CN115671148B

CN115671148B - 一种海木耳萃取物及其用途

Info

Publication number: CN115671148B
Application number: CN202111683971.7A
Authority: CN
Inventors: 温志宏; 张志益; 陈佩津
Original assignee: Sun Yat Sen University Taiwan
Current assignee: Sun Yat Sen University Taiwan
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN115671148A; JP2023020828A; TW202304491A; JP7391396B2; TWI780841B

Abstract

本发明提供一种组合物用在抗发炎及皮肤美白的用途，其中所述组合物包含海木耳萃取物。

Description

一种海木耳萃取物及其用途

技术领域

本发明是关于一种海木耳萃取物的新颖用途，尤其是关于所述海木耳萃取物用在制备抗发炎以及皮肤美白的组合物的用途。

背景技术

海木耳主要分布在印度洋及西太平洋区域。海木耳为海洋大型异养(heterotroph)藻类，因为微量营养素含量高，因此在日本又叫做长寿菜，在欧美称海木耳为海洋蔬菜之首。目前，海木耳的用途多以直接食用或食品添加物。虽然食用海木耳的历史悠久，但它的功效相关研究极少。

最近医学美容的蓬勃发展，化妆保养品市场因而急遽成长。吸引消费者购买化妆保养品的要素为新颖性、持续性及有效性。药妆品是医师与化工背景的化妆品科学家的中间桥梁，经由离体或活体实验的验证，使药妆品更具特定用途价值，或较传统化妆品具更好的效果。近几年来，药妆品(cosmeceuticals)一词大量出现于广告宣传中，界定在一般化妆品(cosmetics)与药品(pharmaceuticals)之间；相较于一般化妆品，药妆品含有的生物活性成分更具明确的作用机转及活性，提供类似药物的优势。

故皮肤保养品的产业应用性很高，尤其现代人对皮肤保养品的需求性高。因此，目前尚未有海木耳活性萃取物在皮肤上的相关应用，故海木耳仍有许多研发的空间。

发明内容

本发明是将海木耳进行干燥后，再对其用酒精进行萃取，以得到酒精萃取物；再将所述酒精萃取物浸泡在水中，使其悬浮后得水性萃取物；再利用乙酸乙酯对所述水性萃取物进行分配萃取，以形成乙酸乙酯层以及水性层，然后收取所述水性层；以及用正丁醇对所得到的所述水性层进行分配萃取，以形成正丁醇以及水性层，然后收取所述水性层，以获得海木耳萃取物EH。

在美白实验中，所述海木耳萃取物EH能降低细胞以及斑马鱼体内的黑色素的表现量。此结果显示所述海木耳萃取物EH能抑制黑色素的表现来达到美白的功效。

在抗发炎实验中，所述海木耳萃取物EH能抑制发炎因子环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)及诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)的表现。此结果显示所述海木耳萃取物EH能抑制发炎因子的表现来达到抗发炎的功效。

在异位性皮肤炎的实验中，所述海木耳萃取物EH能改善小鼠的异位性皮肤炎的症状，例如红斑、浮肿、脱皮及干燥等病征。同时，所述海木耳萃取物EH能降低因异位性皮肤炎而上升的IgE表现量。另外，由于异位性皮肤炎会使脾脏和淋巴结肿大，但再给予所述海木耳萃取物EH，能改善脾脏和淋巴结肿大的情况。此结果显示所述海木耳萃取物EH能治疗异位性皮肤炎。

本文中的用语“一”或“一种”是用以叙述本发明的元件及成分。此术语仅为了叙述方便及给予本发明的基本观念。此叙述应被理解为包括一种或至少一种，且除非明显地另有所指，表示单数时亦包括复数。在权利要求书中和“包含”一词一起使用时，所述用语“一”可意谓一个或超过一个。

本文在权利要求书中所使用的术语“或”意指“及/或”，除非有明确表示要仅仅意指另一个选择，或除非其他的选择互相排斥。

本发明提供一种海木耳萃取物的制备方法，其包含步骤如下：(a)用醇类溶剂对海木耳进行萃取，得海木耳醇类萃取物，其中所述醇类溶剂为甲醇或乙醇；(b)用有机溶液或超临界萃取对所述海木耳醇类萃取物进行分配萃取，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层，其中所述有机溶液为有机溶剂或是水与有机溶剂的混合液，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、甲醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿或四氯化碳；以及(c)用正丁醇对步骤(b)所得到的水性层进行分配萃取，以形成正丁醇层以及水性层，然后收取所述水性层，以得到所述海木耳萃取物。

在一具体实施例中，所述海木耳为双裂海木耳(Sarcodia ceylanica)。

在另一具体实施例中，所述醇类溶剂为乙醇。在一较佳具体实施例中，所述海木耳醇类萃取物为海木耳乙醇萃取物。

在一具体实施例中，所述有机溶剂为乙酸乙酯。根据本发明，由于所述海木耳萃取物是从水性层所收取而获得，故所述海木耳萃取物为海木耳水萃取物。

在一具体实施例中，所述方法包含步骤(a1)，在所述步骤(a)前，其中所述步骤(a1)包含将所述海木耳进行干燥。在一较佳具体实施例中，所述海木耳在温度20–70℃下进行干燥。在一更佳具体实施例中，所述海木耳在温度40–60℃下进行干燥。在另一具体实施例中，所述海木耳在50℃下进行干燥。

在一具体实施例中，所述海木耳的干燥时间为12–48小时。在一较佳具体实施例中，所述海木耳的干燥时间为16–32小时。在一较佳具体实施例中，所述海木耳的干燥时间为20–24小时。

根据本发明，所述海木耳经过干燥后，再用一定网目(mesh)孔径大小的筛网进行过滤，而过滤后再用乙醇进行萃取。在一具体实施例中，所述方法包含步骤(a2)，在所述步骤(a)前，其中所述步骤(a2)包含用 30–70网目孔径的筛网对所述海木耳进行过滤。在一较佳具体实施例中，所述方法包含步骤(a2)，在所述步骤 (a)前，其中所述步骤(a2)包含用40–60网目孔径的筛网对所述海木耳进行过滤。在一更佳具体实施例中，所述方法包含步骤(a2)，在所述步骤(a)前，其中所述步骤(a2)包含用50网目孔径的筛网对所述海木耳进行过滤。

在另一具体实施例中，所述海木耳在室温下用醇类溶剂进行萃取。在一较佳具体实施例中，在步骤(a)中，所述海木耳用醇类溶剂浸泡萃取三次，而合并三次的浸泡液经过滤及减压浓缩后，得所述海木耳醇类萃取物。

在一具体实施例中，在步骤(b)中，用所述有机溶液来对所述海木耳醇类萃取物进行分配萃取，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层。在一较佳具体实施例中，在步骤(b)中，用所述有机溶液来对所述海木耳醇类萃取物进行分配萃取，且分配萃取操作重复进行三次，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层。

在另一具体实施例中，所述步骤(b)进一步包含步骤(b1)，在所述有机溶液萃取前，其中所述步骤(b1) 包含将所述海木耳醇类萃取物浸泡在水中，得海木耳水性溶液。在一较佳具体实施例中，所述步骤(b1)包含将所述海木耳醇类萃取物浸泡在水，以使所述海木耳醇类萃取物悬浮在水中。当执行步骤(b1)后，在原先步骤(b)中，就会用所述有机溶剂来对步骤(b1)所得到的海木耳水性溶液进行分配萃取，而不需要用所述水与有机溶剂的混合液，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层。

在一具体实施例中，在步骤(c)中，用所述正丁醇对步骤(b)所得到的水性层进行分配萃取，且分配萃取操作重复进行三次，以形成所述正丁醇层以及所述水性层，然后收取所述水性层，以得到所述海木耳萃取物。

当执行步骤(b1)后，在原先步骤(b)中，就会用所述超临界萃取来对步骤(b1)所得到的海木耳水性溶液进行分配萃取。在一具体实施例中，在步骤(b)中，用所述超临界萃取来对步骤(b1)所得到的海木耳水性溶液进行分配萃取，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层。在另一具体实施例中，所述超临界萃取为CO₂超临界萃取。根据本发明，CO₂超临界萃取分离天然物营养成分的工艺，主要是利用超临界状态的二氧化碳流体在高压、低温条件下自天然物萃取出营养成分。在一具体实施例中，所述CO₂超临界萃取条件为CO₂： 99％乙醇溶液的流速比＝10mL/min：1mL/min；临界压力范围为150–400巴(bar)；以及临界温度范围为20–60℃。在一较佳具体实施例中，所述CO₂超临界萃取条件为CO₂：95％乙醇溶液的流速比＝10mL/min：1mL/min；临界压力为250巴(bar)；以及临界温度为40℃。由于经过CO₂超临界萃取后，同样会分成留在CO₂超临界萃取反应槽里的原料(水性层)跟萃取出来的物质(有机溶剂层)；因此，再对所述CO₂超临界萃取反应槽里的水性层用正丁醇进行萃取，以得到所述海木耳萃取物。

根据本发明，在步骤(c)中，用正丁醇萃取所分离出的所述正丁醇层以及所述水性层，其中所述水性层经收取后，先用C18玻璃管柱过滤以去除多余的盐类，再进行干燥，以获得所述海木耳萃取物。在一具体实施例中，所述方法包含一步骤(d)，在所述步骤(c)后，其中所述步骤(d)包含对步骤(c)所得到的水性层进行过滤，过滤后再进行干燥，以获得所述海木耳萃取物。在一较佳具体实施例中，所述方法包含步骤(d)，在所述步骤(c)后，其中所述步骤(d)包含对步骤(c)所得到的水性层用C18玻璃管柱进行过滤，过滤后再进行干燥，以获得所述海木耳萃取物。

在另一具体实施例中，所述海木耳萃取物的成分不包含多醣。

本发明另提供一种海木耳萃取物用在制备皮肤美白的组合物的用途，其中所述海木耳萃取物的制备方法包含步骤如下：(a)用醇类溶剂对海木耳进行萃取，得海木耳醇类萃取物，其中所述醇类溶剂为甲醇或乙醇。

在一具体实施例中，所述步骤(a)的所述海木耳经清洗、干燥及/或粉碎处理。

在另一具体实施例中，所述海木耳萃取物的制备方法进一步包含步骤(b)，其在步骤(a)之后，包含用有机溶液或超临界萃取对所述海木耳醇类萃取物进行分配萃取，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层，以得到海木耳水性层萃取物，其中所述有机溶液为有机溶剂或是水与有机溶剂的混合液，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、甲醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿或四氯化碳。

在一具体实施例中，所述海木耳萃取物的制备方法进一步包含步骤(b1)，在所述有机溶液萃取前，其中所述步骤(b1)包含将所述海木耳醇类萃取物浸泡在水中，得海木耳水性溶液。在一较佳具体实施例中，在步骤 (b)中，用所述有机溶剂来对步骤(b1)所得到的海木耳水性溶液进行分配萃取，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层。

在另一具体实施例中，所述海木耳萃取物的制备方法进一步包含步骤(c)，其在步骤(b)之后，包含用正丁醇对步骤(b)所得到的水性层进行分配萃取，以形成正丁醇层以及水性层，然后收取所述水性层，以得到所述海木耳萃取物。

在一具体实施例中，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

根据本发明，所述海木耳萃取物能抑制黑色素生成或减少黑色素，以达到皮肤美白的功效。在一具体实施例中，所述海木耳萃取物抑制黑色素生成或减少黑色素。在一较佳具体实施例中，所述海木耳萃取物用在制备抑制黑色素生成或减少黑色素的组合物。在一更佳具体实施例中，所述海木耳萃取物用在制备抑制黑色素生成或减少黑色素的医药品或化妆品。

在一具体实施例中，其中所述组合物包含化妆材料组合物、食品添加物或医药组合物。在一较佳具体实施例中，所述组合物包含化妆品组合物、食品或药物。因此，所述组合物可用在制备成化妆品、食品或药物。在另一具体实施例中，所述海木耳萃取物用在制备皮肤美白的医药品或化妆品。

在一示例性实施例中，所述组合物可以是化妆品组合物。除了所述海木耳萃取物之外，所述化妆品组合物可包含功能性添加物和化妆品组合物中常包含的成分。功能添加物可包括选自水溶性维生素、油溶性维生素、多胜肽(polypeptide)、多醣体(polysaccharide)、神经鞘脂质(sphingolipid)和海藻萃取物的成分。除此之外，还可含有油、脂肪、润湿剂、润滑剂(emollient)、表面活性剂、有机或无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物萃取物、酸碱值控制剂(pH control agent)、酒精、着色剂、香料、血液循环促进剂、清凉剂、止汗剂或纯水等。

化妆品组合物的制剂没有特别限制，可根据目的适当选择。例如，可以制备成选自由以下一种或多种制剂组成的群组：洗面乳(skin lotion)，皮肤软化剂(softener)，皮肤调色剂(toner)，收敛剂(astringent)，化妆水，乳液(milk lotion)，保湿乳液(moisturizing lotion)，滋养乳液(nourishing lotion)，按摩霜(massage cream)，滋养霜(nourishing cream)，保湿霜(moisturizing cream)，护手霜(hand cream)，粉底(foundation)，精华液 (essence)，滋养精华(nourishing essence)，包装(pack)，肥皂，清洁泡沫(cleansing foam)，清洁乳液(cleansing lotion)，清洁霜(cleansing cream)，身体乳液(body lotion)和沐浴乳(body cleanser)，但不限在此。

本发明进一步提供一种抑制黑色素生成或减少黑色素来美白皮肤的方法，其包含对个体的皮肤施予有效剂量的组合物，其中所述组合物包含海木耳萃取物，其中所述海木耳萃取物的制备方法包含步骤如下：(a)用醇类溶剂对海木耳进行萃取，得海木耳醇类萃取物，其中所述醇类溶剂为甲醇或乙醇。

在一具体实施例中，所述海木耳萃取物的制备方法进一步包含步骤(b1)，在所述有机溶液萃取前，其中所述步骤(b1)包含将所述海木耳醇类萃取物浸泡在水中，得海木耳水性溶液。在较佳具体实施例中，在步骤(b) 中，用所述有机溶剂来对步骤(b1)所得到的海木耳水性溶液进行分配萃取，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层。

在另一具体实施例中，所述海木耳萃取物的制备方法进一步包含步骤(c)，其在步骤(b)之后，包含用正丁醇对步骤(c)所得到的水性层进行分配萃取，以形成正丁醇层以及水性层，然后收取所述水性层，以得到所述海木耳萃取物。

在一具体实施例中，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

在另一具体实施例中，所述个体为动物，较佳为哺乳类，更佳为人类。

根据本发明，所述组合物被施予在所述个体的皮肤上，用以抑制或减少所述皮肤部位的黑色素，以美白所述处皮肤。在一具体实施例中，所述组合物被制备为乳液、化妆水、精华液、防晒乳、隔离霜或面膜的形式。

本文中“有效剂量”一词为治疗剂量可在特定条件下可预防、降低、阻止或逆转个体的症状的发展，或部分、完全舒缓所述个体开始接受治疗时在特别情况下已存在的症状。本领域中的熟习技艺人士亦可轻易地测定在施予所述海木耳萃取物至个体时适当的剂量用法。例如，所述海木耳萃取物可施予至所述个体一次或两次。当一剂量用法包含多次施予时，可了解到施予至所述个体的所述海木耳萃取物的有效剂量可包含全部剂量用法期间施予的产物总量。

在皮肤美白方面，在具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为5μg/ml至500μg/ml。在一较佳具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为20μg/ml至200μg/ml。在一更佳具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为50μg/ml至100μg/ml。

本发明另提供一种组合物用在制备抗发炎的药物的用途，其中所述组合物包含海木耳萃取物，其中所述海木耳萃取物的制备方法包含步骤如下：(a)用醇类溶剂对海木耳进行萃取，得海木耳醇类萃取物，其中所述醇类溶剂为甲醇或乙醇。

如本文所使用，术语“抗发炎”包含但不限于治疗或处理发炎的病状。

在一具体实施例中，所述抗发炎包含抑制发炎因子。在一较佳具体实施例中，所述发炎因子包含环氧化酶- 2(COX-2)及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)。在一更佳具体实施例中，所述海木耳萃取物抑制环氧化酶-2(COX- 2)及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)所引起的发炎。

因此，所述海木耳萃取物能抑制发炎，进而可应用在治疗过敏性皮肤炎。在具体实施例中，所述海木耳萃取物通过抗发炎以治疗过敏性皮肤炎。在一较佳具体实施例中，所述药物通过抗发炎以治疗过敏性皮肤炎。

如本文所使用的，术语“治疗”是指缓解症状或并发症；延缓疾病、病症或病情的进展；减轻或缓解症状和并发症；及/或治愈或消除疾病，病症或病情。

如本文所使用，术语“过敏性皮肤炎”是指以过敏反应为要因的皮肤疾病的总称，慢性的发痒及脸、颈、肘及/或膝的发疹为特征。就过敏性皮肤炎而言，可列举例如，接触性皮肤炎、异位性皮肤炎等。“接触性皮肤炎”是指由于外来性的抗原与皮肤接触所致的发病的湿疹性的炎症性疾病，可列举例如，过敏性接触皮肤炎、光接触皮肤炎、全身性接触皮肤炎和接触荨麻疹。又，就抗原而言，可列举例如，金属过敏原(钴、镍等)、植物过敏原(漆树、樱草等)和食物过敏原(芒果、银杏等)。“异位性皮肤炎(atopic dermatitis，AD)”是指许多患者具有异位性倾向的皮肤疾病。重复地恶化、缓解的左右对称的全身性湿疹为特征，可列举例如，弥漫性神经皮肤炎、异位性湿疹、异位性神经皮肤炎、贝尼耶痒疹(Besnierprurigo)、急性婴儿湿疹、屈曲部湿疹、四肢儿童湿疹、儿童异位性湿疹、儿童干燥型湿疹、儿童湿疹、成人异位性皮肤炎、内因性湿疹、儿童皮肤炎和慢性儿童湿疹。

在一具体实施例中，所述过敏性皮肤炎包含接触性皮肤炎或异位性皮肤炎。在较佳具体实施例中，所述过敏性皮肤炎包含异位性皮肤炎。在更佳具体实施例中，所述异位性皮肤炎包含弥漫性神经皮肤炎、异位性湿疹、异位性神经皮肤炎、贝尼耶痒疹、急性婴儿湿疹、屈曲部湿疹、四肢儿童湿疹、儿童异位性湿疹、儿童干燥型湿疹、儿童湿疹、成人异位性皮肤炎、内因性湿疹、儿童皮肤炎或慢性儿童湿疹。

在另一具体实施例中，所述药物抑制异位性皮肤炎的病征，其包含红斑、浮肿、脱皮或皮肤干燥。

在一具体实施例中，所述药物降低因所述异位性皮肤炎所造成IgE表现量上升的情况。

在另一具体实施例中，所述药物改善因所述异位性皮肤炎所造成脾脏或淋巴结肿大的情况。

在一具体实施例中，所述药物进一步包含医药上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)。如本文所使用，术语“医药上可接受的载体”为通过特定组合施用及特定方法施用组合物所决定。如本文所用“载体”一词包含但不局限任何及所有溶剂、分散介质、载具、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂等渗透和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液或胶体等。用在药物活性物质的这些介质和试剂在本领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，其用在治疗的组合就需要被考虑。补充的活性成分也可掺入组合物中。术语“医药上可接受的”是指分子实体和组合物施用在受试者时不产生过敏或类似的不良反应。以蛋白质作为活性物质的水组合物制备在本领域中是习知的。通常，此组合物被制备为液体溶液、锭剂、胶囊或悬浮液注射剂；亦可制备为可用在注射剂的可溶解或悬浮液的固体形式。在另一具体实施例中，所述医药上可接受的载体包含皮肤学上可容许的介质。“皮肤学上可容许的介质”是指在生物学上适切的物质，如盐类、酯类及/或酰胺类的成份。也就是说这物质，其与所选择的有效成份一起用时，在个体施予时不会引起不期望的生物学作用。另外，与含其的药剂组成份中的任何成份都不会发生有害的交互作用的物质。同样地，文中的“皮肤学上可容许的盐”，或“皮肤学上可容许的酯”为在生物学上适切的盐或酯。

根据本发明，所述组合物(包含所述海木耳萃取物)及医药上可接受的载体的配制可能经由无菌的水溶液或分散体、水悬浮液、油乳化液、油包乳化液中的水、特定点的乳化液、长停留乳化液、黏性乳化液、微乳液、纳米乳液、微脂粒、微粒、微球、纳米球、纳米颗粒、微汞及数种可持续释放的天然或合成聚合物。医药上可接受的载体及所述海木耳萃取物也可配置成气雾剂、片剂、丸剂、胶囊、无菌粉末、栓剂、洗剂、霜剂、软膏剂、糊剂、凝胶、水凝胶，或其他可用在组合物输送的制剂。

另外，本发明所称的组合物包含施予到局部和区域作用的组合物。本文所用的术语“局部”涉及使用本文所述的组合物掺入合适的药用载体中且施涂在皮肤的部位，例如过敏性皮肤炎的患部，以实施局部作用。因此，此类局部用所述组合物包含其中通过与待处理皮肤表面直接接触来自外部施涂的化合物的那些药物形式。用在此目的的常规药物形式包含软膏剂、抹剂、乳膏、洗发剂、乳液、糊剂、凝胶、喷剂、气溶胶等，并且可以根据待治疗的身体部位以贴片或浸渍敷料形式施用。术语“软膏剂”包含具有油性基质、水溶性基质和乳液型基质的制剂(包含乳膏)，所述基质如凡士林、羊毛脂、聚乙二醇类以及这些组合的混合物。

本发明的药物可进一步包含医药上可接受的载体，在本发明相关领域下习知的治疗方式中可通过许多不同途径施予到个体。在一些实施例中，所述组合物(包含所述海木耳萃取物)及医药上可接受的载体会经由外用、静脉、肌肉、皮下、局部、口服或吸入施予。所述药物将会通过消化及循环系统被传递到目标处。

在抗发炎方面，在一具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为1毫克/公斤体重至200毫克/公斤体重。在一较佳具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为5毫克/公斤体重至100毫克/公斤体重。在一更佳具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为10毫克/公斤体重至40毫克/公斤体重。

在治疗过敏性皮肤炎方面，在一具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为0.05至20mg/ml。在一较佳具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为0.1至10mg/ml。在一更佳具体实施例中，所述海木耳萃取物的有效剂量范围为0.5至2mg/ml。

附图说明

图1为海木耳的萃取流程图。

图2为海木耳萃取物EH对细胞内黑色素含量的影响。

图3为海木耳萃取物EH对斑马鱼鱼体色素的影响。斑马鱼胚胎在受精后9小时给予海木耳萃取物EH，浸泡48小时后，取出仔鱼对鱼体进行拍照分析，并以5.4mg/mL熊果素及30.4μg/mL PTU作为正控制组。利用影像定量软件圈选鱼体腹部，分析各组斑马鱼的黑色素生成表现量，结果显示EH(100μg/mL)能抑制斑马鱼黑色素的生成，具有美白活性。数据呈现平均值±平均值标准误差(mean±SEM)。与控制组相较达到显著性差异者 (P<0.05)，以*表示。

图4为海木耳萃取物EH对酯多糖(LPS)诱发的iNOS的影响。Raw264.7细胞以10ng/mL酯多糖诱发发炎反应，并加入20、50、及100μg/mL的海木耳萃取物EH培养16小时，并以10μM迪皮质醇(Dex)作为正控制组。以西方墨点法分析发炎因子iNOS的表现量，结果显示EH能显著抑制iNOS。数据呈现平均值±平均值标准误差(mean±SEM)。与LPS组相较达到显著性差异者(P<0.05)，以*表示。

图5为海木耳萃取物EH对酯多糖(LPS)诱发的COX-2的影响。Raw264.7细胞以10ng/mL酯多糖诱发发炎反应，并加入20、50、及100μg/mL的海木耳萃取物EH培养16小时，并以10μM迪皮质醇(Dex)作为正控制组。以西方墨点法分析发炎因子COX-2的表现量，结果显示EH能显著抑制COX-2。数据呈现平均值±平均值标准误差(mean±SEM)。与LPS组相较达到显著性差异者(P<0.05)，以*表示。

图6A-6B为海木耳萃取物EH对患有异位性皮肤炎的小鼠的皮肤外观的影响。图6A显示利用DNCB诱发异位性皮肤炎，待小鼠皮肤显现异位性皮肤炎症状后，开始每日涂抹药物；分别在治疗的第1、7、12天拍摄DNCB 诱发异位性皮肤炎小鼠的皮肤外观，比例尺＝1cm。结果显示相较于AD组，EHL组(低剂量组)及EHH(高剂量组)组均具有减缓异位性皮肤炎症状的功效，表皮的浮肿、发红、干燥及结痂等现象均获得纾解。图6B显示在治疗第12天的海木耳萃取物EH舒缓异位性皮肤炎症状的临床皮肤炎评分。以临床皮肤炎评分评估EH舒缓异位性皮肤炎症状。利用四个皮肤表面症状来评估皮肤炎的严重性：红斑/出血、浮肿、脱皮/糜烂、干燥。依据每种症状的严重程度个别给予0-3分，分数越多越严重。皮肤炎总分为上述4种分数的总和，最高分数为 12。分数越高及代表皮肤炎的严重程度越严重。数据呈现平均值±平均值标准误差(mean±SEM)。与AD组相较达到显著性差异者(P＜0.05)，以*表示；与ADV组相较达到显著性差异者，以#表示。

图7为海木耳萃取物EH对血清中IgE的影响。动物牺牲前采集血液，检测血清中IgE。DNCB诱发异位性皮肤炎造成IgE上升，涂抹海木耳萃取物EH后，IgE均下降。数据呈现平均值±平均值标准误差(mean±SEM)。与 AD组相较达到显著性差异者(P<0.05)，以*表示；与ADV组相较达到显著性差异者，以#表示。

图8为海木耳萃取物EH对因DNCB诱发而肿大的脾脏重量的影响。动物牺牲时采集脾脏组织，拍照并秤重。DNCB诱发异位性皮肤炎造成脾脏组织肿大，涂抹海木耳萃取物EH后，脾脏重量均下降。比例尺＝1cm。数据呈现平均值±平均值标准误差(mean±SEM)。与AD组相较达到显著性差异者(P<0.05)，以*表示；与ADV组相较达到显著性差异者，以#表示。

图9为海木耳萃取物EH对因DNCB诱发而肿大的淋巴结重量的影响。动物牺牲时采集淋巴结组织，拍照并秤重。DNCB诱发异位性皮肤炎造成淋巴结组织肿大，涂抹海木耳萃取物EH后，淋巴结重量均下降。比例尺＝0.5 cm。数据呈现平均值±平均值标准误差(mean±SEM)。与AD组相较达到显著性差异者(P<0.05)，以*表示；与 ADV组相较达到显著性差异者，以#表示。

具体实施方式

养殖型海木耳的萃取

本发明使用的是人工养殖的双裂海木耳(Sarcodia ceylanica)。

将海木耳在50℃的条件下烘干24小时，获得干燥海木耳。将10.8kg干燥海木耳粉碎，经50网目(mesh) 筛网过滤，在室温下进行95％酒精(EtOH)浸泡萃取三次，合并三次的浸泡液经过滤及减压浓缩后，可获得370.5 g海木耳酒精粗萃物。将上述海木耳粗萃物加入1L的水，使呈悬浮状；再加入1L乙酸乙酯(EtOAc)进行分配萃取，重复上述分配萃取三次，以形成乙酸乙酯层以及水性层，移除上述乙酸乙酯层，然后收取所述水性层；用1L正丁醇(n-BuOH)对所述水性层进行分配萃取，重复上述分配萃取三次，以形成正丁醇层以及水性层，移除正丁醇层，从分出来的水性层以C18玻璃管柱过滤以去除多余的盐类，再进行干燥以获得萃取物EH(150g)。整个海木耳的萃取流程如图1所示。

另外，上述萃取步骤中，所述酒精溶液可用甲醇溶液进行替换。同时，用乙酸乙酯进行萃取的步骤可改用其他有机溶剂进行替换，例如使用乙酸丙酯、乙酸丁酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、甲醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿或四氯化碳溶剂进行分配萃取或超临界萃取(如CO₂超临界萃取)，之后再用正丁醇进行萃取都可以得到与EH 同成分的萃取物。

另外，水可与乙酸乙酯或其他有机溶剂混合成有机溶液，来直接对所述海木耳酒精粗萃物进行萃取，故无需将水和有机溶剂分开成两个步骤分别进行萃取。此外，也可将所述海木耳酒精粗萃物直接用乙酸乙酯或其他有机溶剂进行萃取，无须先浸泡在水此一步骤。上述步骤的变动最终都可以得到与EH相同成分的萃取物。

上述CO₂超临界萃取条件为CO₂：95％乙醇溶液的流速比＝10mL/min：1mL/min；临界压力为250巴(bar)；以及临界温度为40℃。由于经过CO₂超临界萃取后，同样会分成留在CO₂超临界萃取反应槽里的原料(水性层) 跟萃取出来的物质；因此，再对所述CO₂超临界萃取反应槽里的原料(水性层)用正丁醇进行萃取，以得到所述海木耳萃取物EH。

同时，本发明使用酚－硫酸法测量EH的多醣含量，结果显示EH不含多醣成分。因此，先以酒精浸泡海木耳的萃取方法，多醣成份不会溶出，故海木耳酒精粗萃物就无多醣成分。

实验方法

(1)评估EH的美白功效

(a)离体细胞测试

B16-F10细胞以每孔10⁴个细胞的密度培养在24孔培养盘的孔洞中，放置在细胞培养箱，24小时后，将原有的细胞培养液移除，并加入含有海木耳萃取液的细胞培养液，再放入培养箱培养48小时。利用胰蛋白酶的作用，收集细胞，并以磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗细胞，再加入100μl 1N NaOH水溶液在90℃下反应一小时。利用酵素免疫分析仪侦测波长405nm的吸光值，再进行数据分析。以控制组的数据作为100％，比较实验组之间吸光值的强弱，来显示海木耳萃取液EH的美白效果，并以用在美白的熊果素(Arbutin)及N-苯基硫脲 (N-phenylthiourea，PTU)作为正控制组。α-黑色素细胞刺激素(α-Melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)则用以促进细胞中黑色素的生成。

(b)活体斑马鱼美白活性分析

实验使用鱼龄四个月以上的斑马鱼(AB strain Danio rerio)为实验种鱼，飼养在具有过滤器以及循环系统的压克力水缸中，水温控制在28.5℃。光暗周期分别控制为14与10小时。

取斑马鱼受精后9小时的胚胎，注入96孔盘中，每孔内有3个胚胎及100μL的汉克缓冲液(Hank’s buffer) (0.04mM NaHCO₃、1.3mM CaCl₂、2mM MgSO₄)。控制组为加入100μL1％二甲基亚砜(DMSO)；正控制组与实验组分别加入100μL的5.4mg/mL的熊果素(Arbutin,Sigma-Aldrich Co.,MO,USA；Cat.No.#A4256)、30.4μg/mL N-苯基硫脲(N-phenylthiourea,PTU；Sigma-Aldrich Co.,MO,USA；Cat.No.#P7629)及浓度50、100及200μg/mL 的海木耳萃取物EH(均溶解在1％DMSO)，置入控温光照培养箱(光/暗周期：14/10小时，28.5℃)，培养48 小时。药物处理后48小时(即受精后57小时)，幼鱼以麻醉剂三卡因(Tricaine,168ppm,MS-222)麻醉后，放置在凹玻片的凹槽中，以2％甲基纤维素(Methylcellulose,Sigma-Aldrich Co.,MO,USA；Cat.No.#M0512)固定鱼体，利用实体显微镜(Z16APO,Leica,Heerbrugg,Switzerland)观察，搭配影像撷取系统及软件(idea SPOT&SPOTsoftware VERSION 4.6,Diagnostic instruments Inc.,USA)，取得鱼体影像。鱼体影像利用影像处理软件(Image J； National Institute of Health,MD,USA)，分别圈选鱼体的腹部面积，定量分析各组斑马鱼的黑色素值。以控制组的黑色素值作为100％，比较实验组的黑色素值，借以评估海木耳萃取物EH的美白效果。

(2)评估EH的抗发炎活性

离体细胞测试

5x 10⁵个Raw264.7细胞植入在6公分培养皿，待贴附后，先给予酯多糖(LPS)(0.01μg/mL；Sigma-Aldrich Co.,MO,USA；Cat.No.#L2654)。10分钟后，再加入不同浓度的EH，并以10μM迪皮质醇(Dexamethasone，Dex)(Sigma-Aldrich Co.,MO,USA；Cat.No.#D4902)作为正控制组，共同培养16小时。以西方墨点法(Western blot) 评估EH的抗发炎活性，分析促发炎相关蛋白质环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)及诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的相对表现量。以单独加入酯多糖(LPS)组别为100％，最后以β-肌动蛋白(β-actin)作为内控制组。

(3)评估EH对异位性皮肤炎的疗效

本发明使用的实验动物为BALB/c品系小鼠。将小鼠以2.5％异氟醚(isoflurane)麻醉，使用剃毛刀及除毛膏将小鼠背部的毛剃除，以直径1公分的硅胶圈做记号(面积大小为78.5mm2)，两天一次在此范围内滴入26μL 的2％用2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitirochlorobenzene，DNCB)(Sigma-Aldrich Co.,MO,USA；Cat.No.#138630)，总共8次，以诱发皮肤病变产生。

在DNCB诱发第7天后，每天涂抹100μL媒液(Vehicle)、海木耳萃取物EH或治疗异位性皮肤炎的药物克立硼罗(crisaborole)。实验动物分组如下(每组3只)：(1)控制组：未诱发；(2)AD组：只给予2％DNCB； (3)ADV组：给予2％DNCB和媒液(Vehicle)；(4)EHL组：DNCB诱发后，给予50μg EH/100μL 1％甲基纤维； (5)EHH组：DNCB诱发后，给予200μg EH/100μL1％甲基纤维；以及(6)Cri组：DNCB诱发后，给予25μg 克立硼罗/100μL 1％丙酮醇(acetone-EtOH)。涂抹DNCB后5分钟，待DNCB干燥后，再进行抹药。诱发或抹药前，以数位相机拍照纪录皮肤病征的变化。

在第18天牺牲动物，采血并收集其背部皮肤、脾脏及淋巴结组织。观察脾脏及胯下淋巴结(Subiliac lymph node)大小，并秤重比较。利用四个皮肤表面症状来评估临床皮肤炎的严重性：红斑/出血(erythema/ hemorrhage)、浮肿(edema)、脱皮/糜烂(excoriation/erosion)、干燥(dryness)。依据每种症状的严重程度个别给予0–3分：0分为无症状；1分为轻度；2分为中度；3分为重度。皮肤炎总分为上述4种分数的总和，最高分数为12。分数越高即代表皮肤炎的严重程度越严重。

牺牲前，以心脏采血的方式收集小鼠血液至采血管(BD vacutainer-SST,NJ,USA)。而后血液以3000rpm离心 10分钟，以获得血清，并将血清保存在-80℃冰箱直至进一步使用。依照制造商的说明书检测血清中的IgE浓度 (IgE-ELISA kit,Thermo FisherScientific Inc.,Vienna,Austria)。

若发生发炎或免疫相关的疾病，淋巴结及脾脏会肿大(swell)，因此小鼠牺牲时，收取这两个器官拍照，并秤量其重量。

统计分析

所有实验数据以平均值±平均值标准误差(mean±SEM)方式呈现。多组间数据比较，则利用单因子变异数分析(one-way analysis of variance，ANOVA)进行数据统计分析，并根据邓肯氏方式(Duncan’s Method)进行多重组间差异性比较。当P值小于0.05时，表示组间有显著性差异。

结果

(1)EH的美白功效

B16F10细胞以100mM的α-MSH诱发黑色素生成，并给予10μg/ml的EH溶液或100μM的PTU培养48小时，再收取细胞，以1N NaOH溶解黑色素，最后读取波长405nm的吸光值，黑色素越多，吸光值越高。结果如图2所示，控制组为100±5.33％及正控制组的PTU为37.41±3.94％，10μg/mL的EH能显著抑制细胞黑色素生成(72.64±2.79)。

藉由环境给药的方式评估EH的美白活性，斑马鱼胚胎在给予药物48小时后，拍摄仔鱼的鱼体色素，并量化分析其色素斑点。结果如图3所示，控制组为100±6.06％，正控制组的熊果素及PTU均显著抑制鱼体的色素 (9.86±1.40％，3.08±0.62％)，50、100及200μg/mL的EH能显著抑制鱼体色素(78.61±7.68％，70.12±8.62％， 63.64±8.50％)。

(2)EH的抗发炎功效

检测EH是否具有抑制发炎反应的效果，Raw264.7细胞加入LPS诱发发炎反应，并加入浓度20、50及 100μg/mL的EH共同培养16小时，随后以西方墨点法检验发炎性蛋白质iNOS及COX-2的表现量。结果如图4 所示，控制组未以LPS诱发发炎反应，其iNOS的表现量为1.04±0.15％，而LPS组的iNOS表现量为100.00±10.74％。以浓度10μM的迪皮质醇(Dex)作为正控制组，其iNOS表现量显著下降(14.78±0.92％)，而100μg/mL的EH 可显著抑制iNOS的表现量(65.95±1.95％)。

图5显示控制组未以LPS诱发发炎反应，其COX-2的表现量为4.65±3.12％，而LPS组的COX-2表现量为 100.00±0.99％。以浓度10μM的迪皮质醇(Dex)作为正控制组，显著抑制COX-2表现量(2.90±0.71％)，而20– 100μg/mL的EH可显著抑制COX-2，表现量分别为68.55±0.46％、35.43±9.55％及72.77±7.81％。

(3)EH对异位性皮肤炎的疗效

小鼠以DNCB诱发异位性皮肤炎(atopic dermatitis，AD)病征，包含红斑、浮肿、表皮脱落、干燥及苔癣化等现象。在小鼠出现明显的红斑、浮肿、脱皮及干燥等病征后，每日涂抹EH或克立硼罗(crisaborole，Cri)，测试EH是否具有治疗AD的功效。观察及拍照记录小鼠的皮肤外观表征，如图6A，并以临床皮肤炎评分量化EH 的治疗效果，如图6B。

控制组因缺乏毛发披覆的关系，皮肤表面干燥，因此分数为0.75±0.25。AD组及ADV组的皮肤表面因角质细胞增生，形成一层厚厚的痂皮。随着天数增加，部分痂皮剥落后，可观察到诱发周围的皮肤干燥，而皮肤有皱褶现象；也因为发炎症状，皮肤有红斑及浮肿现象。而角质细胞仍然不断增生，因此皮肤表面仍具有一层痂皮。这两个组别的临床皮肤炎分数相较于控制组显著上升，分别为9.17±0.40及9.50±0.56。随着天数，在涂抹EH及克立硼罗的组别，痂皮剥落后，虽然仍可以观察到干燥、红斑及肿胀，但角质细胞增生程度似乎比AD组轻微，因此在动物牺牲前，EHL及EHH组的皮肤炎分数亦显著下降(4.50±0.50及3.67±0.67)。而Cri组的皮肤炎分数为4.80±0.37，相较于AD组具有统计意义。上述结果显示EH均具有舒缓AD病征的效果。

IgE是临床诊断异位性皮肤炎的指标之一。小鼠牺牲前，收取血清检测IgE的含量，结果如图7所示。控制组血清中的IgE含量为1.71±0.14μg/mL。AD组及ADV组的IgE浓度明显上升(68.89±4.12及68.95±2.60μg/mL)。 EHL及EHH组的IgE含量显著下降至52.32±3.41μg/mL及46.31±3.81μg/mL。而Cri组的血清IgE含量下降至 65.61±1.74μg/mL。涂抹EH能使血清中因异位性皮肤炎而上升的IgE下降。

若发生发炎或免疫相关的疾病，淋巴结及脾脏会肿大(swell)，因此小鼠牺牲时，收取这两个器官拍照，并秤量其重量。脾脏重量的结果如图8所示，控制组的脾脏重量为91.08±3.61mg。AD组及ADV组的脾脏明显肿大，是控制组的2.5倍(234.46±6.56及221.14±13.32mg)。EHL及EHH组的脾脏重量亦显著下降(161.23±9.97 及171.07±5.58mg)。而Cri组的脾脏重量显著下降为167.46±10.61mg。

淋巴结总重量的结果如图9所示，控制组的两颗淋巴结总重量为4.46±0.29mg。AD组及ADV组的淋巴结明显肿大，是控制组的3倍(12.07±0.33及11.61±0.54mg)。EHL及EHH组的淋巴结重量亦显著下降(9.06±0.54 及9.13±0.75mg)。Cri组的淋巴结重量显著下降为9.49±0.81mg。结果显示因异位性皮肤炎所造成发炎或免疫反应而肿大的淋巴结及脾脏，涂抹EH能使抑制前述的现象。

本发明适当地描述可以在本文未具体公开的要件或限制下实施。已被用作描述的术语并不是限制。在使用这些术语和除此之外的任何同等物的表达和描述是没有差别的，但应当认识到本发明内的权利是可能修改的。因此，虽然本发明已说明实施例和其他情况，本文中所公开的内容可以被本领域的技术人员进行修饰和变化，并且这样的修改和变化被认为是在本发明的权利范围之内。

Claims

1.一种双裂海木耳萃取物用在制备皮肤美白的组合物的用途，其中所述双裂海木耳萃取物的制备方法包含步骤如下：（a）用醇类溶剂对双裂海木耳进行萃取，得双裂海木耳醇类萃取物，其中所述醇类溶剂为甲醇或乙醇；（b）用有机溶液或超临界萃取对所述双裂海木耳醇类萃取物进行分配萃取，以形成有机溶剂层以及水性层，然后收取所述水性层，其中所述有机溶液为有机溶剂或是水与有机溶剂的混合液，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、甲醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿或四氯化碳；（c）用正丁醇对步骤（b）所得到的水性层进行分配萃取，以形成正丁醇层以及水性层，然后收取所述水性层，以得到所述双裂海木耳萃取物。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述双裂海木耳萃取物抑制黑色素生成或减少黑色素。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含化妆品组合物或药物。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述醇类溶剂为乙醇。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述有机溶剂为乙酸乙酯。