CN105169367A - Trpc6在制备诊疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明及TRPC6在制备诊疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用。发明人从离子通道蛋白与肾脏I/R损伤的关系入手，探索TRPC6在肾脏I/R中调控程序性坏死的作用及其机制，揭示了信号通路TRPC6→Ca离子→CaMKII→PARP-1在肾缺血再灌注损伤中的作用，为肾脏I/R的防治提供新的思路和新的治疗靶点，具有重要的实际应用价值。

Description

TRPC6在制备诊疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及TRPC6在制备诊疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

缺血再灌注损伤(I/R)是指组织器官在缺血的基础上恢复血流供应以后，组织器官的损伤程度反而加重的现象。I/R普遍存在于临床各科的工作实践当中，尽管曾经有多种I/R的损伤学说被提出，例如：氧异常、钙异常、PH异常等等。但是，I/R完整的发病机制迄今为止尚未能得到完全的阐明。肾脏由于其独特的生理结构和功能特点，是极易受缺血缺氧刺激的影响的靶器官，从而常常因为I/R而发生急性肾损伤(Acutekidneyinjury，AKI)。AKI的典型病理改变是急性肾小管坏死，所以目前认为肾小管上皮细胞的损伤在肾脏I/R的过程中居于关键地位。由于I/R发生发展的机制尚未能够完全阐明，导致目前临床上尚无有效的防治I/R的手段。所以，探讨肾脏I/R的机制已成为临床相关领域中的重大课题，而努力寻找到一种能够有效防治肾脏I/R的有效措施，将会产生重大的社会和经济效益。

传统型瞬时性受体电位通道6(transientreceptorpotentialcationchannel，TRPC6)是属于传统型瞬时性受体电位通道(TRPC)家族的成员之一，是位于细胞膜上的非选择性的阳离子通道。TRPC6在人肾小管上皮细胞上表达，我们在前期的预实验中发现TRPC6在肾脏I/R模型中表达也是增加的，并能够上调和sirtuin-2具有相同底物NAD+的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)的水平。凋亡(apoptosis)是一种细胞自我调控的主动病理生理过程；而坏死(necrosis)则被认为是相对不可逆的细胞死亡过程，难以通过药理学途径的干预得到阻止或者说逆转。然而，目前的研究发现：在细胞坏死的大背景中，至少有相当部分的细胞坏死可以像凋亡那样，由特定的刺激信号启动，并且按照一定的信号传导通路和执行程序发生，具有精密的调控机制，并被命名为“necroptosis”(程序性坏死，又被译做坏死性凋亡)。所以，根据目前的研究进展和预实验结果，在本研究中，我们从离子通道蛋白与肾脏I/R损伤的关系入手，拟探索TRPC6在肾脏I/R中调控necroptosis的作用及其机制，以便为肾脏I/R的防治提供新的思路和新的治疗靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供TRPC6基因和/或TRPC6蛋白在制备诊疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用。

进一步，所述TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通过抑制程序性坏死(necroptosis)和/或修复细胞DNA损伤诊疗肾缺血再灌注损伤。优选的，TRPC6基因和/或TRPC6蛋白高表达从而抑制程序性坏死(necroptosis)和/或修复细胞DNA损伤诊疗肾缺血再灌注损伤。

程序性坏死(necroptosis)是指在细胞坏死的大背景中，至少有相当部分的细胞坏死可以像凋亡那样，由特定的刺激信号启动，并且按照一定的信号传导通路和执行程序发生，具有精密的调控机制，并被命名为“necroptosis”(程序性坏死)。

进一步，所述TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通过调控PARP-1基因和/或PARP-1蛋白的表达诊疗肾缺血再灌注损伤。

TRPC6引起的PARP-1表达适量上调，一方面起到的了DNA修复和细胞生存的调控功能，另一方面，PARP-1又是necroptosis关键调节酶sirtuin-2的竞争性抑制物，二者的功能均依赖于辅因子NAD+的水平，在再灌注后，氧供恢复，NAD+的水平回升，但此时PARP-1和sirtuin-2的水平都是升高的。PARP-1要发挥DNA修复作用需要NAD+参与，会直接影响sirtuin-2的活性，导致necroptosis通路激活受到影响，减少细胞坏死。

进一步，TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通过作用信号通路TRPC6→Ca离子→CaMKII→PARP-1诊疗肾缺血再灌注损伤。

在肾缺血再灌注损伤模型中，TRPC6激动剂可以上调PARP-1表达，TRPC6拮抗剂可以下调PARP-1的表达；同时，CaMKII的抑制剂KN-93也可以抑制PARP-1的表达证实了信号通路TRPC6→Ca离子→CaMKII→PARP-1存在于肾缺血再灌注损伤模型中。

本发明的目的在于提供调节剂在制备诊疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述调节剂能够调控下列任意一种或几种组分的表达：TRPC6、CaMKII、PARP-1、程序性坏死调节酶；和/或调控程序性坏死调节酶的活性。优选的，所述的调节剂调节信号通路TRPC6→Ca离子→CaMKII→PARP-1的表达。

进一步，所述调节剂能够调控下列任意一种或几种组分的高表达：TRPC6、CaMKII、PARP-1；和/或调控程序性坏死调节酶低表达或活性降低。进一步，所述调节剂包括TRPC6激动剂，优选OAG；TRPC6拮抗剂，优选SKF96365或TRPC6的干扰RNA，更优选的，所述TRPC6的干扰RNA的靶基因为SEQIDNO.1和/或SEQIDNO.4和/或SEQIDNO.7，进一步优选的，所述TRPC6的干扰RNA序列选自下列序列中任意一个或几个：SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9；Ca离子调节剂；CaMKII激动剂；CaMKII抑制剂，优选KN93；PARP-1激动剂；PARP-1抑制剂。

本发明的目的在于提供一种诊疗肾缺血再灌注损伤药物制剂，所述药物制剂包括调节下列任意一种或几种组分表达的调节剂：TRPC6、Ca离子、CaMKII、PARP-1；和/或下列任意一种或几种组分：TRPC6、Ca离子、CaMKII、PARP-1；和/或调控程序性坏死的调节剂。

进一步，所述调控程序性坏死的调节剂为necrostatin-1；所述调节剂包括TRPC6激动剂，优选OAG；TRPC6拮抗剂，优选SKF96365或TRPC6的干扰RNA；Ca离子调节剂；CaMKII激动剂；CaMKII抑制剂，优选KN93；PARP-1激动剂；PARP-1抑制剂。

进一步，所述调控程序性坏死的调节剂能够影响了RIP1-RIP3复合物的结合及信号传递。TRPC6激动剂可以下调RIP1表达，TRPC6拮抗剂可以上调RIP1的表达，是由于PARP-1竞争性抑制了sirtuin-2与NAD+的结合，导致sirtuin-2的酶活性不足，影响了RIP1-RIP3复合物的信号传递，从而抑制了necroptosis的发生。

附图说明

图1westernblot检测TRPC6在HK-2细胞上的表达

从左边起分别为：泳道1是转染组；泳道2是对照组(NControlSiRNA)；泳道3是转染si-h-TRPC6-001组；泳道4是转染si-h-TRPC6-002组；泳道5是si-h-TRPC6-003组；

图2westernblot检测TRPC6在HK-2细胞上的表达

图3各组细胞坏死率比较

正常与NControl组之间无明显差异；*与正常、NControl组比较，RNAI各组细胞坏死率均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)

图4各组细胞凋亡率比较

*正常/NControl/RNAI各组均随时间增加，凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；正常/NControl/RNAI各组比较凋亡率无明显差异

图5复氧2h与复氧2h组+necrostatin-1比较，necrostatin-1干预后细胞坏死率下降(*，P<0.05)；复氧6h与复氧6h组+necrostatin-1比较，necrostatin-1干预后细胞坏死率下降(*，P<0.05)

图6各组细胞坏死率比较：各组细胞使用OAG后，坏死率降低；使用SKF96365、KN93后坏死率升高，差异有统计学意义(*，P<0.05)；组间比较：*与正常组比较，NControl组各分组坏死率变化无明显差异(P>0.05)；与正常组、NControl组比较，RNAI各组细胞坏死率均明显升高，差异有统计学意义(*，P<0.05)

图7westernblot检测PARP-1、sirtuin-2、RIP1、AIF在HK-2细胞上的表达

图8westernblot检测干预后PARP-1、RIP1在HK-2细胞上的表达

图9westernblot检测I/R肾组织TRPC6、PARP-1、RIP1、sirtuin-2表达

图10WB检测OAG、SKF96365、KN-93干预I/R肾组织PARP-1、RIP1表达

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1基于基因芯片的肾脏缺血再灌注损伤分子机制的生物信息学分析研究

1.1研究材料

1.1.1实验动物

6周龄，体重在180-230g之间的SD、BN大鼠，均喂养于第三军医大学西南医院实验动物中心清洁级动物喂养室。所有的大鼠均由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。

动物室保持清洁，室内温度由空调控制在23℃到28℃之间，室内湿度控制在40％到70％之间，并维持室内12h昼夜循环。动物可以自由地摄取食物和饮水，每天观察动物情况并监测其体重。

1.2研究方法

1.2.1实验动物分组

我们在NCBIGEO数据库选择GSE9943，实验动物共有12个样本，样本分组情况如表1所示。两种大鼠(BN和SD)，每种大鼠都分成肾脏I/R实验组和对照(Control)组，每个组都有3个生物学重复。GSE9943的注释平台为GPL2996ABIRatGenomeSurveyMicroarray，该平台由26857个探针组成。

表1实验组的样本分布情况

Rat Strain	I/R	Control
			Brown Norway(BN)	3	3
Sprague Dawley(SD)	3	3

注：表格中数字代表样本生物学重复数(biologicalreplicates)

1.2.2建立大鼠缺血/再灌注损伤模型

实验大鼠术前常规称重，采用戊巴比妥钠溶液(3％，50mg/Kg)腹腔注射进行手术麻醉，根据大鼠术中情况决定是否追加麻醉药物剂量。大鼠缺血/再灌注损伤模型的建立具体方法如下:麻醉起效后，固定大鼠于操作台上。常规消毒铺巾，经腹正中切口，逐层暴露肾脏后，先切除大鼠左侧肾脏；然后继续分离右侧肾蒂，显露肾动脉，利用无损动脉夹夹闭肾动脉。此时注意观察肾脏颜色：若肾脏颜色由鲜红迅速变为暗红或者苍白色，则提示血流已被阻断。

恢复肾脏灌注：40min后松开动脉夹，再次观察肾脏颜色：可见肾脏颜色由暗红或苍白色逐渐变为鲜红，则说明肾脏血流灌注恢复成功。对照组麻醉后仅暴露肾蒂，不切肾，也不使用动脉夹夹闭肾动脉。手术完毕，腹腔补充无菌生理盐水以弥补术中体液消耗，再逐层缝合关闭腹腔并伤口清洁消毒。待大鼠麻醉清醒后将其置于常规环境饲养，自由摄取水和食物，并密切观察大鼠生命体征。24h后处死大鼠,留取肾组织标本供实验用。

1.2.3基因芯片检测

(1)将RNA反转录合成生物素标记的cRNA(cy3-cRNA为对照组样品，cy5-cRNA为实验组样品)。

(2)杂交：将标记的DNA溶于80ul杂交液中，于42℃条件下杂交过夜。杂交结束后，玻片经过洗涤、甩干后即可用于扫描。

(3)基因芯片扫描及图像处理

基因芯片扫描及图像处理工作由北京博奥生物集团有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心协助完成。

1.2.4芯片数据处理及差异表达基因筛选

我们下载了芯片的原始文件，最终得到了12925行x12列的矩阵文件。将样本分成两个比较组：BN大鼠的I/R与control比较；SD大鼠的I/R与control比较。然后利用R(v.3.0.1)语言中的线形回归模型软件包limma对不同组的芯片进行差异计算，并用贝叶斯方法进行多重检验校正。选取P-value<0.05及|logFC|>1.0作为显著性阈值，从而得到肾脏I/R组的差异表达情况。

1.3结果

1.3.1差异表达基因筛选的结果

通过对芯片数据的预处理，利用limma包计算疾病的差异表达基因，选择阀值|logFC|>1.0且Pvalue<0.05，最终我们得到两个比较组的差异表达基因，结果显示：BN组大鼠共计算得到92个差异表达基因，其中包含69个上调和23个下调基因；SD大鼠共得到了176个差异表达基因，其中包含92个上调和84个下调基因；两种大鼠差异表达基因的并集为245个，交集为23个。TRPC6是本次实验被筛选出的23个交集基因之一，TRPC6基因在SD、BN大鼠中疾病与正常的logFC分别等于1.53、1.66，均是表达上调的基因，提示它有可能是潜在的肾脏I/R调控者。

实施例2TRPC6在人肾小管上皮细胞体外缺血再灌注损伤中调控细胞程序性坏死的作用及其机制研究

2.1研究材料

2.1.1实验细胞

人肾小管上皮细胞系(HK-2)由中国科学院昆明细胞库保存。

2.2研究方法

2.2.1免疫荧光检测TRPC6在HK-2细胞上的表达

将HK-2细胞传代至激光共聚焦专用培养皿中，继续培养24h后弃去陈旧培养液，PBS冲洗后使用预冷的4％多聚甲醛4℃固定20min。然后PBS冲洗3次后加入1％Triton-X100透化10min，再使用PBS冲洗3次后用1％BSA封闭20min。再加入1:50稀释的兔抗人TRPC6多克隆抗体，4℃过夜。次日用PBS清洗3次后加入1:50稀释的FITC标记的二抗，室温避光孵育1h，再PBS清洗3次后在激光共聚焦扫描显微镜下进行观察并拍照。细胞核使用Hoschst33258染色。2.2.2利用lipofectamine2000reagent将SiRNA片段转染人肾小管上皮细胞HK-2以干扰TRPC6蛋白表达。

hTRPC6siRNA-140718132704由广州锐博生物科技公司合成，共3个片段供实验，以筛选出最佳方案：

si-h-TRPC6-001：靶序列：GGACCAGCATACATGTTTA(SEQIDNO.1)

正义链(5‘-3’)：5‘GGACCAGCAUACAUGUUUA3‘(SEQIDNO.2)

反义链(3‘-5’)：3‘CCUGGUCGUAUGUACAAAU5‘(SEQIDNO.3)

si-h-TRPC6-002：靶序列：GTTCAAGAATGACTACAAA(SEQIDNO.4)

正义链(5‘-3’)：5‘GUUCAAGAAUGACUACAAA3‘(SEQIDNO.5)

反义链(3‘-5’)：3‘CAAGUUCUUACUGAUGUUU5‘(SEQIDNO.6)

si-h-TRPC6-003：靶序列：GCTTCTAGCTATTAGTAAA(SEQIDNO.7)

正义链(5‘-3’)：5‘GCUUCUAGCUAUUAGUAAA3‘(SEQIDNO.8)

反义链(3‘-5’)：3‘CGAAGAUCGAUAAUCAUUU5‘(SEQIDNO.9)

(1)转染前细胞准备

1)配制10％FBS的DMEM/F12完全培养基，不加抗生素，备用；

2)取培养的细胞一瓶，镜下观察细胞已长至铺满瓶底约80％，生长状态良好，可用做实验；

3)弃去细胞培养瓶中的陈旧培养基，PBS清洗；

4)弃去PBS，加胰酶消化，显微镜下观察细胞消化情况；

5)镜下见细胞间隙增大，并且开始有细胞脱落时，立即加入完全培养基终止消化，将细胞吹打下来后移至离心管中；

6)500rpmX5min离心，弃上清，加10％FBS的DMEM/F12完全培养基重悬细胞；

7)计数细胞，每孔接种细胞约1.5X105个，补加培养基至2ml，置于细胞培养箱继续培养。

(2)转染

1)24h后，显微镜下观察HK-2细胞密度约50％，则可用于转染；

2)si-r-Uqcrc1(001、002、003)、NControlSiRna的稀释：冻干粉，将其瞬时离心，每管干扰片段均为5nmol。每管加灭菌三蒸水250μl，配制成20μM的储存液，分装后，－20℃保存备用；

3)转染

分为以下5组：转染分组：未转染组、NControlSiRna转染组、si-h-TRPC6-001转染组、si-h-TRPC6-002转染组、si-h-TRPC6-003转染组；

取2个EP管，每管加入DMEM/F12100μl。然后在其中一管中加入siRNA5μl，而另一管加入lipofectamine2000reagent4μl，混匀，室温孵育5min；然后将两管混匀，室温孵育20min；去掉培养基，加入DMEM/F12培养基2ml清洗。弃去培养基，再加入DMEM/F12培养基800μl，孵育20min。每个孔中加入200μlsiRNA和脂质体的混合溶液，置于细胞培养箱中继续培养。

4)更换培养基

转染6h后，弃去孔中的陈旧培养液，加入不含抗生素的10％FBS的DMEM/F12完全培养基2ml，置于细胞培养箱继续培养；倒置荧光显微镜下用蓝光激发，观察细胞所带的绿色荧光，以便筛选适宜的转染浓度，并可测定转染的效率。

(3)收集细胞做western-blot验证干扰的效率，以便筛选最优组用于后续实验各组细胞在转染后48h裂解，提取总蛋白，BCA法行蛋白定量。然后取等量的蛋白与上样缓冲液混合。蛋白质变性后置于SDS.PAGE电泳分离，采用湿转法转膜，5％脱脂奶粉封闭。

此时，加入兔抗人TRPC6多克隆抗体(1：300)和鼠抗人β-actin抗体(1：1000)，于4℃孵育过夜。TBST洗膜后，采用相应的二抗再室温孵育2h，显色液显色后成像并拍照。以β-actin作为内对照，利用凝胶成像分析系统测定各蛋白条带的灰度值。

2.2.4人肾小管上皮细胞HK-2的体外缺血再灌注模型的建立和实验分组。

按照文献的方法，将HK-2细胞传代至细胞培养皿后培养24h，镜下观察细胞生长状态。弃去陈旧培养基。新鲜PBS清洗3遍，加入PBS(补充了氯化钙1.5mM和氯化镁2.0mM)。随后在PBS上覆以矿物油(mineraloil，sigma)以便隔绝空气创造缺氧缺血环境，并继续在细胞孵箱中孵育6h。矿物油覆盖建立缺血再灌注模型损伤模型的优点包括同时剥夺营养/氧气，以及有利于代谢产物的积累对细胞产生刺激，而这是缺血再灌注损伤的最重要损伤因素。

细胞缺氧6h后，然后弃去矿物油和PBS，以新鲜的PBS清洗5次，再重新加入完全培养基，放入5％CO₂，37℃细胞培养箱培养模拟再灌注过程。

2.2.5AV/PI双染色法流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡/坏死的比率

将细胞分组，完成实验后按以下步骤进行AV/PI双染色法检测细胞坏死/凋亡比率：

1.吸出细胞培养基，转入准备好的清洁离心管内；PBS洗涤，加入适量胰酶(不含有EDTA)消化贴壁细胞，室温孵育。镜下观察细胞间隙增大，有贴壁细胞开始脱落时，加入完全培养基终止消化，以避免过度消化造成细胞损伤引起检测误差。

2.加入步骤1中收集的陈旧细胞培养基，1000rpmX5min离心后，弃上清。加入PBS重悬细胞并计数。(加入步骤1中的陈旧细胞培养基可以收集已经悬浮的发生凋亡或者坏死的细胞，避免误差)

3.取约10X5重悬的细胞，1000rpmX5min离心后，弃上清。再加入PBS洗涤离心弃上清后加入200ulAnnexinV-FITC结合液重悬细胞。

4.加入5ulAnnexinV-FITC，混匀，避光反应5min。

5.加入10ulPI，混匀，避光反应15min。

6.加一滴细胞悬液至载玻片上，轻轻盖上盖玻片，荧光显微镜下观察，可见凋亡细胞染成绿色，坏死细胞染成红色。

7.立即进行流式细胞仪检测。检测前需设定3个细胞组调窗保证实验准确性。即：AV/PI双阴、AV单阴、PI单阴3个组调整流式细胞仪光门位置。

8.流式细胞仪检测结果的判读：由于凋亡细胞对PI有抗染性，而坏死细胞无PI抗染性。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI染色发红色荧光，而细胞膜完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，凋亡早期细胞PI不会着染，而正常的活细胞也有与此相似的特性。所以，在双变量流式细胞仪的检测散点图上：左下象限显示的是活细胞；右上象限是坏死细胞；右下象限为凋亡细胞，而左上象限为机械损伤的细胞，应在实验流程中应按程序小心操作，避免产生。

2.2.6western-blot检测HK-2细胞TRPC6、RIP1、PARP-1、sirtuin-2的表达

1.细胞总蛋白提取：弃去陈旧的细胞培养液，加入Hanks液洗涤后弃去，用细胞刮子仔细收集贴壁细胞。将收集到的细胞转移至离心管内，配平后，1500rpmX10min离心。弃上清，用4℃预冷的PBS洗涤沉淀，1500rpmX10min。共洗三次，每次10min。弃上清，每管加入50ul细胞裂解液RIPA，吹散，尽快转移至1.5mlEP管内，-20℃裂解30min。超声波细胞裂解仪上裂解15S，4℃12000rpmX10min离心。将上清转移至0.5mlEP管中，提取总蛋白，BCA法行蛋白定量。然后取等量的蛋白与上样缓冲液混合，蛋白质变性。

2.配胶：清洗玻璃板，安装于夹中。配制10％分离胶，加入TEMED摇匀后立即灌胶。加双蒸水封胶，凝固后弃去上层水。配制4％浓缩胶，加入TEMED摇匀后立即灌胶，插入梳子，待胶凝固后拔出梳子。

3.加样、电泳：取适量样品加入样品孔中，电泳。

4.电转膜：浸泡膜，取胶，铺好胶、膜与滤纸，放入电转槽，加入电转液，冰水混合物中转膜。

5.封闭及杂交：取出膜，用封闭液缓慢摇洗，加相应的一抗室温孵育，封闭液摇洗后加入二抗室温轻摇1h，膜用封闭液浸洗。

6.发光、显影、定影：暗室中将A和B等体积混合后加在膜上反应，去除残液后用保鲜膜包好，放X-光片夹中，曝光显影、定影。

7.凝胶图像分析：以β-actin作为内对照，利用凝胶成像分析系统测定各蛋白条带的灰度值。蛋白的相对表达量取目标蛋白与β-actin的灰度值的比值作为相对表达量。

2.3结果

2.3.1免疫荧光检测TRPC6在HK-2细胞上的表达

采用免疫荧光方法检测，结果发现TRPC6表达在人肾小管上皮细胞HK-2上，镜下观察到绿色荧光。

2.3.2HK-2细胞体外缺血再灌注损伤模型的建立和形态学观察

建立HK-2细胞体外缺血再灌注损伤模型后，在复氧不同时间点荧光显微镜下观察HK-2细胞形态学变化，对照组是正常的HK-2细胞，呈典型的铺路石样生长，细胞形态饱满；缺氧6h完成时的HK-2细胞，可见部分细胞形态有所变化，可见有细胞变薄、皱缩，失去正常形态，并有少许死细胞出现；复氧2h时的HK-2细胞，镜下可见有散在漂起死细胞，相当部分细胞变薄、摊开，失去正常形态；复氧6h时的HK-2细胞，镜下可见较多细胞失去正常形态，可见有异常变薄增大的细胞，可见有较多死细胞漂浮。

2.3.3SiRNA干扰HK-2细胞TRPC6蛋白表达

1.各组转染细胞存活率在70％左右；在荧光显微镜下观察，转染率在90％以上。

2.westernblot筛选高干扰效率组siRNA:可见未转染组以及NControlSiRNA组比，3个转染组均可见TRPC6蛋白表达被抑制(见图1)，其中si-h-TRPC6-001转染组抑制TRPC6蛋白表达的效率相对最高，作为以后的实验选择组。

3.westernblot检测HK-2细胞在复氧前后TRPC6表达情况，分组如下(每组3次重复)：(1)3个对照组：即RNAI组、NControl组、正常HK-2组；(2)3个干预组，在建立体外缺血再灌注损伤模型后复氧6h取细胞检测，即：RNAI复氧6h组、NControl组复氧6h组、正常HK-2组复氧6h。

结果可见：RNAI干扰组TRPC6蛋白表达被明显抑制；NControl组和正常HK-2组比较，TRPC6表达无明显变化；在复氧6h后，RNAI干扰组TRPC6蛋白表达仍低，而NControl组和正常HK-2组的TRPC6表达明显升高(P<0.05)，相互之间无明显差异。

结果提示：RNAI组TRPC6表达被显著抑制，而NControl组和正常HK-2组的细胞表达TRPC6无明显差异，说明lipofectamine2000reagent转染系统未对HK-2细胞生长造成明显影响(见图2)。

2.3.4AV/PI双染色法利用流式细胞仪检测各时间点HK-2细胞的坏死/凋亡的比率

1.HK-2细胞建立体外缺血再灌注模型后，分别分为3个不同的细胞组验证体外缺血再灌注损伤模型的建立，分组如下(每组3个重复)：(1)正常培养的HK-2细胞，分别留取对照、复氧2h、复氧6h、复氧12h共4个组，收集细胞用流式细胞仪检测细胞的坏死和凋亡比率；(2)NControl组的HK-2细胞，分别留取对照、复氧2h、复氧6h、复氧12h共4个组，收集细胞用流式细胞仪检测细胞的坏死和凋亡比率；(3)RNAI组HK-2细胞，也分别留取对照、复氧2h、复氧6h、复氧12h共4个组，收集细胞用流式细胞仪检测细胞的坏死和凋亡比率(结果见图3和图4)。

2.结果分析：

(1)组内按时间进展比较：正常培养的HK-2细胞有少许的自然死亡；在复氧后，随着时间的延长，细胞坏死/凋亡比率均逐渐升高，而且右上象限的细胞数明显高于右下象限的细胞数，说明细胞坏死的比率要明显高于细胞凋亡的比率，提示我们HK-2细胞的体外缺血再灌注模型中的细胞死亡有大部分来自于细胞坏死，是否属于程序性坏死尚待进一步的验证；NControl组、RNAI组细胞的细胞死亡在复氧后也随时间进展明显升高，且以细胞坏死为主。

(2)组间比较：NControl组的HK-2细胞的坏死/凋亡比率与正常的HK-2细胞组相比，没有明显的差异(P>0.05)，说明利用lipofectamine2000reagent进行RNA干扰，没有对HK-2细胞本身的状态和对缺氧复氧刺激造成明显的影响；RNAI组HK-2细胞的坏死率明显升高，与正常HK-2组和NControlSiRnaHK-2细胞组均有统计学差异(P<0.05)；但是细胞凋亡的比率没有发生明显的变化(P>0.05)。提示：在TRPC6低表达的情况下，HK-2细胞缺血再灌注后细胞坏死比率明显增加，而对细胞凋亡比率影响不大，说明TRPC6的存在主要是影响了HK-2细胞坏死的路径，是否属于necroptosis尚待进一步验证。

2.3.5流式细胞仪检测necrostatin-1干预对HK-2细胞的坏死/凋亡的比率的影响

建立HK-2细胞体外缺血再灌注损伤模型，实验分组如下(每组3个重复)：(1)对照组；(2)复氧2h组；(3)复氧2h组+necrostatin-1；(4)复氧6h；(5)复氧6h组+necrostatin-1。necrostatin-1均在缺氧6h结束时随完全培养基加入，终浓度为30umol/L。

结果见图5所示：无论复氧2h还是复氧6h组，necrostatin-1可以减少HK-2细胞体外缺血再灌注损伤模型的细胞坏死率(P<0.05)，提示HK-2细胞体外缺血再灌注损伤模型中的细胞坏死至少有相当部分属于necroptosis，那么调控necroptosis就可以成为改善急性肾小管坏死的有效干预途径。

2.3.6流式细胞仪检测在OAG、SKF96365、KN-93等干预下，HK-2细胞体外缺血再灌注损伤中细胞坏死/凋亡的比率变化

1.HK-2细胞建立体外缺血再灌注模型后，分别分为3个不同的细胞组验证药物干预后细胞坏死/凋亡的比率变化，分组如下(每组3个重复)：(1)正常培养的HK-2细胞，分为HK-2复氧6h对照、HK-2复氧6h+OAG、HK-2复氧6h+SKF96365、HK-2复氧6h+KN93，收集细胞用流式细胞仪检测细胞的坏死/凋亡比率；(2)NControl组的HK-2细胞，分为NControl复氧6h对照、NControl复氧6h+OAG、NControl复氧6h+SKF96365、NControl复氧6h+KN93，收集细胞用流式细胞仪检测细胞的坏死/凋亡比率；(3)TRPC6RNAI组HK-2细胞，也为RNAI复氧6h对照、RNAI复氧6h+OAG、RNAI复氧6h+SKF96365、RNAI复氧6h+KN93收集细胞用流式细胞仪检测细胞的坏死/凋亡比率(见图6)。

以上各组干预药物的浓度为：OAG20umol/L，SKF9636510umol/L、KN-9310umol/L，药物均加入完全培养基中在复氧时开始孵育细胞。

2.结果分析：

(1)组内比较：正常培养的HK-2细胞在复氧6h后，采用OAG干预后，细胞坏死比率较对照组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；采用SKF96365、KN-93干预后，细胞坏死比率较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。各组凋亡之间的差异并不显著。另外两组的组内比较和正常培养的HK-2细胞组变化趋势相似。

(2)组间比较：采用相应的药物干预后，NControl组的HK-2细胞的坏死比率与正常的HK-2细胞组相比，没有明显的差异(P>0.05)，进一步说明转染系统没有对HK-2细胞正常状态产生影响；RNAI组HK-2细胞的坏死率明显升高，与正常HK-2组和NControl组比较均有统计学差异(P<0.05)；而细胞凋亡的比率变化没有显著差异。

2.3.7westernblot检测HK-2细胞在体外缺血再灌注损伤下细胞RIP1、PARP-1、sirtuin-2、AIF的表达变化情况

各种目标蛋白的检测细胞均分为6组：(1)RNAI组；(2)NControl组；(3)正常细胞对照组；(4)RNAI复氧6h组；(5)NControl复氧6h组；(6)正常细胞复氧6h组。(每组3个重复)

结果可见：PARP-1的表达在RNAI组，复氧6h后较正常对照组无明显上调，而正常以及NControl组PARP-1均明显上调，说明TRPC6的缺失导致PARP-1未能活化；

sirtuin-2的表达则未受RNAI抑制TRPC6表的的影响，各组在复氧6h后均表达上调；

RIP1的表达在RNAI组复氧6h表达明显上调，较正常以及Ncontrol组均有显著差异，说明TRPC6的表达缺失促使了RIP1的活化，也就促进了necroptosis的发生；

AIF的表达则在各组均未有明显变化，说明PARP-1这种程度的上调并未激活AIF介导的parthanatos。

结合细胞坏死率的检测结果，我们有理由推断：TRPC6激活改善肾脏I/R的是通过抑制肾小管上皮细胞necroptosis作用的。

2.3.8westernblot检测在OAG、SKF96365、KN-93等干预下HK-2细胞在体外缺血再灌注损伤下RIP1、PARP-1的表达变化情况

各组检测细胞均分为5组：(1)对照组；(2)HK-2复氧2h组；(3)HK-2+OAG复氧2h组；(4)HK-2+SKF96365复氧2h组；(5)HK-2+KN93复氧2h组(结果见图8)。

结果：OAG干预组的PARP-1表达升高，而SKA96365和KN-93干预组PARP-1表达下调；而RIP1的表达变化与此相反，OAG干预组RIP1表达下调，而SKA96365和KN-93干预组PARP-1表达升高。由此可见，PARP-1的表达是与RIP1表达呈相反的趋势，鉴于PARP-1与sirtuin-2的竞争性抑制作用，提示PARP-1在体外缺血再灌注损伤中的上调可能通过sirtuin-2抑制necroptosis。

实验对于TRPC6在肾I/R中的作用进行了初步探讨，发现：(1)TRPC6在HK-2细胞体外缺血再灌注损伤模型中，在复氧后表达明显升高，和RIP1、PARP-1、sirtuin-2的表达趋势一致。而TRPC6的主要功能是通过促进钙内流，激发下游的钙信号传导通路发挥作用。而PARP-1的活性、necroptosis的发生都需要钙离子的参与，所以两者之间的联系值得进行进一步的研究；(2)在HK-2细胞的缺血再灌注损伤模型中，同necroptosis特异性抑制剂necrostatin-1相似，TRPC6激动剂OAG可降低HK-2细胞坏死率，而TRPC6拮抗剂SKF96365可升高HK-2细胞坏死率，CaMKII抑制剂KN93也可以升高HK-2细胞坏死率；(3)为进一步探寻以上现象可能的机制，我们采用westernblot检测了分别在OAG、SKF96365、KN-93干预下，HK-2细胞的PARP-1和RIP1的变化情况。我们发现OAG上调PARP-1、下调RIP1表达，而SKF96365下调PARP-1、上调RIP1的表达；作为CaMKII的抑制剂KN-93下调PARP-1、上调RIP1的表达。这就说明了OAG改善HK-2细胞缺血再灌注损伤，而SKF96365、KN-93加重HK-2细胞缺血再灌注的作用是通过抑制或者促进necroptosis产生的。进一步，我们利用RNAI技术，下调了HK-2细胞的TRPC6表达，发现(1)细胞坏死率升高；(2)PARP-1在体外缺血再灌注损伤条件下的激活被抑制；(3)RIP1在体外缺血再灌注损伤条件下的激活效应被放大，这都说明了TRPC6激活可以通过下游的PARP-1的作用来抑制necroptosis的发生。结合以上研究进展和我们的实验结果提示：TRPC6的活性是缺血再灌注时细胞survival而免于发生necroptosis的关键因素，可能通过以下3种机制改善肾I/R：(1)在再灌注开始时，由于复氧使组织内的NAD+的水平得到补充，此时TRPC6激活促使钙内流，通过CaMKII钙信号途径上调PARP-1的活性；由于PARP-1竞争性抑制了sirtuin-2与NAD+的结合，导致sirtuin-2的酶活性不足，从而抑制了necroptosis的发生；(2)同时在复氧NAD+存在的条件下，适度的激活的PARP-1可以通过其DNA修复作用促进细胞存活；(3)再灌注后TRPC6对necroptosis的抑制，一方面减轻了necroptosis伴随的强烈炎症反应带来的损伤，另一方面由于细胞坏死减少也抑制了大量细胞DNA损伤对PARP-1的过度激活的恶性循环，避免AIF激活和炎症反应，进一步起到保护作用。

实施例3TRPC6调控程序性坏死对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的实验研究

3.1研究材料

3.1.1实验动物

SD大鼠通实施例1所述实验动物。

3.2研究方法

3.2.1实验动物分组

按照随机区组设计的原则分别分为：(1)空白对照组(Control)：未予任何处理；(2)假手术组(Sham)：实验中麻醉后仅分离肾动脉暴露肾蒂后不切肾不夹闭肾动脉后关腹；(3)缺血再灌注组：麻醉后切除大鼠左侧肾脏，分离大鼠右侧肾蒂，用无损动脉夹夹闭40min后恢复灌注；(4)缺血再灌注+OAG组：麻醉后即从鼠尾静脉用注射器注入OAG，5min后然后再进行缺血再灌注造模手术，剂量为2.0mg/kg体重；(5)缺血再灌注+necrostatin-1组：麻醉后即从鼠尾静脉用注射器注入necrostatin-1，5min后然后再进行缺血再灌注造模手术，剂量为1.65mg/kg体重；(6)缺血再灌注+SKF96365组：麻醉后即从鼠尾静脉用注射器注入SKF96365，5min后然后再进行缺血再灌注造模手术，剂量为1.5mg/kg体重；(7)缺血再灌注+KN-93组：麻醉后即从鼠尾静脉用注射器注入KN-93，5min后然后再进行缺血再灌注造模手术，剂量为1.5mg/kg体重。

3.2.2大鼠缺血/再灌注模型的建立

具体步骤通实施例1所述大鼠缺血/再灌注模型的建立。

3.2.3处死动物及肾组织标本以及血液标本的留取

术前用3％戊巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹正中切口快速游离右肾，注意操作中尽量不要损伤肾脏。切取肾脏后立即用冰盐水冲洗，然后迅速沿肾脏横轴切成薄片，一部分用锡箔纸包裹后置于液氮中保存，一部分置于10％福尔马林中固定。在取肾的同时，实验助手同时用采血针行左心室穿刺采血，血液标本静置后1500rpmX10min离心，取上清进行血肌酐检测。

3.2.4血液标本血肌酐水平检测

经大鼠左心室采血5mL，室温放置，1500rpmX10min离心，留取上层血清，使用OlympusAU2700全自动生化分析仪检测大鼠血清肌酐水平。

3.2.5肾组织病理HE染色

新鲜的肾脏组织经10％福尔马林固定24h后，常规用石蜡包埋，行HE染色观察肾脏组织病理改变，其具体步骤如下：

1.切取肾脏后用冰盐水冲洗，然后迅速沿肾脏横轴切成薄片，置于10％福尔马林中固定24h。

2.利用酒精作为脱水剂，由低浓度到高浓度逐渐脱去肾脏组织块中的水份，再将组织块置于二甲苯中透明。

3.将已经过透明的组织块置于溶化的液体石蜡中，再放入溶蜡箱中保温，待石蜡完全浸入组织块后再进行包埋处理。

4.将已经包埋好的石蜡块固定于切片机上，连续切片切成4-6um的薄片，然后再贴到载玻片上，置于45℃恒温箱中将其烘干。

5.HE染色以及封片的步骤：

(1)二甲苯(Ⅰ)处理15min

(2)二甲苯(Ⅱ)处理15min

(3)二甲苯：无水乙醇＝1:1处理2min

(4)100％乙醇(Ⅰ)处理5min

(5)100％乙醇(Ⅱ)处理5min

(6)80％乙醇处理5min

(7)蒸馏水处理5min

(8)苏木精液染色5min

(9)流水洗去多余的苏木精液约1-3s

(10)1％盐酸乙醇处理约1-3s

(11)清水稍洗约10-30s

(12)蒸馏水过洗约1-2s

(13)0.5％伊红液染色约1-3min

(14)蒸馏水稍洗约1-2s

(15)80％乙醇稍洗约1-2s

(16)95％乙醇(Ⅰ)处理约2-3s

(17)95％乙醇(Ⅱ)处理约3-5s

(18)无水乙醇处理约5-10min

(19)石炭酸二甲苯处理约5-10min

(20)二甲苯(Ⅰ)处理约2min

(21)二甲苯(Ⅱ)处理约2min

(22)二甲苯(Ⅲ)处理约2min

(23)中性树胶封固

将标本在光学显微镜下观察，并进行肾小管坏死半定量评分。每组切片均在40倍显微镜下观察，随机选定视野上、下、左、右、中各2个肾小球(共10个)以及周围区域，以400倍照片采集并进行分析。评分标准参照文献[62]的方法：每张切片在高倍镜下随机取24个视野，无损伤为0分，轻微损伤(0～5％)为1分，轻度损伤(5％～25％)为2分，中度损伤(25％～75％)为3分，重度损伤(75％～100％)为4分。

3.2.6肾组织免疫组织化学染色

肾脏组织标本经10％福尔马林固定24h，液体石蜡包埋后进行4um连续切片。按照说明书的步骤，采用超敏二步法免疫组化检测试剂盒进行RIP1、TRPC6、sirtuin-2、PARP-1的免疫组化染色。显色剂为DAB，阴性对照使用PBS代替一抗。具体步骤如下：

试剂1：PolymerHelper(即用型)

试剂2：poly-HRPanti-GoatIgG(即用型)

1、脱蜡、水化组织切片。

2、根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。

3、3％H2O2去离子水孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。

4、PBS冲洗，2min×3次。

5、加入一抗，4℃条件下孵育过夜，然后PBS冲洗2min，共3次。

6、加试剂1，37℃条件下孵育20min，然后PBS冲洗2min，共3次。

7、加试剂2，37℃条件下孵育20min，然后PBS冲洗2min，共3次。

8、显色：DAB溶液。

9、清水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

10、显微镜下观察肾脏病理损害情况，以及目标蛋白表达定位情况

3.2.7Western-Blot法检测肾脏组织中RIP1、TRPC6、sirtuin-2、PARP-1蛋白的表达

1.组织总蛋白提取：取50mg肾脏组织，加入裂解液1ml后，于冰上研磨匀浆。裂解30min后，移至1.5ml离心管中，4℃条件下12000rpmX5min离心。将上清转移至0.5mlEP管中。提取总蛋白，BCA法行蛋白定量。然后取等量的蛋白与上样缓冲液混合，蛋白质变性。

2.配胶：清洗玻璃板，安装于夹中。配制好10％分离胶，加入TEMED后摇匀后立即灌胶。加双蒸水封胶，凝固后弃去上层水，配制4％浓缩胶，加入TEMED后摇匀后立即灌胶，插入梳子，待胶凝固后拔出梳子。

3.加样、电泳：取样品加入样品孔中，电泳。

4.电转膜：浸泡膜，取胶，铺好胶、膜与滤纸，放入电转槽，加入电转液，冰水混合物中转膜。

5.封闭及杂交：取出膜，用封闭液缓慢摇洗，加相应的一抗室温孵育，封闭液摇洗后加入二抗室温轻摇1h，膜用封闭液浸洗。

6.发光、显影、定影：暗室中将A和B等体积混合后加在膜上反应，去除残液后用保鲜膜包好，放X-光片夹中，曝光显影、定影。

7.凝胶图像分析：以β-actin作为内对照，利用凝胶成像分析系统测定各蛋白条带的灰度值。蛋白的相对表达量取目标蛋白与β-actin的灰度值的比值作为相对表达量。

3.3结果

3.3.1大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型的血肌酐变化情况

对照组与假手术组血肌酐无明显变化；而与对照组以及假手术组比较，肾脏缺血再灌注后大鼠血肌酐(SCr)水平显著升高，具有统计学差异(P＜0.05)，并且在24h达峰值(P＜0.05)，再灌注后5d肾功能开始恢复，血肌酐明显下降，说明建模成功。

表2大鼠肾脏缺血再灌注模型血肌酐水平比较(n＝8，)

组别	血肌酐水平(μmol/L)
		对照组	28.12±3.56
假手术组	28.78±4.37
		I/R组24h	148.63±12.41ac
I/R组48h	82.37±11.13ab
		I/R组5d	45.23±8.56abc

a：P＜0.05，与对照组及假手术组比较；

b：P＜0.05，与I/R24h组比较；

c：P＜0.05，与I/R48h组比较

3.3.2大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型的肾脏病理学改变

HE染色镜下观察：对照组及假手术组的肾组织结构正常，肾小管上皮细胞排列清晰，无脱落。I/R组再灌注后24h可见肾小管上皮细胞明显肿胀，脱落、崩解，基底膜裸露、断裂，肾间质可见炎细胞浸润；48h后开始出现新生肾小管细胞；5d时，肾小管新生细胞增多明显，仅有少部分肾小管基底膜仍裸露。对肾小管损伤情况进行半定量评分显示：与对照组与假手术组大鼠肾小管损伤评分(0分)相比，I/R24h组肾小管损伤评分最高为，其余各组评分均较假手术组明显升高，且各组间差异明显，具有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3大鼠肾脏缺血再灌注模型肾小管损伤评分比较(n＝8，)

组别	肾小管损伤评分
		对照组	0
假手术组	0
		I/R组24h	4.02±0.41ac
I/R组48h	2.88±0.29ab
		I/R组5d	1.92±0.23abc

a：P＜0.05，与对照组及假手术组比较；

b：P＜0.05，与I/R24h组比较；

c：P＜0.05，与I/R48h组比较

3.3.3肾脏组织免疫组化检测TRPC6、RIP1、PARP-1、sirtuin-2的表达定位以及表达强度

免疫组化染色观察肾脏组织TRPC6表达：镜下观察可见对照组、假手术组TRPC6主要在肾小管上皮细胞表达，肾小球也有表达；再灌注后24、48h肾小管上皮细胞TRPC6的表达明显增多；第5天TRPC6的表达开始减少，但仍较对照组及假手术组高。PARP-1、RIP1、sirtuin-2的蛋白表达与TRPC6有类似的变化趋势。

3.3.4Westernblot检测肾脏组织TRPC6、PARP-1、RIP1、sirtuin-2蛋白表达

采用Westernblot检测大鼠肾组织TRPC6表达，结果见图9：与对照组以及假手术组比较，再灌注后24、48h肾脏组织TRPC6蛋白表达均明显升高，24h时为峰值，5d时表达有所下降，但仍较对照高。RIP1、PARP-1、sirtuin-2的蛋白表达TRPC6的表达有类似的趋势，其差别有统计学意义(P＜0.05)。

3.3.5OAG、SKF96365、necrostatin-1干预后缺血再灌注大鼠肾脏损伤情况

建立缺血再灌注大鼠模型，使用相应药物干预后检测，分组为：(1)I/R24h组；(2)Nec-124h组；(3)OAG24h组；(4)SKF9636524h组。(各组5个重复)结果显示：necrostatin-1干预后，necrostatin-1组血肌酐明显下降(P<0.05)；OAG干预后的大鼠血肌酐也明显下降，与缺血再灌注相比有统计学意义；而使用SKF96365干预的大鼠，血肌酐与缺血再灌注组相比明显升高(P<0.05)，表4。HE染色行急性肾小管坏死半定量评分结果也有相似的的结论(表5)。

表4OAG、SKF96365、necrostatin-1干预大鼠肾I/R模型血肌酐水平比较(n＝10，)

组别	血肌酐水平(μmol/L)
		I/R24h组	139.26±20.15bc
Nec-124h组	82.78±16.24a
		OAG24h组	78.35±14.41a
SKF9636524h组	182.47±23.46abc

a：P＜0.05，与I/R24h组比较；b：P＜0.05，与nec-124h组比较；c：P＜0.05，与OAG24h组比较

表5OAG、SKF96365、necrostatin-1干预大鼠肾I/R模型肾小管坏死评分比较(n＝10，)

组别	肾小管坏死评分
		I/R24h组	4.15±0.48bc
Nec-124h组	2.01±0.25a
		OAG24h组	2.12±0.31a
SKF9636524h组	5.93±0.62abc

a：P＜0.05，与I/R24h组比较；b：P＜0.05，与nec-124h组比较；c：P＜0.05，与OAG24h组比较

3.3.6OAG、SKF96365、KN-93干预后缺血再灌注大鼠组织PARP-1、RIP1表达变化情况

使用OAG干预后，缺血再灌注大鼠组织PARP-1表达升高；相反，使用SKF96365、KN-93干预后，缺血再灌注大鼠组织PARP-1表达下降。以上结果提示在缺血再灌注损伤过程中，TRPC6通道的激活，上调了PARP-1的表达。同时，我们发现，肾脏组织CaMKII的表达与PARP-1的表达有密切的相关性。从文献中知道，PARP-1的活性依赖于CaMKII的调控。所以我们推测，在缺血再灌注损伤时PARP-1的表达上调的信号是通过TRPC6-Ca2+-CaMKII传递的。

使用OAG干预后，缺血再灌注大鼠组织RIP1表达下降；相反，使用SKF96365、KN-93干预后，缺血再灌注大鼠组织RIP1表达升高。以上结果(见图10)提示OAG激活TRPC6对缺血再灌注大鼠的保护作用是通过调控了RIP1的表达，抑制了细胞程序性坏死来达到。

我们得出结论：TRPC6的保护作用应该是通过减少细胞坏死而不是减少细胞凋亡来实现的。为证实这一点，我们检测了分别用OAG和SKF96365干预后肾脏组织表达RIP1的影响，发现OAG干预可以减少RIP1的表达，而SKF96365干预则上调了RIP1的表达，这就进一步说明了TRPC6的保护作用是通过调控necroptosis来达到的。

在动物模型中，激活TRPC6可以上调PARP-1表达，阻断TRPC6，下调PARP-1的表达；同时，CaMKII的抑制剂KN-93也可以抑制PARP-1的表达，这和体外实验的结果一致，进一步证实了TRPC6→Ca离子→CaMKII→PARP-1这一条信号传导通路的存在。一方面，PARP-1激活可以修复细胞的DNA损伤，另一方面，PARP-1又是necroptosis关键调节酶sirtuin-2的竞争性抑制物。由于二者的功能均依赖于辅因子NAD+的水平，在再灌注后，氧供恢复，NAD+的水平回升，但此时PARP-1和sirtuin-2的水平都是升高的。PARP-1要发挥DNA修复作用需要NAD+参与，必要会直接影响sirtuin-2的活性，导致necroptosis通路激活受到影响，减少细胞坏死。同时，在NAD+参与下，适度的激活的PARP-1可以发挥其DNA修复作用促进细胞存活。这样的作用就能抑制了更大量细胞的DNA损伤对PARP-1的过度激活的恶性循环，减少了AIF激活并避免parthanatos的发生；同时necroptosis受到抑制，其伴随的强烈炎症反应带来的瀑布效应也得到抑制。综上所述，我们在缺血再灌注损伤大鼠模型中进一步验证了TRPC6改善肾脏缺血再灌注损伤作用的机制是通过调节PARP-1/NAD+，抑制necroptosis，修复细胞DNA损伤获得的。这一结果将为肾脏缺血再灌注损伤的防治提供了新的思路和靶点。

Claims (10)

1.一种诊疗肾缺血再灌注损伤药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括调节下列任意一种或几种组分表达的调节剂：TRPC6、CaMKII、PARP-1；和/或下列任意一种或几种组分：TRPC6、CaMKII、PARP-1；和/或调控程序性坏死的调节剂。

2.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于，所述调控程序性坏死的调节剂为necrostatin-1；所述调节剂包括TRPC6激动剂，优选OAG；TRPC6拮抗剂，优选SKF96365或TRPC6的干扰RNA；CaMKII激动剂；CaMKII抑制剂，优选KN93；PARP-1激动剂；PARP-1抑制剂。

3.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于，所述调控程序性坏死的调节剂能够影响了RIP1-RIP3复合物的结合及信号传递。

4.TRPC6基因和/或TRPC6蛋白在制备诊疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通过抑制程序性坏死和/或修复细胞DNA损伤诊疗肾缺血再灌注损伤。

6.根据权利要求4或5所的应用，其特征在于，所述TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通过调控PARP-1基因和/或PARP-1蛋白的表达诊疗肾缺血再灌注损伤。

7.根据权利要求4-6任意一项所述的应用，其特征在于，TRPC6基因和/或TRPC6蛋白通过作用信号通路TRPC6→Ca离子→CaMKII→PARP-1诊疗肾缺血再灌注损伤。

8.调节剂在制备诊疗肾缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述调节剂能够调控下列任意一种或几种组分的表达：TRPC6、CaMKII、PARP-1、程序性坏死调节酶；和/或调控程序性坏死调节酶的活性。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述调节剂能够调控下列任意一种或几种组分的高表达：TRPC6、CaMKII、PARP-1；和/或调控程序性坏死调节酶低表达或活性降低。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述调节剂包括TRPC6激动剂，优选OAG；TRPC6拮抗剂，优选SKF96365或TRPC6的干扰RNA；CaMKII激动剂；CaMKII抑制剂，优选KN93；PARP-1激动剂；PARP-1抑制剂。