CN111110690A

CN111110690A - 竹节参皂苷Ⅳa在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的疾病上的应用

Info

Publication number: CN111110690A
Application number: CN202010038351.7A
Authority: CN
Inventors: 袁丁; 张长城; 刘朝奇; 袁成福; 何毓敏; 周志勇; 赵海霞; 顿耀艳; 李聪
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-05-08

Abstract

本发明提供一种竹节参皂苷Ⅳa在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎疾病的药物上的应用。优选方案为竹节参皂苷Ⅳa通过miR‑17‑5p/MFN2信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎的药物。结果表明与正常对照组相比，HFD+CCl₄组中肝指数明显增加，ALT、TG及GLU的含量明显增高；形态学表现出明显的脂肪变性及胶原纤维沉积；脂代谢相关基因、炎症因子IL‑6、IL‑1β及miR‑17‑5p的mRNA表达水平明显增加，MFN2的mRNA表达水平明显降低，MFN2的蛋白水平降低。经竹节参皂苷Ⅳa干预后，ALT、TG及GLU的含量下降，形态学上脂肪变性减轻，胶原纤维沉积减少，脂代谢相关基因、炎症因子IL‑6、IL‑1β及miR‑17‑5p的mRNA表达水平下降，MFN2的mRNA表达水平升高，MFN2的蛋白水平也升高。竹节参皂苷Ⅳa对NASH有保护作用，且与调控miR‑17‑5p/MFN2信号通路有关。

Description

竹节参皂苷Ⅳa在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的疾病上的应用

技术领域

本发明涉及一种竹节参皂苷Iva的制药用途，具体为竹节参皂苷Ⅳa在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎疾病的药物上的应用。属于生物制药技术领域。

背景技术

非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH)是一种由肝脏内脂肪过度积聚(脂肪变性)引起的慢性肝损伤和炎症(肝炎)的疾病。属于非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)进程中的一种病理类型，NASH伴有炎症、细胞死亡和纤维化，组织学特征为伴有或不伴有肝窦周围纤维化和脂肪变性的肝细胞和小叶炎症。是NAFLD发展到肝硬化和肝癌的关键环节。

MicroRNA(miRNA)是一类12-25个核苷酸的内源性非编码RNA，在各种基本的生物学过程，例如发育，分化和凋亡中都发挥着非常重要的调控作用。多项研究表明，miRNA在脂质代谢和NASH中发挥重要的调控作用。Mitofusin 2 (MFN2)是线粒体膜蛋白，有连接内质网膜和线粒体的作用，其耗竭可导致线粒体形态变化、内质网应激，并在维持线粒体代谢、线粒体相关内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)膜(Mitochondria-associated ERMembranes,MAMs)、胰岛素信号传导和能量稳态方面发挥着重要作用。其表达可能受到miRNA的调控。

竹节参皂苷Ⅳa(ChikusetsuSaponinⅣa,CHS-Ⅳa)是一种广泛存在于竹节参等传统中药植物中的植物源性的皂苷类化合物。现代药理研究证明，其具有降血脂、降血糖、抗病毒、抗炎等多种生物活性。基于以上研究背景，本发明的技术方案提出，竹节参皂苷Ⅳa干预miRNA/MFN2介导炎症反应从而改善NASH的发生发展。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种竹节参皂苷Ⅳa在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎疾病的药物上的应用。

所述的竹节参皂苷Ⅳa在制备通过miR-17-5p/MFN2信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎的药物上的应用。

所述的竹节参皂苷Ⅳa的用量为7mg/kg-35mg/kg。

本发明的技术方案采用SPF级Balb/c雄性小鼠40只，分为正常对照组(附图标记为control)、HFD+CCl₄组(7mg/kg，附图标记为HFD+CCl₄)、CHS-Ⅳa 低剂量组(35mg/kg，附图标记为Ⅳa-L)、CHS-Ⅳa高剂量组(附图标记为Ⅳa-H)，予以自制高脂饮食(药物添加至饲料)，并每周2次腹腔注射2％CCl₄油溶液，持续5周，处死后计算肝指数，检测血清生化指标，HE及Masson染色检测肝脏形态学变化，qPCR检测脂代谢相关基因、炎症因子IL-6、IL-1β、miR-17-5p 及MFN2的表达情况，Western blot检测MFN2蛋白表达水平。结果显示与正常对照组相比，HFD+CCl₄组中肝指数明显增加，ALT、TG及GLU的含量明显增高；形态学表现出明显的脂肪变性及胶原纤维沉积；脂代谢相关基因、炎症因子 IL-6、IL-1β及miR-17-5p的mRNA表达水平明显增加，MFN2的mRNA表达水平明显降低，MFN2的蛋白水平降低。经CHS-Ⅳa干预后，ALT、TG及GLU 的含量有所下降，形态学上脂肪变性有所减轻，胶原纤维沉积减少，脂代谢相关基因、炎症因子IL-6、IL-1β及miR-17-5p的mRNA表达水平有所下降，MFN2 的mRNA表达水平有所升高，MFN2的蛋白水平也升高。结论：CHS-Ⅳa对NASH 有保护作用，其机制可能与调控miR-17-5p/MFN2信号通路有关。

附图说明

图1为竹节参皂苷Ⅳa对NAFLD的改善作用，A为肝指数，B为甘油三脂指标， C为尿糖指标，D为丙氨酸转氨酶指标，*P<0.05,**P<0.01；#P<0.05,##P<0.01。

图2为200倍率下竹节参皂苷Ⅳa对NAFLD组织病理学改善作用，A为正常对照组，B为HFD+CCl₄，C为CHS-IVa低剂量组，D为CHS-IVa高剂量组。

图3为200倍率下竹节参皂苷Ⅳa对NAFLD纤维化的改善作用，A为正常对照组，B为HFD+CCl₄，C为CHS-IVa低剂量组，D为CHS-IVa高剂量组。

图4为竹节参皂苷Ⅳa对NAFLD脂质代谢基因的调节作用A为FASN的mRNA 的水平，B为chREBP的mRNA的水平，C为ACSL的mRNA的水平，D为LXR 的mRNA的水平，*P<0.05,**P<0.01；#P<0.05；n＝4。

图5为竹节参皂苷Ⅳa对NAFLD炎症相关基因的调节作用，A为IL-6的mRNA 检测，B为IL-1β的检测*P<0.05,**P<0.01；#P<0.05,##P<0.01；n＝4。

图6中A：生物信息学预测结果，B:实时定量PCR检测miR-17-5p的表达，*P<0.05；#P<0.05；n＝4。

图7为实时定量PCR检测MFN2的表达，**P<0.01；#P<0.05,##P<0.01；n＝4。

图8为western blot检测MFN2的表达，*P<0.05；#P<0.05；n＝4；其中电泳图中 1-2:正常对照组；3-4:HFD+CCl₄；5-6:CHSⅣa-L；7-8:CHSⅣa-H。

具体实施方式

本发明实验过程中的动物：SPF级Balb/c雄性小鼠40只，体重在20～22g 之间，周龄为4～6周，由湖北省宜昌市三峡大学实验动物中心提供，其动物生产许可证号((SCXK)(鄂)2011-0061)。所有的动物实验都遵循伦理委员会相关动物使用和保护规定进行操作。

动物的饲料：普通动物饲料由三峡大学实验动物中心提供，高脂高糖饲料是按照普通饲料(53.75％)、胆固醇(5％)、猪油(20％)、胆酸钠(0.25％)、果糖(20％)、食盐(1％)的重量比混合而成，用药组饲料在高脂高糖饲料的基础上采用竹节参皂苷Ⅳa低剂量(7mg/kg)和高剂量(35mg/kg)加入饲料中,待饲料固定成型后送到湖北省农业科学院农产品加工与核农研究所辐照灭菌备用。饲料具体营养成分参考文献“木瓜提取物对小鼠脂肪肝的保护作用”《现代食品科技》2018 第34卷。

主要试剂：ALT、TG、GLU购买于碧云天公司；胆固醇购买于国药集团化学试剂有限公司；逆转录试剂盒购买于大连宝生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒购买于大连宝生物科技有限公司；PCR引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司；兔单克隆抗体MFN2和兔单克隆抗体GAPDH购买于上海优宁维生物科技有限公司；Donkey Anti-Rabbit IgG H&L购买于上海优宁维生物科技有限公司。

主要仪器：实时荧光定量PCR仪来自德国Applied Biosysterms公司；Gel Logic-200凝胶成像分析系统来自美国KODAK公司；Gene Genius凝胶分析系统来自英国SYNGNE公司；ChemiScope mini化学发光成像显影仪来自上海勤翔科学仪器有限公司；显微镜(TS100)来自日本尼康公司。

本发明的技术方案进行的实验过程的方法

小鼠脂肪性肝纤维化模型的建立

SPF级BALB/C雄性小鼠40只，体重20-22g，随机将其分成4组，每组10只。分组为正常对照组(附图标记为control)、HFD+CCl₄组(7mg/kg，附图标记为HFD+CCl₄)、CHS-Ⅳa低剂量组(35mg/kg，附图标记为Ⅳa-L)、CHS- Ⅳa高剂量组(附图标记为Ⅳa-H)，前1一周进行适应性喂养，按照8g/只/天进行饲喂；从第二周开始给予HFD+CCl₄模型组小鼠自制的高脂饲料，并开始进行 20g/250μL剂量腹腔注射2％CCl₄油溶液，每周两次，持续注射5周，处死小鼠，收集血液并进行肝脏取材，称重。

小鼠血清生化指标的检测

小鼠采取眼球取血方式收集血液，将血液静置30min，以3000r/min离心 10min，离心后取上清即为血清，用试剂盒检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT) 的水平；同样用试剂盒检测血清中甘油三酯(TG)及葡萄糖(Glucose)的水平。

肝组织HE染色

切取大小为10mm×3mm的新鲜肝脏大叶组织块放入组织包埋盒中，置于中性福尔马林固定液中固定，48h后转入75％乙醇中，8h后再经过常规脱水处理，石蜡进行包埋，再将蜡块切片为厚度4μm的组织切片，固定于防脱载玻片上，进行常规HE染色，普通显微镜下观察肝组织病理变化情况并取图。

肝组织Masson染色

同HE法制作组织病理切片，将切片置于60℃烤箱中烤片2h待石蜡融化后进行脱蜡处理，同时准备Masson染色相关试剂；染色前滴加超纯水润湿肝脏组织，向肝组织上滴加核染液R1 50μL/个肝组织，染色1min，弃去，冲洗液冲洗35s；滴加R2浆染液染色30～60s，弃去，冲洗液冲洗35s(R2染色时间不可太长否则会导致胞浆着色过深，不利于R3褪色)；R3黄色分色液分色6～8min 左右，(镜下观察样本中胶原纤维部分褪成淡粉红色为宜，如果褪色不佳，可适当延长时间，使得胶原纤维更易着色)，弃去分色液；直接用R4蓝色复染液染色5min左右(镜下观察胶原纤维的着色情况，若着色不深可再次用R4蓝色复染液染色复染2～3min以达到理想效果)，倒丢，用无水乙醇冲洗35s，3次；放置超净台风干后，中性树脂封片，普通显微镜下观察并取图。

实时荧光定量PCR检测肝组织中脂代谢相关基因、炎症相关基因、miR-17-5p 及MFN2的表达

称取冻存的小鼠肝组织50mg，采用Trizol法提取小鼠肝脏组织的总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳(100V,100mA,20min)检测RNA的完整性。用微量核酸仪测定RNA的浓度，再经逆转录试剂盒逆转录得到cDNA。miR-17-5p以U6 为内参，MFN2以GAPDH为内参，进行扩增。反应总体系为10μL，分别为SYBR Green 5μL，RNase-free water 2.4μL，引物0.4μL(引物浓度为10μM)，cDNA 2 μL(为逆转后原液稀释10倍)，ROX 0.2μL。反应条件为：95℃5min；95℃30 s；60℃30s；72℃30s；cycles 40；72℃10min；溶解曲线从56℃到98℃，每0.3℃读取一次。引物序列见表1，PCR反应结束后读取CT值，计算2^-ΔΔCT分析相关基因在各组中的表达情况。

表1 PCR引物

Western blot检测小鼠肝组织中MFN2蛋白的表达

称取冻存的小鼠肝组织50mg，加入400μL含有蛋白酶抑制剂(100:1)的 RIPA蛋白裂解液，充分匀浆，12000rpm离心10min，取上清液即为蛋白液，继续冰上静置30min，随后采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，采用4:1的体积比加入5*上样缓冲液，充分混匀后100℃煮沸10min制样，进行SDS-PAGE，转膜；用5％牛奶室温封闭1h。加入MFN2抗体(1:1000)及GAPDH抗体(1:5000), 4℃过夜，TBST洗3次，每次10min。加入二抗羊抗兔IgG-HRP(1:3000)室温结合1h；TBST洗3次，ECL显影，观察并记录显影结果。

统计学处理方法：根据所得的实验数据，采用SPSS 22.0软件来进行数据分析，Western blot的结果利用Image J软件分析，然后数据都用均数±标准差(x±s) 来表示；同时利用单因素方差分析组间数据，以P<0.05判定为有统计学意义。 CHS-Ⅳa改善小鼠肝脏损伤

通过称量小鼠体重及肝重，计算得到肝指数，结果显示，与正常对照组比较， HFD+CCl₄组小鼠肝指数明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。而血清生化指标检测结果显示，在HFD+CCl₄组中血清ALT、TG及GLU的含量明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示HFD+CCl₄组小鼠肝组织出现脂质沉积及肝细胞损伤。经竹节参皂苷Ⅳa干预之后，可见上述指标均有所下降，提示竹节参皂苷Ⅳa能够干预小鼠的肝损伤过程。结果见图1。 CHS-Ⅳa改善小鼠脂肪性肝纤维化病理变化

小鼠肝脏组织HE染色及Masson染色，显微镜观察结果见图2、3。与正常对照组比较，HFD+CCl₄组小鼠肝脏出现肝细胞形态模糊，排列紊乱，肝索结构不清晰，并可见明显的脂肪空泡，及出现区域性肝细胞肿胀，坏死，伴随大量炎性细胞浸润，肝小叶可观察到明显的胶原纤维沉积增加，呈现放射状排列。这些结果提示HFD+CCl₄组小鼠肝脏出现了明显的脂肪性肝纤维化病变。经药物治疗之后与HFD+CCl₄组相比，可见肝细胞形态较清晰，排列较紧密，脂肪空泡有一定的改善，胶原纤维沉积减少，提示小鼠脂肪性肝纤维化病变有一定的缓解。

CHS-Ⅳa调节小鼠肝组织中脂代谢相关基因的表达

Real-time PCR结果显示，与正常对照组比较，HFD+CCl₄组中脂代谢相关基因FASN、chREBP、ACSL、LXR的mRNA的水平明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示在HFD+CCl₄组中肝脏脂代谢出现异常，当使用竹节参皂苷Ⅳa干预之后，我们发现这些脂代谢相关基因的mRNA的水平有所下降，表达量趋向于正常对照组水平，提示竹节参皂苷Ⅳa在该模型中能够干预肝脏的脂质代谢。结果见图4。

CHS-Ⅳa调节小鼠肝组织中炎症相关基因的表达

Real-time PCR结果显示，与正常对照组比较，HFD+CCl₄组中炎症相关基因 IL-6、IL-1β的mRNA的水平明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示在 HFD+CCl₄组中肝脏出现炎症反应，综合上述结果，可见小鼠NASH模型成功建立。当使用竹节参皂苷Ⅳa干预之后，我们发现这些炎症相关基因的mRNA的水平有所下降，表达量趋向于正常对照组水平，提示竹节参皂苷Ⅳa在NASH模型中能够降低肝脏的炎症反应。结果见图5。

CHS-Ⅳa调节小鼠肝组织中miR-17-5p的表达

通过生物信息学分析，我们发现MFN2是miR-17-5p的靶基因之一， miR-17-5p能够调控MFN2的表达。结果见图6-A。进一步我们通过Real-time PCR 检测了小鼠肝组织中miR-17-5p的表达情况，我们发现，在HFD+CCl₄组中， miR-17-5p的表达水平较正常组比较明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示在小鼠NASH模型中miR-17-5p可能参与了该疾病的发生与发展。而药物组相较于HFD+CCl₄组有一定程度的下降趋势，提示竹节参皂苷Ⅳa在小鼠 NASH模型中能够调控miR-17-5p的表达。结果见图6-B。

CHS-Ⅳa调节小鼠肝组织中MFN2的mRNA及蛋白的表达为了了解MFN2在该模型中表达的变化情况，我们首先使用Realtime PCR检测了其mRNA的表达水平。结果见图7，我们发现，与正常对照组比较，HFD+CCl₄组中MFN2的mRNA水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，经过竹节参皂苷Ⅳa的干预之后，MFN2的mRNA表达水平有所回升接近正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。随后我们通过Westernblot检测了MFN2的蛋白表达水平，结果可以看到，在HFD+CCl₄组中MFN2的蛋白水平明显低于正常对照组，而药物干预之后发现其蛋白水平有一定的升高，随后使用Image J软件统计分析得到这些表达差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图8。提示在NASH的发生发展过程中，MFN2可能起到了一定的调控作用，而竹节参皂苷Ⅳa能够通过改善MFN2的表达从而缓解NASH的发生与发展。

Claims

1.竹节参皂苷Ⅳa在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎疾病的药物上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，竹节参皂苷Ⅳa在制备通过miR-17-5p/MFN2信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎的药物上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的竹节参皂苷Ⅳa的用量为7 mg/ kg-35 mg/ kg。