CN102258598A - 以木瓜有效部位制成的药物、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以木瓜有效部位制成的药物，其特征是它是由按重量百分比计木瓜总皂苷的含量不低于50％的木瓜有效部位提取物制成的药剂。本发明为制备治疗类风湿关节炎药物提供质量可控的原料药。

Description

以木瓜有效部位制成的药物、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种治疗类风湿性关节炎的中药木瓜有效部位木瓜总皂苷及其制备方法。

背景技术

木瓜来源于蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai的干燥近成熟果实。木瓜为常用中药，味酸，性温，入肝脾经。具有平肝舒筋，和胃化湿之功效，用于湿痹拘挛、腰膝酸重疼痛、吐泻转筋、脚气水肿等的治疗。现代研究表明，木瓜含有皂苷、有机酸、黄酮、生物碱、糖类、鞣质、果胶、氨基酸、维生素、矿物质等多种成分，具有抗炎镇痛、保肝、胃肠解痉、抗肿瘤、增强免疫等多种药理活性。木瓜长期以来被用作祛风湿中药，是中医治疗“痹症”复方用药中的主要成分，大量临床资料提示木瓜对类风湿性关节炎有显著疗效。但是，迄今没有为获得制备治疗类风湿关节炎药物的质量可控的原料药的相关报导。

发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处提供一种以木瓜有效部位制成的药物、其制备方法及其应用，为制备治疗类风湿关节炎药物提供质量可控的原料药。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

本发明以木瓜有效部位制成的药物，其特点是它是由按重量百分比计木瓜总皂苷的含量不低于50％的木瓜有效部位提取物制成的药剂。

本发明药物的特点也在于：

所述的木瓜总皂苷中包括齐墩果酸、熊果酸及齐墩果酸皂苷和熊果酸皂苷。

所述药剂包括：胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂、口服溶液剂、膜剂、涂膜剂、软膏剂及凝胶剂。

本发明木瓜总皂苷的提取方法的特点是按如下步骤进行：

a、将木瓜粉末或饮片，加乙醇提取，得提取液；

b、将提取液减压浓缩至无乙醇味，滤过，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱去杂质，再用乙醇洗脱得乙醇洗脱液；

c、收集乙醇洗脱液，减压浓缩至无乙醇味，滤过得浓缩液，向所述浓缩液中加入水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，减压浓缩，减压干燥即得；

本发明制备方法的特点也在于：

所述步骤a中的加乙醇提取是加入药材重量2-15倍量、0-95％乙醇提取2-4次，每次0.5-5小时；

所述步骤b中洗脱用乙醇的浓度为20％-90％；

所述步骤c中加入水饱和正丁醇量为浓缩液体积的1-2倍量。

本发明制备方法的特点还在于：所述大孔吸附树脂为D101、D-3520、NKA、AB-8、XAD-2、XAD-4或D201型。

本发明木瓜总皂苷可以在制备治疗或预防类风湿关节炎的药物中进行应用。

本发明的进一步研究表明，木瓜中五环三萜类皂苷元与皂苷具有明显的抗类风湿性关节炎作用。本发明根据木瓜总皂苷的溶解性能，采用现代提取、分离技术提取木瓜中的皂苷类成分，并控制提取物种木瓜总皂苷的含量不低于50％，为制备治疗类风湿关节炎药物提供了质量可控的原料药。与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明采用现代的提取分离技术制备纯度不低于50％的木瓜总皂苷，药效学试验证明本发明的木瓜总皂苷对于类风湿关节炎有很好的治疗功效。

2、本发明制备方法中采用大孔吸附树脂技术和溶剂萃取技术，使其中的活性成分的含量提高，从而提高药效，而且除去了大量杂质。

3、本发明制备方法操作简便、成本低，非常适合工业化生产。

4、本发明可以与在药学上可接受的辅料混合，制成含有本发明木瓜总皂苷为主要活性成分的口服制剂，以及胃肠道外途径给药的制剂，如膜剂、软膏剂等各种剂型。

附图说明

图1为木瓜总皂苷对AA大鼠踝关节病理组织HE染色图。

图1中A图片为正常组，B图片为模型组，C图片为木瓜总皂苷小剂量组，D图片为木瓜总皂苷中剂量组，E图片为木瓜总皂苷大剂量组，F图片为GTW组。

以下动物试验对本发明有益效果作进一步说明：采用佐剂性关节炎(AA)模型研究木瓜总皂苷的药效，并和目前市场上主要的治疗药雷公藤多苷片作对照。其方法和结果如下：

1实验材料

1.1动物

Sprague-Dawley(SD)大鼠，

体重180g±20g；由安徽医科大学实验动物中心提供。合格证号：皖医实动准字01号。

1.2药物与试剂

木瓜总皂苷(黄色粉末，纯度为63.9％)；雷公藤多苷片(GTW，阳性对照药，上海复旦复华)，实验时均以0.5％羧甲基纤维素钠配制成所需浓度供灌胃给药用。卡介苗(BCG)：50mg/支，上海生物制品研究所生产。

2实验方法

2.1大鼠AA模型诱导

将BCG 80℃、1h灭活后，以高压灭菌的液体石蜡配成10mg·ml^-1的乳剂，充分碾磨、混匀，即得弗氏完全佐剂(FCA)，于每鼠左后足跖皮内注射FCA0.1ml致炎。

2.2动物分组及给药方案

大鼠随机均分为6组：正常组；佐剂性关节炎(AA)模型组；木瓜总皂苷小剂量(20mg·kg^-1)组；木瓜总皂苷中剂量(40mg·kg^-1)组；木瓜总皂苷大剂量(80mg·kg^-1)组；雷公藤多苷(40mg·kg^-1)对照组。除正常组外，其余各组均以弗氏完全佐剂于每鼠右后足趾皮内注射0.1ml致炎。

治疗用药：于致炎后第17天至第24天分别连续灌胃(1ml·100g^-1)给药，每日1次，正常组及模型组给予等容量的0.5％羧甲基纤维素钠，连续8天。

2.3关节肿胀度测定

大鼠于致炎前、致炎后第3、7、10、14、17、21、24天(d3、d 7、d 10、d 14、d 17、d 21、d 24)分别在足容积测量仪上测定右侧(非致炎侧)足容积，某一时间致炎后与致炎前足容积的差值即为该时大鼠足肿胀度。

2.4屈关节疼痛评分

疼痛试验参照文献中慢性关节痛的测定评分方法及标准略以改进。踝关节疼痛试验评分方法：将大鼠装进特制的鼠筒内，后腿及尾部伸出筒外，稳定几分钟后测定，向脚掌侧缓慢屈曲动物的一侧踝关节，每隔5秒进行一次，共5次。屈关节时，动物出现短促而明显的缩腿反应或嘶叫则评为1分，无反应为0分，每侧踝关节的评分为0～5分。

2.5多发性关节炎指数(arthritis index，AI)评分

致炎后d 14、d 17、d 21、d24观察并记录全身关节病变程度，全身病变按5级评分法评价，根据未注射佐剂的其余3个肢体的病变程度累计积分，计算出AI。0分：无红肿；1分：趾关节红肿；2分：趾关节和足跖肿胀；3分踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AI。

2.6滑膜组织的采集

大鼠处死后，置于0.1％新洁尔灭液中浸泡15min，于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，可见平滑光亮的滑膜组织；用手术刀分离关节囊的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织。用同法采集另一侧膝关节滑膜层组织。每一只大鼠可采集双侧滑膜组织约15～20mg。

2.7滑膜细胞的分离与培养：胶原酶-胰蛋白酶消化法

取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用D-Hank’s液反复洗3次后剪成1～2mm²小块，将其置于2ml 20％胎牛血清的DMEM培养液和2ml 0.4％II型胶原酶的25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养消化2h。未粘附的细胞移至离心管中，300×g离心10min，弃上清，再加入0.25％胰蛋白酶4ml，在37℃、5％CO₂培养箱中培养消化30min，200目尼龙网过滤，300×g离心10min，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，弃去未粘附细胞(如淋巴细胞、红细胞)，此时的贴壁细胞为原代滑膜细胞。

2.8滑膜细胞上清液的制备

经以上胶原酶-胰蛋白酶消化法分离得到的单个滑膜细胞用含有5mg·L^-1LPS的DMEM培养液配制滑膜细胞悬液(5×10⁸cells·L^-1)，加入24孔培养板中，每孔1ml，于37℃、5％CO₂中培养48h，收集上清液，离心(300×g，10min)，过滤(0.22μm滤膜)，-20℃冰箱保存待测。

2.9TNFα、PGE₂含量测定

取细胞培养上清液，采用放射免疫测定法，分别按¹²⁵I TNFαRIA试剂盒(北京邦定泰克生物技术有限公司提供)、¹²⁵IPGE₂RIA试剂盒(苏州医学院提供)说明书步骤进行。

2.10膝关节病理组织学检查

大鼠膝关节用10％甲醛固定、5％HNO₃脱钙、不同浓度梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，OLYMPUS光学显微镜观察踝关节病理组织学变化并摄片。

2.11统计学处理

计量资料的数据以均数±标准差表示；用方差分析或Student’s t检验比较组间差异的显著性。

3结果

3.1木瓜总皂苷对AA大鼠的治疗作用

本实验各免疫大鼠注射FCA后免疫侧(左侧)足趾出现早期炎症反应，d1～d3足肿胀达高峰，即急性局部炎症期(原发性反应期)；然后逐渐减轻，即急性炎症缓解期(d7～d12)；以后因迟发型超敏反应，表现为以多发性关节炎为特征的慢性周身炎症：对侧(右侧)后肢、前肢肿胀明显，主要出现在踝关节，也累及整个足趾，并于足趾关节间和前足趾出现关节肿大，耳和尾部伴有红斑和炎性小结，大鼠倦怠，食量减少、消瘦、多发性关节肿胀和触痛，活动障碍等类似RA的症状，即继发性反应期。将AA大鼠72只于致炎后d14随机分组，各组大鼠分别于免疫后d17～d24灌胃给药，进行以下指标检测。

3.1.1对AA大鼠继发侧关节肿胀度的影响

AA模型组在致炎后d17、d21、d24继发侧足肿胀度与正常组比较明显增加；与模型组相比，木瓜总皂苷(20，40，80mg·kg^-1)于用药5d后(d21、d24)可明显减轻AA大鼠的足肿胀度；雷公藤多苷(40mg·kg^-1)对照组对AA大鼠继发侧关节肿胀的抑制作用与木瓜总皂苷相当(表1所示)。

表1木瓜总皂苷治疗用药对AA大鼠继发侧关节肿胀度的影响(n＝9.

)

^**P＜0.01vs正常组；^##P＜0.01vs AA模型组.

3.1.2对关节疼痛评分的影响

AA模型组继发侧屈关节疼痛反应在d17、d21、d24显著升高，木瓜总皂苷(40，80mg·kg^-1)用药5d后(d21、d24)、木瓜总皂苷20mg·kg^-1用药8d后(d24)可明显缓解AA大鼠关节疼痛；雷公藤多苷(40mg·kg^-1)具有相近似的效应(表2所示)。

表2木瓜总皂苷治疗用药对AA大鼠关节疼痛评分的影响(n＝9.

)

^**P＜0.01vs正常组；^##P＜0.01vs AA模型组.

3.1.3对多发性关节炎指数的影响

注射FCA致炎后d16，各模型大鼠开始出现全身症状，表现为未注射佐剂的其余3个肢体关节红肿、变形，耳部及尾部结节，行走不便。木瓜总皂苷40，80mg·kg^-1在用药5天后(d21、d24)可明显抑制AA大鼠全身继发性关节病变；雷公藤多苷(40mg·kg^-1)具有相近似的效应；木瓜总皂苷20mg·kg^-1在用药8天后(d24)可明显抑制AA大鼠全身继发性关节病变(表3所示)。

表3木瓜总皂苷治疗用药对AA大鼠多发性关节炎指数的影响(n＝9.)

^##P＜0.01，^#P＜0.05vs AA模型组.

3.2木瓜总皂苷对滑膜细胞产生IL-1、TNFα和PGE₂水平影响

木瓜总皂苷(20，40，80mg·kg^-1)和GTW(40mg·kg^-1)均于FCA诱发大鼠AA后d17～d24灌胃给药，末次给药后用酶消化法分离滑膜细胞进行实验，由于采用滑膜细胞的原代培养，所检测到的IL-1、TNFα和PGE₂水平代表总滑膜细胞的分泌能力。木瓜总皂苷(20，40，80mg·kg^-1)和GTW(40mg·kg^-1)不同程度明显下调AA大鼠滑膜细胞培养上清中IL-1、TNFα和PGE₂水平，表明对AA大鼠滑膜细胞分泌功能的亢进有显著抑制作用(表4所示)。

表4木瓜总皂苷对脂多糖诱导的滑膜细胞产生IL-1、TNFα和PGE₂水平影响(n＝6，

)

^**P＜0.01vs正常组；^##P＜0.01，^#P＜0.05vs AA模型组.

3.3病理形态学检查

光学显微镜下观察，正常大鼠膝关节的病理形态特点是：滑膜组织内膜表面光滑，多由单层体积较大、核深染的扁平型或底立方体型滑膜细胞组成；正常关节软骨表面光滑(图1中A图片所示)，由表面向下大致分为四层：第一层由1～3层扁平状软骨细胞组成的扁平层，第二层是过度细胞层，然后是呈柱状排列的放射层，最后是钙化软骨层，过度层与软骨层间有一深染的波浪状线，即为潮线。

AA大鼠关节病变主要表现为：滑膜组织增厚，由3～8层滑膜细胞组成，滑膜细胞多呈卵圆型；有中、重度滑膜组织充血、水肿；排列疏松、不规则，增生的滑膜组织伴坏死；滑膜组织中可见淋巴细胞、单核细胞及少数散在分布的中性粒细胞浸润；滑膜下可见成纤维细胞增生；有明显的血管翳(其中有较多的新生毛细血管)形成，并向剥脱、破损的软骨表面爬行，血管翳起始的滑膜、软骨交界处滑膜细胞增生尤为活跃。在炎性滑膜组织覆盖下的软骨表面，可见软骨表层组织变性、坏死；关节软骨萎缩、变薄；软骨细胞数减少、基质变性，着色深浅不一；软骨破坏、肥大、剥脱或断裂，被纤维血管所取代；胶原纤维增生。骨髓腔内骨髓细胞减少，脂肪细胞大量增多，可见纤维素，有大量炎细胞浸润(图1中B图片所示)。

各用药组均可不同程度减轻以上病理变化，如图1所示，图1中A图片为正常组，B图片为模型组，C图片为木瓜总皂苷小剂量组，D图片为木瓜总皂苷中剂量组，E图片为木瓜总皂苷大剂量组，F图片为GTW组。

，镜下表现为：关节滑膜组织中轻度的滑膜增生、淋巴细胞浸润减少；滑膜下有少量纤维增生；血管翳明显减轻，其中的新生毛细血管数量减少；骨髓腔中脂肪细胞明显减少，骨髓细胞密集；软骨受损程度明显减轻，但可见软组织中的少量炎细胞。

综上所述，木瓜总皂苷对佐剂性关节炎(AA)具有治疗作用，进一步的研究发现其作用与抗炎、抑制AA大鼠滑膜细胞分泌功能的亢进等有关。

具体实施方式

称取木瓜药材饮片，加至醇-水体系中，乙醇的浓度为0-95％，重量比为木瓜∶乙醇＝1∶2-15，提取2-4次，每次提取时间0.5-5小时，得乙醇提取液；将乙醇提取液进行减压浓缩至无乙醇味，滤过，上D101、D-3520、NKA、AB-8、XAD-2、XAD-4或D201型大孔吸附树脂柱；先用水洗脱去杂质，再用20％-90％乙醇洗脱得乙醇洗脱液；收集乙醇洗脱液，减压浓缩至无乙醇味，滤过，加入水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，减压浓缩，减压干燥，得木瓜总皂苷粉末。

按照上述方法制得的木瓜总皂苷，以齐墩果酸为对照品，采用冰醋酸-高氯酸比色法测定总皂苷含量，其中总皂苷含量可以超过50％。

各制剂药物在药学上可接受的载体是口服制剂辅料或胃肠外途径给药的辅料。

上述方法制得的制剂包括胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂、口服溶液剂、膜剂、涂膜剂、软膏剂及凝胶剂等制剂。

实施例1：

取木瓜饮片50kg，放入提取罐中，加500L的70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，上D101大孔吸附树脂柱，用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后，再用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，滤过，加入10％氢氧化钠溶液调pH值为9.0，加2倍量水饱和正丁醇萃取两次，合并正丁醇液，减压浓缩至近干，减压干燥，得木瓜提取物0.95kg，经测定，其中木瓜总皂苷含量为63.9％。

实施例2：

取木瓜饮片50kg，放入提取罐中，加600L水提取3次，每次2.5小时，提取液趁热过滤后，放冷，上D101大孔吸附树脂柱，用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后，再用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，滤过，加入10％氢氧化钠溶液调pH值为8.0，加1倍量水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇液，减压浓缩至近干，减压干燥，得木瓜提取物1.07kg，经测定，其中木瓜总皂苷含量为58.3％。

实施例3：

取木瓜饮片50kg，放入提取罐中，加500L 80％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，上D101大孔吸附树脂柱，用水充分洗脱至流出液为澄清且无还原糖反应后，再用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，滤过，加入10％氢氧化钾溶液调pH值为9.0，加2倍量水饱和正丁醇萃取两次，合并正丁醇液，减压浓缩至近干，减压干燥，得木瓜提取物0.89kg，经测定，其中木瓜总皂苷含量为67.0％。。

实施例4：

在GMP净化车间，将上述木瓜总皂苷与适宜辅料混合后，加入70％乙醇作为润湿剂，挤压制粒，干燥，填充胶囊，制成胶囊剂，每粒胶囊含药量为0.1-0.3克，患者每次服用1-4粒，每日服用2-3次。

Claims (7)

1.一种以木瓜有效部位制成的药物，其特征是它是由按重量百分比计木瓜总皂苷的含量不低于50％的木瓜有效部位提取物制成的药剂。

2.根据权利要求1所述药物，其特征是所述的木瓜总皂苷中包括齐墩果酸、熊果酸及齐墩果酸皂苷和熊果酸皂苷。

3.根据权利要求1所述的药物，其特征是所述药剂包括：胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂、口服溶液剂、膜剂、涂膜剂、软膏剂及凝胶剂。

4.一种木瓜总皂苷的提取方法，其特征是按如下步骤进行：

a、将木瓜粉末或饮片，加乙醇提取，得提取液；

b、将提取液减压浓缩至无乙醇味，滤过，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱去杂质，再用乙醇洗脱得乙醇洗脱液；

c、收集乙醇洗脱液，减压浓缩至无乙醇味，滤过得浓缩液，向所述浓缩液中加入水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，减压浓缩，减压干燥即得；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：

所述步骤a中的加乙醇提取是加入药材重量2-15倍量、0-95％乙醇提取2-4次，每次0.5-5小时；

所述步骤b中洗脱用乙醇的浓度为20％-90％；

所述步骤c中加入水饱和正丁醇量为浓缩液体积的1-2倍量。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述大孔吸附树脂为D101、D-3520、NKA、AB-8、XAD-2、XAD-4或D201型。

7.木瓜总皂苷在制备治疗或预防类风湿关节炎的药物中的应用。

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