CN109580865B - 一种青钱柳的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青钱柳的质量控制方法，包含青钱柳的薄层鉴别方法、含量测定方法及指纹图谱检测方法。本发明首次采用金丝桃苷和异槲皮苷的水溶液作为青钱柳薄层鉴别方法、含量测定方法及指纹图谱检测方法的对照品溶液，避免了槲皮素和山柰素作为青钱柳质量控制指标的局限性。

Description

一种青钱柳的质量控制方法

技术领域

本发明属于成分检测技术领域，尤其涉及一种青钱柳的质量控制方法。

背景技术

青钱柳为我国特有的品种，主产于长江以南，主要分布在江西、安徽、浙江、湖南、四川、广西等地。民间用其叶泡茶代茶饮已有悠久的历史，因其味甜，又称为甜茶、神茶，具有生津止渴、清热解暑、降血糖、降血脂和延年益寿等功效。现代研究表明，青钱柳主要含有黄酮、多糖、三萜、甾体等多类成分。青钱柳作为药用植物在《中华本草》、《中药辞药》、《全国中草药汇编》、《江西药用植物名录》、《中国中药资源志要》中均有记载。目前青钱柳的用量越来越大，但至今没有很好的质量控制方法，不利于青钱柳价值的体现和使用开发。

现有的青钱柳质量控制方法一般选择的槲皮素和山柰素的含量作为药材质量控制的标准，例如申请号为201610046707.5的中国专利申请公开了一种基于HPLC的青钱柳中黄酮类化合物含量的检测方法，所公开的含量检测方法测定青钱柳的酸水解产物中槲皮素和山柰素的含量。论文“10个采收期青钱柳HPLC指纹图谱建立及4种成分测定”[参见吴琳琳、姚文丽、罗奕等.10个采收期青钱柳HPLC指纹图谱建立及4种成分测定.中成药，2017，39(2)：347～352]报道了一种青钱柳HPLC指纹图谱及4种成分测定的方法，4种成分为绿原酸、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚。但作为含量测定指标应选择样品中原型成分作为测定指标，因当避免选择水解、降解产物作为指标，否则测量误差会较大，另外，青钱柳叶中除了含有槲皮素和山柰素外，还含有萜类、黄酮类、甾体类、鞣质、有机酸、生物碱等其他具有明显生理活性的化学成分，只包含槲皮素和山柰素作为青钱柳质量控制指标显然存在相当的局限性，在实际使用中真伪易混乱，使得胡桃科植物叶在许多地区被冒充青钱柳入药并在临床上使用，故有必要建立该药材的有效分析和评价方法。

较为独特的是，青钱柳中所含的黄酮类成分中包含金丝桃苷和异槲皮苷，通过金丝桃苷和异槲皮苷的色谱情况即可准确的鉴别青钱柳。但是金丝桃苷和异槲皮苷为同分异构体，具有相似的色谱保留行为，将这两种成分分离具有较大难度。现有的青钱柳专利及文献报道中，未有对青钱柳中含有金丝桃苷成分的报道，更未提出能够有效分离青钱柳色谱中金丝桃苷和异槲皮苷两者色谱的方法和工艺。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种青钱柳的质量控制方法，包含青钱柳的薄层鉴别方法、含量测定方法及指纹图谱检测方法，所述质量控制方法包括如下步骤：

(1)用甲醇或含水甲醇提取待检测青钱柳，制备成供试品溶液A；

(2)取青钱柳对照药材，按照供试品溶液A相同的制备方法制成对照药材溶液B，配制金丝桃苷和异槲皮苷的甲醇溶液作为对照品溶液C；

(3)吸取供试品溶液A、对照药材溶液B和对照品溶液C各2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-醋酸铵-苯胺-水溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量分数为5％的三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外灯下检视。

进一步地，所述乙酸乙酯-甲酸-醋酸铵-苯胺-水溶液中，质量比：乙酸乙酯：甲酸：醋酸铵：苯胺：水＝30:3:2:0.5:2。

进一步地，所述步骤(1)中，含水甲醇中甲醇的质量百分含量为80％，所述提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉中的一种。

进一步地，所述青钱柳的含量测定方法包括如下操作步骤：

1)用甲醇或含水甲醇提取待检测青钱柳，制备成供试品溶液D，配制金丝桃苷和异槲皮苷的甲醇溶液作为对照品溶液E；

2)将供试品溶液D和对照品溶液E分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250～370nm；流动相：甲醇-酸水、乙腈-酸水和甲醇-乙腈-酸水中的任意一种。

进一步地，所述酸水为溶质质量百分含量0.02～0.2％的冰醋酸水溶液、甲酸水溶液或磷酸水溶液中的任一种；所述甲醇-酸水中，甲醇/酸水的体积比为15～35:85～65；乙腈-酸水中，乙腈/酸水的体积比为10～30:90～70；甲醇-乙腈-酸水中，甲醇/乙腈/酸水的体积比为10～30/5～25/85～45。

进一步地，所述步骤1)中，含水甲醇中甲醇的质量百分含量为80％，所述提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉中的一种。

进一步地，所述流动相优选为乙腈-酸水，其中酸水为溶质质量分数为0.1％的磷酸水溶液，乙腈/0.1％磷酸的体积比为15:85，检测波长优选255±5nm或354±5nm。

进一步地，所述青钱柳的指纹图谱检测方法包括如下操作步骤：

A.用甲醇或含水甲醇提取待检测青钱柳，制备成供试品溶液F，配制金丝桃苷和异槲皮苷的甲醇溶液作为对照品溶液G；

B.将供试品溶液F和对照品溶液G注入高效液相色谱仪中检测获得指纹图谱，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250～370nm；流动相：A：乙腈，B：溶质质量分数为0.05～0.5％磷酸溶液，梯度洗脱程序为：0～10min，10～15A；10～30min，15A；30～55min，15～50A；55～65min，50～10A。

进一步地，所述步骤A中，含水甲醇中甲醇的质量百分含量为80％，所述提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉中的一种。

进一步地，流动相B优选溶质质量分数为0.1％的磷酸，检测波长优选255±5nm或354±5nm。

从以上技术方案可以看出，本发明的优点是：

1、本发明首次采用金丝桃苷和异槲皮苷的水溶液作为青钱柳薄层鉴别方法、含量测定方法及指纹图谱检测方法的对照品溶液，避免了槲皮素和山柰素作为青钱柳质量控制指标的局限性。

2、本发明优化了青钱柳薄层鉴别方法、含量测定方法及指纹图谱检测方法的工艺，特别是在青钱柳薄层鉴别方法中采用硅胶GF254薄层板，再通过乙酸乙酯-甲酸-醋酸铵-苯胺-水溶液为展开剂，使得金丝桃苷与异槲皮苷的荧光斑点分离度良好；且优化工艺后，色谱图中金丝桃苷峰与异槲皮苷峰分离度良好，可用于测定青钱柳中金丝桃苷、异槲皮苷的量及其总量。

附图说明

图1为青钱柳药材薄层鉴别图谱；

图2为青钱柳含量测定中对照品溶液E的HPLC色谱图；

图3为青钱柳含量测定中供试品溶液D的HPLC色谱图；

图4为对照品溶液G的指纹图谱；

图5为10批供试品溶液F的指纹图谱。

具体实施方式

下面结合实施例进行详细的说明：

青钱柳鉴别

称取待检测青钱柳粉末1g，加甲醇质量分数为80％的甲醇水溶液50mL，加热回流1小时，放冷，过滤，滤液蒸干，蒸干后的残渣用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液A。另取青钱柳对照药材1g，按照制备供试品溶液A同样的方法制成对照药材溶液B。再取金丝桃苷、异槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含金丝桃苷、异槲皮苷各0.5mg的溶液，作为对照品溶液C。吸取上述供试品溶液A、对照药材溶液B和对照品溶液C各2μL，将三种溶液分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-醋酸铵-苯胺-水(质量比为乙酸乙酯:甲酸:醋酸铵:苯胺:水＝30:3:2:0.5:2)溶液为展开剂，展开，取出晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外灯(365nm)下检视，结果如图1所示。

青钱柳含量测定

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-酸水(其中体积比乙腈:酸水＝15：85)为流动相，其中酸水为溶质质量百分数为0.1％的磷酸水溶液；检测波长为354nm。理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于2500。

对照品溶液E的制备：取金丝桃苷、异槲皮苷适量，精密称定，加甲醇制成每1mL溶液中含金丝桃苷6μg、异槲皮苷0.1mg的混合溶液，作为对照品溶液E。

供试品溶液的制备：取青钱柳粉末1.0g，精密称定，置带塞的锥形瓶中，精密加入甲醇体积分数为80％的甲醇水溶液50mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇体积分数为80％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液D。

分别精密吸取对照品溶液E与供试品溶液D各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得如图2和图3所示的HPLC色谱图。

青钱柳指纹图谱

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，溶质质量百分含量为0.1％的磷酸溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为354nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于2500。

表1

对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品、异槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL溶液中含金丝桃苷6μg、异槲皮苷100μg的溶液，即得对照品溶液G。

供试品溶液的制备：取青钱柳粉末1.0g，精密称定，置带塞的锥形瓶中，精密加入甲醇体积分数为80％的甲醇水溶液50mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇体积分数为80％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液F。

分别精密吸取对照品溶液G和供试品溶液F各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，如图4和图5所示。

供试品溶液F的指纹图谱中应分别呈现与对照品溶液G色谱峰保留时间相同的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不低于0.90。

以上对本发明所提供的技术方案进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，包含青钱柳的薄层鉴别方法、含量测定方法及指纹图谱检测方法，所述质量控制方法包括如下步骤：

(1) 用甲醇或含水甲醇提取待检测青钱柳，制备成供试品溶液A；

(2) 取青钱柳对照药材，按照供试品溶液A相同的制备方法制成对照药材溶液B，配制金丝桃苷和异槲皮苷的甲醇溶液作为对照品溶液C；

(3) 吸取供试品溶液A、对照药材溶液B和对照品溶液C各2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-醋酸铵-苯胺-水溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量分数为5%的三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外灯下检视；

所述青钱柳的指纹图谱检测方法包括如下操作步骤：

A. 用甲醇或含水甲醇提取待检测青钱柳，制备成供试品溶液F，配制金丝桃苷和异槲皮苷的甲醇溶液作为对照品溶液G；

B. 将供试品溶液F和对照品溶液G注入高效液相色谱仪中检测获得指纹图谱，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250～370nm；流动相：A：乙腈，B：溶质质量分数为0.05%～0.5%磷酸溶液，梯度洗脱程序为：0～10min，10%～15%A；10～30min，15%A；30～55min，15%～50%A；55～65min，50%～10%A。

2.根据权利要求1所述的一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，所述乙酸乙酯-甲酸-醋酸铵-苯胺-水溶液中，质量比：

乙酸乙酯：甲酸：醋酸铵：苯胺：水=30:3:2:0.5:2。

3.根据权利要求1或2所述的一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，所述步骤(1)中，含水甲醇中甲醇的质量百分含量为80%，所述提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，所述青钱柳的含量测定方法包括如下操作步骤：

1) 用甲醇或含水甲醇提取待检测青钱柳，制备成供试品溶液D，配制金丝桃苷和异槲皮苷的甲醇溶液作为对照品溶液E；

2) 将供试品溶液D和对照品溶液E分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250～370nm；流动相：甲醇-酸水、乙腈-酸水和甲醇-乙腈-酸水中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，所述酸水为溶质质量百分含量0.02～0.2%的冰醋酸水溶液、甲酸水溶液或磷酸水溶液中的任一种；所述甲醇-酸水中，甲醇/酸水的体积比为15～35:85～65；乙腈-酸水中，乙腈/酸水的体积比为10～30:90～70；甲醇-乙腈-酸水中，甲醇/乙腈/酸水的体积比为10～30/5～25/85～45。

6.根据权利要求4所述的一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，所述步骤1)中，含水甲醇中甲醇的质量百分含量为80%，所述提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉中的一种。

7.根据权利要求4～6任一项所述的一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，所述流动相为乙腈-酸水，其中酸水为溶质质量分数为0.1%的磷酸水溶液，乙腈/0.1%磷酸的体积比为15:85，检测波长255±5nm或354±5nm。

8.根据权利要求1所述的一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，所述步骤A中，含水甲醇中甲醇的质量百分含量为80%，所述提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉中的一种。

9.根据权利要求8所述的一种青钱柳的质量控制方法，其特征在于，流动相B溶质质量分数为0.1%的磷酸，检测波长255±5nm或354±5nm。

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