溶液的制备：取青钱柳对照干药材，粉碎，过100目筛，精密称1g，置于圆底烧瓶中，加入50mL石油醚，回流提取2-3h，弃去石油醚，药渣挥干，精密加入乙腈20mL，称定质量，超声溶解30min，乙腈补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照溶液；
(3)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照溶液各10～20μL，注入液相色谱仪，依照高效液相色谱法进行测定，记录90分钟内的色谱图，用指纹图谱软件进行处理，得到青钱柳颗粒的指纹图谱；
高效液相色谱条件为：色谱柱Agilent C18，流动相A为乙腈；流动相B为0.7～1.0％的醋酸水溶液；检测波长：220～260nm；柱温：15-25℃；流速：1.2～2mL·min－1；洗脱程序为梯度洗脱程序；
所述梯度洗脱程序中流动相A与流动相B的体积比随时间的关系为：0min：5％:95％；15min：10％:90％；30min：30％:70％；45min：50％:50％；60min：70％:30％；75min：90％:10％；90min：100％:0％。
作为本发明进一步的改进，色谱柱的规格为250mm×4.6mm，5μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
作为本发明进一步的改进，十八烷基硅烷键合硅胶的孔径为
Figure GDA0002780455880000021
作为本发明进一步的改进，检测波长：245nm；柱温：25℃；流速：1.5mL·min－1。
作为本发明进一步的改进，微孔滤膜为0.22μm。
作为本发明进一步的改进，青钱柳颗粒指纹图谱中共有30个特征共有峰。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供了一种青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，建立的指纹图谱可以全面的体现青钱柳颗粒的整体化学信息；
2、本发明建立的指纹图谱中化学成分共有峰分离度及峰型好，该指纹图谱的重复性好，可操作性强，可用于评价和控制青钱柳颗粒的质量，确保青钱柳颗粒的安全性和有效性。
附图说明
图1为10批不同批次青钱柳颗粒指纹图谱叠加图。
图2为青钱柳对照药材水溶物的指纹图谱色谱图。
具体实施方式
实施例1
仪器：安捷伦高效液相色谱仪。
药材：广西壮瑶药工程技术研究中心提供的青钱柳颗粒；对照药材青钱柳由广西阿哩哩养生科技有限责任公司提供。
试剂：流动相A乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
供试品溶液制备：精密称取青钱柳颗粒1.0g，置于圆底烧瓶中，加入50mL石油醚，回流提取2-3h，弃去石油醚，药渣挥干，精密加入乙腈20mL，称定质量，超声溶解30min，乙腈补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
对照品溶液制备：取青钱柳对照干药材，粉碎，过100目筛，精密称1.0g，置于圆底烧瓶中，加入50mL石油醚，回流提取2-3h，弃去石油醚，药渣挥干，精密加入乙腈20mL，称定质量，超声溶解30min，乙腈补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照溶液。
高效液相色谱条件：色谱柱Agilent C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为乙腈；流动相B为0.7～1.0％的醋酸水溶液；检测波长：220～260nm；柱温：15-25℃；流速：1.2～2mL·min－1；洗脱程序为梯度洗脱程序。
梯度洗脱程序的体积比浓度为：
时间(min) 乙腈(％) 0.8％醋酸水溶液(％)
0 5 95
15 10 90
30 30 70
45 50 50
60 70 30
75 90 10
90 100 0
线性关系考察：
分别精密吸取供试品溶液(0.04895g·mL-1)0、2、4、6、8、10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以第10个峰的峰面积(Y)为纵坐标，以供试品溶液的进样量(X，μg)为横坐标绘制标准曲线，求得回归方程:Y＝7.7952X+5.2182，r＝0.9996，表明青钱柳颗粒溶液进样量在0～498.5μg与峰面积呈良好的线性关系。
精密度试验：
精密吸取供试品溶液(0.04895g·mL-1)10μL，按上述色谱条件连续进样5次，结果表明，5个图谱主要色谱峰保留时间的相对标准偏差(RSD)在0.10％～0.27％之间，峰面积的RSD值在2.5％以内，5次连续进样所得液相色谱图中主要峰的保留时间与峰面积的精密度较高，证明仪器的精密度良好表明仪器精密度良好。
稳定性试验：
取同一批次的供试品溶液(0.04895g·mL-1)，分别于制备后0、4、8、l2、24h进行HPLC检测得到相应的色谱图，通过中药指纹图谱相似度评价系统进行分析。结果表明，5个图谱主要色谱峰保留时间的RSD值在0.12％～0.26％之间，峰面积的RSD值在2.7％以内，试验所得液相色谱图中主要峰的保留时间与峰面积的精密度较高，证明在24h内样品溶液的稳定性良好。
重复性试验：
取同一批次的供试品溶液(0.04895g·mL-1)进行HPLC检测得到相应的色谱图，通过中药指纹图谱相似度评价系统进行分析。结果表明，5个图谱主要色谱峰保留时间的RSD值在0.15％～0.30％之间，峰面积的RSD值在2.7％以内，试验所得液相色谱图中主要峰的保留时间与峰面积的精密度较高，证明本方法测定的重复性良好。
加样回收试验：
取同一批号的青钱柳颗粒适量，研细，取约0.20g，平行6份，精密称定，分别精密加入已配好的供试品溶液(0.04895g·mL-1)5mL，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定第十个峰的面积，计算回收率，结果如下表1：
表1青钱柳颗粒回收率试验
Figure GDA0002780455880000051
测定结果：按上述方法，通过对10批不同批次的青钱柳颗粒建立HPLC指纹图谱并进行分析比较，找出其共有特征峰(共30个峰)，得到青钱柳颗粒的指纹图谱，30个共有峰的保留时间分别是：7.0分钟、8.0分钟、12.5分钟、15.5分钟、18.0分钟、21.0分钟、22.0分钟、27.0分钟、28.0分钟、29.5分钟、31.8分钟、34.0分钟、36.0分钟、38.0分钟、44.0分钟、45.5分钟、49.5分钟、51.8分钟、57.5分钟、59.8分钟、62.5分钟、66.0分钟、67.7分钟、69.5分钟、76.5分钟、81.0分钟、82.0分钟、83.0分钟、87.2分钟、90.2分钟。
本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。

Claims (6)

1.一种青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取青钱柳颗粒1g，置于圆底烧瓶中，加入50mL石油醚，回流提取2-3h，弃去石油醚，药渣挥干，精密加入乙腈20mL，称定质量，超声溶解30min，乙腈补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照溶液的制备：取青钱柳对照干药材，粉碎，过100目筛，精密称1g，置于圆底烧瓶中，加入50mL石油醚，回流提取2-3h，弃去石油醚，药渣挥干，精密加入乙腈20mL，称定质量，超声溶解30min，乙腈补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照溶液；
(3)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照溶液各10～20μL，注入液相色谱仪，依照高效液相色谱法进行测定，记录90分钟内的色谱图，用指纹图谱软件进行处理，得到青钱柳颗粒的指纹图谱；
高效液相色谱条件为：色谱柱Agilent C18，流动相A为乙腈；流动相B为0.7～1.0％的醋酸水溶液；检测波长：220～260nm；柱温：15-25℃；流速：1.2～2mL·min－1；洗脱程序为梯度洗脱程序；
所述梯度洗脱程序中流动相A与流动相B的体积比随时间的关系为：0min：5％:95％；15min：10％:90％；30min：30％:70％；45min：50％:50％；60min：70％:30％；75min：90％:10％；90min：100％:0％。
2.如权利要求1所述青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为250mm×4.6mm，5μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
3.根据权利要求2所述的青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶的孔径为
Figure FDA0002780455870000011
4.如权利要求1所述青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，检测波长：245nm；柱温：25℃；流速：1.5mL·min－1。
5.如权利要求1所述的青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述微孔滤膜为0.22μm。
6.如权利要求1所述的青钱柳颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述青钱柳颗粒指纹图谱中共有30个特征共有峰。
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