CN103760271A - 脑心清胶囊的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脑心清胶囊的检测方法，属于中药技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种脑心清胶囊的检测方法，通过该方法可以更好的控制脑心清胶囊的质量。本发明方法包括如下步骤：东莨菪内酯检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%甲酸为流动相，检测波长为345nm；取东莨菪内酯对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；取装量差异项下的脑心清胶囊内容物，精密加入甲醇溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；按外标法以峰面积计算，即得东莨菪内酯含量；按上述方法检测脑心清胶囊，如果每粒胶囊东莨菪内酯含量少于5μg，则药品质量不合格。
Description
技术领域
本发明涉及脑心清胶囊的检测方法，属于中药技术领域。
背景技术
心脑血管疾病，在临床极为常见。目前，该类疾病是人类健康的头号杀手，被世界卫生组织列为当前全组织范围总体工作重点之一。据世界卫生组织公布的数据显示，在人类死亡的原因中，心脑血管疾病占总死亡人口的39.4%，位居第一，在人类疾病中，心脑血管疾病的复发率高达87%，位居第一，在人类疾病中，心脑血管疾病的致残率高达50%，位居第一。这一特点，给无数家庭带来巨大痛苦。
据有关资料显示，我国目前约有1.1亿人患有高血压、动脉硬化等心脑血管疾病，6000万人患有冠心病，7000万人患有脑梗塞或者脑溢血，40岁以上的人中，约有57%的人患有不同程度的心脑血管疾病。就现阶段而言，我国心脑血管疾病防治形势依然严峻，急需提高心脑血管疾病的预防及治疗水平，以增进人民健康。这一严峻的形势，为中医中药对于心脑血管疾病的治疗，提供了前提。
柿叶为柿科植物柿Diospyros kaki Thunb.的干燥叶，始载于《名医别录》，柿叶入药始见于《滇南本草》柿花项下，谓：“经霜叶敷臁疮。”，《本草再新》则用于“治咳嗽吐血，止渴生津”，《分类草药性》：“治咳嗽气喘，清肺气胀”，《中药大辞典》：“治咳喘，肺气胀，各种出血”，《全国中草药汇编》：“治高血压病”。收载于《广西中药材标准》（1990年版），其性味为：苦、酸、涩，凉；功能主治为：清肺止咳，凉血止血，活血化瘀，降血压。用于气喘，肺气肿，各种内出血，高血压，脑动脉硬化症，冠心病。
现代药理实验表明柿叶主要具有止血、解热、抑菌、降压等作用，可增加心冠脉流量和脑部血流量，改善和增加心脑组织供氧状态。在血液流变学方面能显著增加红细胞电泳率，使全血粘度下降，纤维蛋白原减少，从而防止和减轻血液的粘度，起到活血化瘀的作用。
目前，脑心清片是主要的柿叶制剂之一，并被载入《中华人民共和国卫生部药品标准》（中药成方制剂第二十册），随着其临床使用越来越广泛，作为预防治疗心脑血管疾病的有特色的理想药物，受到了广大患者和医务人员的欢迎。目前，脑心清胶囊的检测主要检测乙酸乙酯浸出物、槲皮素（C15H10O7）等指标，这在一定程度上能够保证药品质量。但是，由于中药的产地、栽培、采集时间等不同，产品的药效和质量稳定性存在较大区别。随着人们对中药质量要求的提高，建立更好、更严格的质量检测方法以保证药品质量成为本领域迫切需要解决的技术难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种脑心清胶囊的检测方法，通过该方法可以更好的控制脑心清胶囊的质量。
本发明脑心清胶囊的检测方法包括如下步骤：
a、东莨菪内酯检测：
按中国药典2010年版二部附录V D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.1%v/v甲酸=30:60～80v/v为流动相，检测波长为345nm；理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500；
对照品溶液的制备取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成对照品溶液；
供试品溶液的制备取装量差异项下的脑心清胶囊内容物，混匀，研细，精密称取，精密加入甲醇溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；按外标法以峰面积计算，即得东莨菪内酯含量；
按上述方法检测脑心清胶囊，脑心清胶囊每粒含东莨菪内酯不得少于5μg，如果每粒胶囊东莨菪内酯含量少于5μg，则药品质量不合格。
进一步的，上述方法的a步骤优选为：
a、东莨菪内酯检测：
按高效液相色谱法中国药典2010年版二部附录V D测定；
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%V/V甲酸30：70V/V为流动相，检测波长为345nm。理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45um滤膜滤过，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定；按外标法以峰面积计算，即得；
按上述方法检测脑心清胶囊，脑心清胶囊每粒含东莨菪内酯不得少于5μg，如果每粒胶囊东莨菪内酯含量少于5μg，则药品质量不合格。
更进一步的，本发明脑心清胶囊的检测方法还可以包括如下步骤：
b、取脑心清胶囊7粒的内容物，研细，加乙酸乙酯25ml，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至约2.5ml，作为供试品溶液；另取糠酸、原儿茶酸、琥珀酸对照品，分别加乙酸乙酯制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述四种溶液各3ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸5:4:1为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热半小时放冷,喷以0.05%溴酚蓝乙醇溶液；检查供试品色谱中，分别在与对照品色谱相应的位置上，是否显相同的颜色的斑点，如果不显相同的颜色的斑点，则药品质量不合格；
c、检测脑心清胶囊是否符合中国药典2005年版一部附录IL胶囊剂下有关的各项规定，如果不符合上述规定，则药品质量不合格；
d、乙酸乙酯浸出物含量检测：取脑心清胶囊内容物2～4g，精密称定，用乙酸乙酯为溶剂，照醇溶性浸出物测定法中国药典2005年版一部附录X A热浸法测定；如果每粒含乙酸乙酯浸出物少于36.0mg，则药品质量不合格；
e、槲皮素C15H10O7含量检测：
按高效液相色谱法中国药典2005年版一部附录VI D测定：
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—0.34%磷酸55:45为流动相；检测波长为370nm；理论板数按槲皮素峰计用不低于3000；
对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取脑心清胶囊装量差异项下的内容物研细，取约0.5g，精密称定，精密加甲醇20ml和25%盐酸5ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得；
按上述方法检测脑心清胶囊，如果每粒胶囊槲皮素C15H10O7含量少于0.40mg，则药品质量不合格。
进一步的，上述脑心清胶囊的检测方法中所述的脑心清胶囊的规格优选为每粒装0.15g，含柿叶干浸膏50mg。
通过本发明方法，可以确保脑心清胶囊的药品质量和药效的稳定性，避免检测标准相同，而其药效和质量稳定性却可能差别较大的情况出现，本发明为脑心清胶囊的质量检测提供了一种新的方法，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是东莨菪内酯对照品HPLC图谱；
图2是脑心清胶囊HPLC图谱；
图3是东莨菪内酯峰面积（A）—进样量（m，ng）线性关系的标准曲线图；
具体实施方式
本发明脑心清胶囊的检测方法包括如下步骤：
a、东莨菪内酯检测：
按中国药典2010年版二部附录V D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.1%v/v甲酸=30:60～80v/v为流动相，检测波长为345nm；理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500；
对照品溶液的制备取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成对照品溶液；
供试品溶液的制备取装量差异项下的脑心清胶囊内容物，混匀，研细，精密称取，精密加入甲醇溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；按外标法以峰面积计算，即得东莨菪内酯含量；
按上述方法检测脑心清胶囊，脑心清胶囊每粒含东莨菪内酯不得少于5μg，如果每粒胶囊东莨菪内酯含量少于5μg，则药品质量不合格。
进一步的，上述方法的a步骤优选为：
a、东莨菪内酯检测：
按高效液相色谱法中国药典2010年版二部附录V D测定；
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%V/V甲酸30：70V/V为流动相，检测波长为345nm。理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45um滤膜滤过，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定；按外标法以峰面积计算，即得；
按上述方法检测脑心清胶囊，脑心清胶囊每粒含东莨菪内酯不得少于5μg，如果每粒胶囊东莨菪内酯含量少于5μg，则药品质量不合格。
更进一步的，本发明脑心清胶囊的检测方法还可以包括如下步骤：
b、取脑心清胶囊7粒的内容物，研细，加乙酸乙酯25ml，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至约2.5ml，作为供试品溶液；另取糠酸、原儿茶酸、琥珀酸对照品，分别加乙酸乙酯制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述四种溶液各3ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸5:4:1为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热半小时放冷,喷以0.05%溴酚蓝乙醇溶液；检查供试品色谱中，分别在与对照品色谱相应的位置上，是否显相同的颜色的斑点，如果不显相同的颜色的斑点，则药品质量不合格；
c、检测脑心清胶囊是否符合中国药典2005年版一部附录IL胶囊剂下有关的各项规定，如果不符合上述规定，则药品质量不合格；
d、乙酸乙酯浸出物含量检测：取脑心清胶囊内容物2～4g，精密称定，用乙酸乙酯为溶剂，照醇溶性浸出物测定法中国药典2005年版一部附录X A热浸法测定；如果每粒含乙酸乙酯浸出物少于36.0mg，则药品质量不合格；
e、槲皮素C15H10O7含量检测：
按高效液相色谱法中国药典2005年版一部附录VI D测定：
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—0.34%磷酸55:45为流动相；检测波长为370nm；理论板数按槲皮素峰计用不低于3000；
对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取脑心清胶囊装量差异项下的内容物研细，取约0.5g，精密称定，精密加甲醇20ml和25%盐酸5ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得；
按上述方法检测脑心清胶囊，如果每粒胶囊槲皮素C15H10O7含量少于0.40mg，则药品质量不合格。
进一步的，上述脑心清胶囊的检测方法中所述的脑心清胶囊的规格优选为每粒装0.15g，含柿叶干浸膏50mg。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1采用本发明方法检测脑心清胶囊
1、脑心清胶囊的制备
制备方法：取干柿叶，加水煎煮二次，第一次加12倍量水煎煮2小时，第二次加10倍量水煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.12-1.15（60℃），加乙醇至含醇量达85%，静置过夜，滤取上清液备用；沉淀每次用4倍量65%乙醇洗涤两次，收集洗脱液，静置，吸取上清液与前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏加2倍量水溶解，滤过，滤液分别用（3倍、2倍、2倍、1倍）量乙酸乙酯提取四次，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯，稠膏低温（60℃）干燥成干浸膏，每50g干浸膏加淀粉100g，混匀，用淀粉浆制软材，制粒，60℃干燥，颗粒分装成胶囊，制成1000粒，即得。
2、脑心清胶囊东莨菪内酯的检测
2.1实验材料
脑心清胶囊：由上述方法制备而得；
甲醇：色谱纯；
水：高纯水；
东莨菪内酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110768-200504)。
Agilent1260高效液相色谱仪，VWD可见紫外检测器。
2.2拟定测定方法
照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥD）测定。
a、色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%甲酸（30：70）为流动相；经扫描测定，东莨菪内酯甲醇溶液最大吸收波长为345nm,故确定本品检测波长为345nm。理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500。
b、供试品溶液的制备
东莨菪内酯是一种羟基香豆素甲苷，能溶于热醇或热的冰乙酸，略溶于三氯甲烷，微溶于水或冷醇，而难溶于乙醚，苯等极性小的有机溶剂，因此本品选择以常用的甲醇作溶剂，拟定供试品溶液制备方法如下：
取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45um滤膜滤过,即得。
c、对照品溶液制备方法的选择
经初步试验（对照品溶液和脑心清胶囊供试品溶液分别进样，然后比较东莨菪内酯的峰面积，以此方法可以初步确定脑心清胶囊中的东莨菪内酯含量），脑心清胶囊中东莨菪内酯含量约为40μg/g，对应供试品溶液中东莨菪内酯浓度约为6.4μg/ml，故拟定对照品溶液制备方法如下：
取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成约6μg/ml的溶液。
d、测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。按外标法以峰面积计算，即得。
2.3系统适用性试验
a、色谱条件
色谱柱：迪马C18柱(5μm,250mm×4.6mm)；流动相：甲醇-0.1%甲酸（30：70），检测波长：345nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。
b、试验结果
取照拟定方法制备的供试品溶液及对照品溶液进行测定，结果对照品色谱中东莨菪内酯峰理论板数为3700，拖尾因子为1.01（如图1所示）；对照品溶液主峰与供试品溶液中东莨菪内酯峰保留时间一致；供试品溶液图谱中东莨菪内酯与其他成分能有效分离,分离度为1.5，如图2所示。
同时另取制备样品所用的辅料制成的空白样品，照供试品溶液制备方法制成空白对照溶液，同法测定，结果空白对照图谱中在东莨菪内酯保留时间处无色谱峰，表明空白无干扰。
2.4耐用性试验
更换色谱柱为：Agilent SB-C18柱（5μm,250mm×4.6mm），柱温35℃。分别取对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液10μl进样，按“2.3”项色谱条件测定。
试验结果：对照品色谱中东莨菪内酯峰理论板数为3300，拖尾因子为1.03；对照品溶液主峰与供试品溶液中东莨菪内酯峰保留时间一致；供试品溶液图谱中东莨菪内酯与其他成分能有效分离,分离度大于1.5。同时空白对照无干扰。
试验结果表明方法耐用性符合要求。
2.5线性关系考察
取东莨菪内酯对照品适量，精密称定为15.68mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得东莨菪内酯对照品贮备液1（浓度：313.6μg/ml）；精密吸取5μl，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得东莨菪内酯对照品贮备液2（浓度：31.36μg/ml）；再分别精密吸取1、3、5、10、25ml，分置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，使成不同浓度的稀释溶液。按“2.3”项色谱条件分别进样10μl各2次，测定峰面积。数据如表1所示。
表1线性关系考察试验结果
试验结果表明，东莨菪内酯进样量在12.544～313.6ng的范围内线性关系良好。
2.6定量限
取线性关系考察试验项下最小浓度的东莨菪内酯对照品溶液（1.2544μg/ml），精密吸取适量用甲醇多次稀释成适宜浓度的稀释溶液。按“2.3”项色谱条件分别进样10μl各2次测定，找出S/N=10的溶液浓度为0.06272μg/ml，即试验系统定量限为0.6ng。
2.7精密度试验
按“2.3”项色谱条件，取东莨菪内酯对照品溶液(浓度为6.272μg/ml)，重复进样6次,测定东莨菪内酯的峰面积。试验结果见表2。
表2精密度试验结果
试验结果表明，方法精密度符合规定。
2.8重复性试验
取脑心清胶囊样品（批号：130402），按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.3”项色谱条件，分别测定东莨菪内酯含量。试验结果见表3。
表3重复性试验结果
试验结果表明，方法重复性试验符合规定。
2.9稳定性试验
取重复性试验项下第6号样品溶液，于室温密闭放置。分别在0、1、2、4、6、8、12、24h进样10μl，按“2.3”项色谱条件，测定东莨菪内酯峰面积，计算RSD值。试验结果见表4。
表4重复性试验结果
试验结果表明，试验溶液稳定性较好。
2.10回收率试验
照加样回收测定法进行。
精密吸取东莨菪内酯对照品贮备液1（浓度：313.6μg/ml）3ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，成37.632μg/ml的溶液。取同一批已测定含量的脑心清胶囊供试品（批号：130402，含量：39.32μg/g）9份，每份约2.0g，分别精密称定重量，各精密加入37.632μg/ml的东莨菪内酯对照品甲醇溶液1-3号每份加1.0ml，4-6号每份加2.0ml，7-9号每份加3.0ml，再分别加甲醇补足25ml，按“2.2”项下方法制备，成各加样供试品溶液。按“2.3”项色谱条件，分别测东莨菪内酯峰面积，计算东莨菪内酯含量和回收率。结果见表5。
表5加样回收试验结果
试验结果：本含量测定方法加样回收率在98.19%-100.8%之间，平均回收率为99.46%（RSD=0.9%，n=9），表明方法准确度较高。
2.11样品测定
分别按“2.2”项方法制备3批（批号：130401、130402、130403）脑心清胶囊的供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定。计算各批样品东莨菪内酯的含量。结果见表6。
表6样品测定结果
3、实验结论
由上述试验结果，可确定脑心清胶囊东莨菪内酯含量测定方法为：
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%甲酸（30：70）为流动相，检测波长为345nm。理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45um滤膜滤过，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。按外标法以峰面积计算，即得。
研究结果表明此方法准确可靠、操作性强，可作为脑心清胶囊质量控制的又一途径。
试验例1不同产地、不同采收时间柿叶干浸膏槲皮素、东莨菪内酯含量测定及药效实验
1.实验材料
1.1药材
柿叶：柿叶36批，产地分别采自四川洪雅、山东青州、山西运城、陕西富平、广西恭城、河北满城等六个不同省份地区。采收时间分别为花期（盛花期：花盛开的时期），果期（盛果期，果实成熟时期），果后期（果实采摘后1个月）。
1.2柿叶干浸膏制备方法
取以上不同产地和不同采收期采集的柿叶，阴干，不同产地、不同采收时间柿叶每次分别取干柿叶1000g加水煎煮二次，第一次加12倍量水煎煮2小时，第二次加10倍量水煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.12-1.15（60℃），加乙醇至含醇量达85%，静置过夜，滤取上清液备用；沉淀每次用4倍量65%乙醇洗涤两次，收集洗脱液，静置，吸取上清液与前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏加2倍量水溶解，滤过，滤液分别用（3倍、2倍、2倍、1倍）量乙酸乙酯提取四次，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯，稠膏低温（60℃）干燥成干浸膏，作为柿叶干浸膏用作以下实验。
1.3试剂与仪器
试剂：甲醇（色谱纯）；
对照品：东莨菪内酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110768-200504)。
槲皮素对照品（中国生物制品检定所，批号：100081-200907）
盐酸普萘洛尔片：华中药业股份有限公司生产，批号：20111004。
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，VWD可见紫外检测器。
1.4实验动物
昆明种小鼠：成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK[川2013-24]
2、实验方法与结果
2.1不同产地、不同采收时间柿叶干浸膏槲皮素、东莨菪内酯含量测定
2.1.1槲皮素含量测定方法
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇—0.34%磷酸（55：45）为流动相；检测波长为370nm。理论板数按槲皮素峰计用不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取不同产地及不同采收时间的柿叶干浸膏各约0.15g，精密称定，精密加甲醇20ml和25%盐酸5ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，即得。
2.1.2东莨菪内酯含量测定方法
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%甲酸（30：70）为流动相，检测波长为345nm。理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取不同产地、不同采收时间的柿叶干浸膏各约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45um滤膜过滤，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。按外标法以峰面积计算，即得。
2.1.3槲皮素和东莨菪内酯含量测定结果
不同产地、不同采收时期柿叶干浸膏槲皮素、东莨菪内酯含量测定结果（mg/g）见表7、8。
表7
表8
由表7、8可见，不同产地柿叶干浸膏槲皮素含量：山东青州和陕西富平柿叶干浸膏槲皮素含量较高，广西恭城、河北满城柿叶干浸膏槲皮素含量次之，四川洪雅、山西运城较低；不同产地柿叶干浸膏东莨菪内酯含量，陕西富平最高，山东青州、广西恭城次之，四川洪雅、山西运城、河北满城较低。不同采收时间槲皮素、东莨菪内酯含量：各地在花期时槲皮素和东莨菪内酯含量最高，果后期槲皮素和东莨菪内酯含量次之，果期槲皮素和东莨菪内酯含量最低，为不影响柿叶果实的生长，建议柿叶采收期为果后期，选择槲皮素、东莨菪内酯含量较高的地区采收果后期柿叶用于柿叶干浸膏的制备。
2.2不同产地、不同采收时间柿叶干浸膏药效学实验
2.2.1实验方法；小鼠常压耐缺氧实验法
取体重20±2g昆明种小鼠400只，雌雄各半，随机分为20组，分组情况见表二，按表二给药浓度及给药体积，各组小鼠灌胃给药，连续给药7天，第7天给药30分钟后，将小鼠分别放入250ml的磨口广口瓶内密封（瓶内放钠石灰10g，每瓶放1只小鼠，瓶口涂以凡士林），以最后一次呼吸为指标，观察小鼠存活时间，然后进行T检验，结果见表9。
表9不同产地、不同采收时间柿叶干浸膏对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响
注：与溶剂对照组比较*P＜0.05、**P＜0.01
2.2.1实验结果分析
小白鼠在密闭容器中受缺氧因素损害，主要反应在心和脑缺氧。由于常压耐缺氧为非特异性缺氧，所以以上实验数据显示柿叶干浸膏能延长小白鼠的常压耐缺氧存活时间，说明柿叶干浸膏对脑缺氧或心肌缺血具有改善作用。为柿叶干浸膏用于心脑疾病的治疗提供了药效学基础。
由表9实验结果分析，（1）槲皮素和东莨菪内酯含量均较高的柿叶干浸膏耐缺氧效果较好。（2）槲皮素含量相近，东莨菪内酯含量较高的柿叶干浸膏耐缺氧效果较好。
以上实验结果表明，槲皮素和东莨菪内酯均有增强小鼠耐缺氧的作用，为了保证柿叶干浸膏的药效，需要对其中所含的这两种成分进行控制，选择这两种成分含量均较高的用于制成产品。
Claims (4)
1.脑心清胶囊的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
a、东莨菪内酯检测：
按中国药典2010年版二部附录V D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.1%v/v甲酸=30:60～80v/v为流动相，检测波长为345nm；理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500；
对照品溶液的制备取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成对照品溶液；
供试品溶液的制备取装量差异项下的脑心清胶囊内容物，混匀，研细，精密称取，精密加入甲醇溶液，超声处理，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；按外标法以峰面积计算，即得东莨菪内酯含量；
按上述方法检测脑心清胶囊，脑心清胶囊每粒含东莨菪内酯不得少于5μg，如果每粒胶囊东莨菪内酯含量少于5μg，则药品质量不合格。
2.根据权利要求1所述的脑心清胶囊的检测方法，其特征在于所述a步骤为：
a、东莨菪内酯检测：
按高效液相色谱法中国药典2010年版二部附录V D测定；
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%V/V甲酸30：70V/V为流动相，检测波长为345nm。理论板数按东莨菪内酯峰计算应不低于2500；
对照品溶液的制备取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，功率250W，频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45um滤膜滤过，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定；按外标法以峰面积计算，即得；
按上述方法检测脑心清胶囊，脑心清胶囊每粒含东莨菪内酯不得少于5μg，如果每粒胶囊东莨菪内酯含量少于5μg，则药品质量不合格。
3.根据权利要求1或2所述的脑心清胶囊的检测方法，其特征在于还包括如下步骤：
b、取脑心清胶囊7粒的内容物，研细，加乙酸乙酯25ml，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至约2.5ml，作为供试品溶液；另取糠酸、原儿茶酸、琥珀酸对照品，分别加乙酸乙酯制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法中国药典2005年版一部附录VI B试验，吸取上述四种溶液各3ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸5:4:1为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热半小时放冷,喷以0.05%溴酚蓝乙醇溶液；检查供试品色谱中，分别在与对照品色谱相应的位置上，是否显相同的颜色的斑点，如果不显相同的颜色的斑点，则药品质量不合格；
c、检测脑心清胶囊是否符合中国药典2005年版一部附录IL胶囊剂下有关的各项规定，如果不符合上述规定，则药品质量不合格；
d、乙酸乙酯浸出物含量检测：取脑心清胶囊内容物2～4g，精密称定，用乙酸乙酯为溶剂，照醇溶性浸出物测定法中国药典2005年版一部附录X A热浸法测定；如果每粒含乙酸乙酯浸出物少于36.0mg，则药品质量不合格；
e、槲皮素C15H10O7含量检测：
按高效液相色谱法中国药典2005年版一部附录VI D测定：
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—0.34%磷酸55:45为流动相；检测波长为370nm；理论板数按槲皮素峰计用不低于3000；
对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取脑心清胶囊装量差异项下的内容物研细，取约0.5g，精密称定，精密加甲醇20ml和25%盐酸5ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um滤膜过滤，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得；
按上述方法检测脑心清胶囊，如果每粒胶囊槲皮素C15H10O7含量少于0.40mg，则药品质量不合格。
4.根据权利要求1～3任一项所述的脑心清胶囊的检测方法，其特征在于：所述的脑心清胶囊的规格为每粒装0.15g，含柿叶干浸膏50mg。
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