CN102128889A - 一种黄芩中黄芩素与汉黄芩素同时定量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄芩中黄芩素与汉黄芩素同时定量测定方法。本发明测定方法在适宜温度下，利用黄芩本身所含的酶，在水溶液中酶解黄芩苷、汉黄芩苷等苷类化合物，酶解完成后，加酸性甲醇，杀灭黄芩酶的同时保持黄芩素的稳定性，并使酶解的黄芩苷元类充分溶解，滤过，续滤液作为样品溶液。用HPLC法，以甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为51～54∶49～46为流动相，275nm为检测波长，同时测定黄芩中的黄芩素与汉黄芩素，方法简便、快捷、待测成分酶解完全、波峰分离良好。黄芩中黄芩素与汉黄芩素同时定量测定方法为首次报道，为该成分的充分提取、分离，提供了真实的基础含量数据。黄芩素的含量实测值大于以黄芩苷和黄芩素分子量推算的理论值。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄芩质量控制方法，具体地，涉及一种黄芩中黄芩素与汉黄芩素同时定量测定方法，属中药质量控制领域。
背景技术
黄芩是一种常用中药，为中国药典历版所收载品种，具清热燥湿、泻火解毒、止血安胎之功效。用于湿温，暑温，胸闷呕恶，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热，咳嗽，高热，烦咳，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。黄芩中的有效成分主要有黄芩苷、汉黄芩苷及其苷元等黄酮类化合物。其中黄芩苷含量最高，可达18％，中国药典一部黄芩项下规定黄芩苷不得少于9.0％，所以不论是药材还是制剂都是以黄芩苷为指标进行质量控制。但近年来，有不少文献报道，黄芩中的苷元类，如黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A等具有非常强的抗菌、消炎、解热、镇痛等生物活性，远较其苷类的生物活性强，在人体内的吸收是苷类的数倍至数十倍，且毒副作用更低。因为在黄芩药材中苷元类含量低微，无直接提取价值，所以引发了不少酶解或水解黄芩中的黄芩苷类来提取其苷元类的提取专利与文章问世。但有关黄芩药材中具体含多少可水解黄芩素等苷元类，却未查阅到一篇有关其含量测定的报道，黄芩药材中的黄芩素含量都是由黄芩苷的含量按分子量推算出来的，推算的理论值是否与真实含量一致，是不得而知的。
鉴于上述历史背景情况，为给黄芩中黄芩素和汉黄芩素的充分提取、分离，提供真实的基础含量数据，探讨简便、快捷的黄芩中黄芩素与汉黄芩素同时定量测定方法，成为当务之急。
发明内容
经多途径多因素探讨研究，发明人在适宜温度下，利用黄芩本身所含的酶，在水溶液中酶解黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素-7-O-β-吡喃葡萄糖苷、木蝴蝶苷B等化合物，酶解完成后，加酸性甲醇杀灭黄芩酶的同时保持黄芩素的稳定性，并使酶解的黄芩苷元类充分溶解，滤过，续滤液作为供试品溶液。以甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为51～54∶49～46为流动相，275nm为检测波长，同时测定黄芩中的黄芩素与汉黄芩素，方法简便、快捷、待测成分酶解完全、波峰分离良好。首次为黄芩中黄芩素和汉黄芩素的充分提取、分离，提供了真实的基础含量数据。黄芩素的实测数值远大于以黄芩苷推算出的黄芩素理论含量数值。以此，进一步证实最终测定的黄芩素是由多种黄芩苷类酶解，以及原药材中存在的微量游离体相加而得到的总和，以单一的黄芩苷含量推算出的黄芩素理论含量仅为实际含量的约85％左右。
通过方法学考察，黄芩素的进样量在0.0992-1.984μg/ml范围内呈良好线性关系，见图1，回归方程为：Y＝5354.6x-96.788，r＝0.99988；汉黄芩素进样量在0.037488-3.124μg/ml范围内呈良好线性关系，见图2，回归方程为：Y＝5854.6x-29，r＝0.99997。采用加样回收实验，结果表明：黄芩素的平均回收率为96.45％(n＝9)，RSD为1.34％，见表1；汉黄芩素的平均回收率为97.86％(n＝9)，RSD为1.89％，见表2。
表1 黄芩素回收率测定结果
表2 汉黄芩素回收率测定结果
精密度试验，吸取对照品溶液及相应的供试品溶液，各进样5次，测定峰面积，结果见表3。
稳定性试验，吸取对照品溶液及相应的供试品溶液，每隔一定时间进样，测定峰面积，结果见表4。
重现性试验，取同一批样品，分别取高、中、低三个样品量，每个样品量3份，按供试品溶液制备方法，分别进行提取，制备，测定，同批样品的9次测定结果见表5。
表3 精密度试验结果(峰面积)
表4 稳定性试验结果(峰面积)
| 时间(小时) | 黄芩素 | 样品中黄芩素 | 汉黄芩素 | 样品中汉黄芩素 |
| 0 | 1285.1 | 1376.8 | 707.2 | 440.6 |
| 6 | 1336.3 | 1384.6 | 720.9 | 457.9 |
| 8 | 1324.4 | 1375.1 | 720.9 | 457.4 |
| 10 | 1314.4 | 1364.0 | 725.0 | 455.1 |
| 19 | 1320.1 | 1325.0 | 721.5 | 458.9 |
| RSD(％) | 1.45 | 1.73 | 0.96 | 1.68 |
表5 重现性试验结果
专属性试验，吸取黄芩苷对照品、黄芩素对照品及汉黄芩素对照品溶液、样品溶液(酶解后的黄芩药材)及空白样品(不含黄芩药材)溶液，按照选定测定条件进行峰值检测，结果空白样品中无杂质峰干扰，结果见图3、4、5、6、7、8。
以上实验均符合方法学要求。适用黄芩药材中黄芩素和汉黄芩素同时定量测定。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
1.色谱条件： 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为51～54∶49～46；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
2.对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素30～35μg、汉黄芩素10～8μg的溶液，即得。
3.供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入35～55℃水5～8ml，并在相同温度的水浴中酶解2～2.5小时后，取出，加入甲醇-盐酸(200∶1)的混合液37～35ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加甲醇-盐酸(200∶1)的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
4.测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
本发明测定方法优选为：
(1)色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为51∶49；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素30μg、汉黄芩素8μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入35℃水8ml，并在相同温度的水浴中酶解2小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液35ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
还优选为：
(1)色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为52∶48；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素33g、汉黄芩素9μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入45℃水5ml，并在相同温度的水浴中酶解2小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液37ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
或者：
(1)色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为53∶47；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素35μg、汉黄芩素10μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入50℃水6ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液36ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
或者：
(1)色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为54∶46；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素30μg、汉黄芩素10μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入55℃水7ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液36ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
或者：
(1)色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为54∶46；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素35μg、汉黄芩素8μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入40℃水8ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液35ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
本发明测定方法，供试品溶液滤过优选为先用快速定量滤纸滤过，再用0.45μm微孔滤膜滤过。
本发明的原理如下：
在黄芩药材中的黄芩苷类与黄芩酶是同时共存的，该酶在适宜的温度下，在水溶液中可将黄芩苷类酶解为苷元类，只要药材粒度适宜，在一定时间内，能将黄芩苷类酶解完全，见图5、7。再利用黄芩苷类易溶于水，而黄芩苷元类不溶于水的性质，将酶解完全的悬浮水溶液，加酸性甲醇杀灭黄芩酶的同时保持黄芩素的稳定性，并使酶解的黄芩苷元类充分溶解，滤过，续滤液作为供试品溶液。依据黄芩素和汉黄芩素的进样量在一定范围内，与其峰面积呈现良好的线性关系，而用于定量测定。
本发明的创新点及有益效果如下：
(1)本发明填补了目前为止一直无黄芩中黄芩素与汉黄芩素同时定量测定方法的空白，为黄芩药材中黄芩苷元类的准确定量测定提供了方法，进一步为黄芩苷元类的提取、分离，提供了验证工艺合理性的准确基础含量数据。
(2)本发明首次利用黄芩本身所含的酶将黄芩中的苷类酶解为苷元类，通过酶解温度、时间、精密度、稳定性、重复性、线性范围、回收率等一系列方法学考察，证明方法简便、快捷、准确、重现性好。突破了中药有效成分苷元类含量测定都需酸水解的传统测定方式。本方法既不用酸、又不用碱，无浓缩、无萃取、无蒸发，天然、绿色、环保。
(3)通过多批药材的黄芩苷、黄芩素与汉黄芩素的含量测定数值得知，本发明方法测定的黄芩中黄芩素的含量数值大于由黄芩苷分子量推算出的黄芩素理论含量数值，见表6。
表6 黄芩中黄芩素的含量实测值与理论推算值结果比较
以此，进一步证实最终测定的黄芩素是由多种黄芩苷类酶解，以及原药材中存在的微量游离体相加而得到的总和，如，黄芩苷、黄芩素-7-O-β-吡喃葡萄糖苷、木蝴蝶苷B等，水解后的苷元都是黄芩素以及原药材中存在的微量游离体。以单一的黄芩苷推算出的黄芩素理论含量数值是不准确的。
(4)本发明方法的问世，不仅为黄芩中黄芩素与汉黄芩素的同时定量测定提供了方法，而且还为植物有效成分与其分解酶同时存在的其它中药定量测定，提供了参考依据，具表帅与示范作用。。
附图说明
图1为黄芩素的线性关系图
图2为汉黄芩素的线性关系图
图3为黄芩苷对照品HPLC色谱图
图4为黄芩素对照品HPLC色谱图
图5为汉黄芩素对照品HPLC色谱图
图6为酶解后的黄芩药材HPLC色谱图
图7为酶解前的黄芩药材HPLC色谱图
图8为空白样品HPLC色谱图
具体实施方式
实施例1：
1.色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为51∶49；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
2.对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素30μg、汉黄芩素8μg的溶液，即得。
3.供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入35℃水8ml，并在相同温度的水浴中酶解2小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液35ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
4.测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
实施例2：
1.色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为52∶48；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
2.对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素33g、汉黄芩素9μg的溶液，即得。
3.供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入45℃水5ml，并在相同温度的水浴中酶解2小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液37ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
4.测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
实施例3：
1.色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为53∶47；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
2.对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素35μg、汉黄芩素10μg的溶液，即得。
3.供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入50℃水6ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液36ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
4.测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
实施例4：
1.色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为54∶46；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
2.对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素30μg、汉黄芩素10μg的溶液，即得。
3.供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入55℃水7ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液36ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
4.测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
实施例5：
1.色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为54∶46；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
2.对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素35μg、汉黄芩素8μg的溶液，即得。
3.供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入40℃水8ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液35ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
4.测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
Claims (7)
1.一种黄芩中黄芩素与汉黄芩素定量测定方法，其特征在于：
(1)色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为51～54∶49～46；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素30～35μg、汉黄芩素10～8μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入35～55℃水5～8ml，并在相同温度的水浴中酶解2～2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液37～35ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定法 分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标一点法计算黄芩中黄芩素与汉黄芩素含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
(1)色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为51∶49；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素30μg、汉黄芩素8μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入35℃水8ml，并在相同温度的水浴中酶解2小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液35ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
(1)色谱条件： 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为52∶48；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素33g、汉黄芩素9μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入45℃水5ml，并在相同温度的水浴中酶解2小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液37ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
(1)色谱条件： 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为53∶47；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素35μg、汉黄芩素10μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入50℃水6ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液36ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
(1)色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为54∶46；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素30μg、汉黄芩素10μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入55℃水7ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液36ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
(1)色谱条件： 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液，体积比为54∶46；检测波长：275nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；理论板数：按黄芩素峰计算应不低于3000。
(2)对照品溶液的制备 精密称取黄芩素和汉黄芩素对照品适量于棕色量瓶中，分别加甲醇制成每1ml含黄芩素35μg、汉黄芩素8μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备 取黄芩药材中粉0.02g，精密称定，置于50ml量瓶中，加入40℃水8ml，并在相同温度的水浴中酶解2.5小时后，取出，加入体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液35ml，超声处理20分钟，取出，放冷，加体积比为200∶1的甲醇-盐酸的混合液至刻度，摇匀，滤过，即得。
(4)测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定黄芩素和汉黄芩素以及供试品溶液的峰面积，并计算含量。
7.根据权利要求1-6所述的测定方法，其特征在于供试品溶液的滤过系指先用快速定量滤纸滤过，再用0.45μm微孔滤膜滤过。
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