CN101603064B - 一种由卫矛醇制备d-塔格糖以及l-塔格糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物技术领域的由卫矛醇制备D-塔格糖以及L-塔格糖的方法：制备培养基；将产酸细菌接种在培养基中，制备一级种子液和二级种子液；利用二级种子液培养得到含有D-塔格糖与L-塔格糖的水溶液；本发明还涉及一种采用静息细胞技术的制备方法：将产酸细菌接种于培养基中培养；培养结束后离心得到菌体细胞，用含有D-卫矛醇的水溶液悬浮菌体细胞，培养得到含有D-塔格糖与L-塔格糖的水溶液；本发明还涉及一种采用固定化细胞技术的制备方法：将产酸细菌接种于培养基中进行培养；培养结束后离心得到菌体细胞；采用固定化细胞技术制备得到含有D-塔格糖与L-塔格糖的水溶液。本发明的方法绿色安全、转化效率高，可制备医药级D-塔格糖与L-塔格糖。
Description
技术领域
本发明涉及的是生物技术领域的糖的制备方法，具体是一种利用卫矛醇制备D-塔格糖以及L-塔格糖的方法、一种采用静息细胞来转化D-卫矛醇制备D-塔格糖与L-塔格糖的方法以及一种采用固定化细胞来转化D-卫矛醇制备D-塔格糖与L-塔格糖的方法。
背景技术
蔗糖在食品中的应用目前仍处于主导地位，人们几乎每天都会食用含蔗糖的食品，其不但作为甜味剂而且还提供大量的热量，过多食用蔗糖会引起多种健康问题，尤其是肥胖以及龋齿，在发达国家尤其严重。肥胖与II型糖尿病的发生密切相关，在美国，几乎每10个肥胖患者中就有9个被诊断出患有不同程度的II型糖尿病(Diabetes，Obesity and Metabolism，2008，10：109-134)。因此，越来越多人在食用低热量甚至零热量的甜味剂，替代食用蔗糖以避免食用蔗糖带来的健康问题。D-塔格糖(D-tagatose)是一种天然的稀有糖，在奶制品中即存在少量的D-塔格糖(J of Med Food，2002，5：23-36)，与蔗糖相比，其热量仅为1.5kcal/g，而蔗糖为4kcal/g。经过长达10余年的各种研究，包括药理学研究(FEBS Lett，1975，52：292-294；Arch Biochem Biophys，1982，218：488-491；Metabolism，2000，49：1335-1339)、毒理学研究(Br J Nutr，2000，84：227-231；Regul Toxicol Pharmacol，2001，33：257-267；Regul ToxicolPharmacol，1999，29：S29-S35；Regul Toxicol Pharmacol，1999，29：S11-S28；Regul Toxicol Pharmacol，1999，29：S1-S10；Regul Toxicol Pharmacol，1999，29：S78-S82)，充分证明D-塔格糖是一种安全的低热量蔗糖替代品，并具有明显的抗糖尿病的功效。目前对D-塔格糖的抗糖尿病的试验已经做到临床III期。美国FDA已于2001年批准其在食品中添加使用，并将其加入公认安全食品添加剂(Generally recognized as safe，GRAS)名单中。其后，韩国(2003年)、澳大利亚、新西兰(2004年)、欧盟(2005年)均批准其在食品中添加使用。世界卫生组织(WHO)与联合国粮农组织(FAO)的食品添加剂委员会(2004年)经过多次讨论评估并申明不需要对D-塔格糖的每日使用量做出限制。
许多L-构型的稀有糖已经被用来合成药物的中间体(Enzyme and microbialTechnol，2007，27：734-742)。L-塔格糖(L-tagatose)是D-塔格糖的手性对应体，目前也已经被利用为合成药物的中间体，如合成1-deoxy-1-(indol-3-yl)-L-tagatose及其类似物(Carbohydr Res，2003，338：143-152)、1-(1-Butylinol-3-yl)-1-deoxy-L-tagatose及其类似物(Nucleosides Nucleotides NucleicAcids，2004，23：281-289)。鉴于塔格糖尤其是D-塔格糖在食品医药中的重要作用，怎样高效廉价制备塔格糖就成为相关生产企业以及研究机构的首要任务。
经对国内外关于塔格糖制备的技术文献检索发现，美国专利US5002612(1991年公开)以及US5078796(1991年公开)描述了采用化学法合成D-塔格糖的方法。该方法的基本步骤为：将D-半乳糖(D-galactose)与金属氢氧化物(比如氢氧化钙)混合，加入催化剂(比如氯化钙)，在低温下进行反应形成金属氢氧化物-D-塔格糖中间化合物，然后加入酸(比如盐酸)中和，D-塔格糖从上述中间化合物解离形成游离的D-塔格糖，再从此反应混合物中分离纯化D-塔格糖。该方法同时也讲述了从L-半乳糖采用同样的方法制备L-塔格糖。该方法描述的从D-半乳糖制备D-塔格糖的方法虽然反应速率较快(可以短至1.5小时)，得率也较高(可以达到80％)，但存在反应副产物较多，除了含有目的产物外还含有D-山梨糖(1％以上)以及其它未知的化合物(2％以上)，使得分离得到适合医药使用的D-塔格糖比较困难。
美国专利US6933138B2(2005年公开)以及US2008/0124770A1(2008年公开)描述了采用热稳定性L-阿拉伯糖异构酶进行异构化D-半乳糖生成D-塔格糖的方法。该方法的基本步骤为：从耐热微生物Thermotoga neapolitanaDSM5068中克隆耐热L-阿拉伯糖异构酶基因并构建表达载体，将此含有L-阿拉伯糖异构酶基因的表达载体进行异源表达生产耐热L-阿拉伯糖异构酶，将此酶进行分离纯化并固定化实现从D-半乳糖到D-塔格糖的转化。该方法得到的D-塔格糖虽然较化学法合成的要纯，一般不会产生反应副产物，但是由于需要制备L-阿拉伯糖异构酶，将酶进行固定化存在稳定性差的问题，采用此法生产D-塔格糖存在成本过高的问题。
中国发明专利CN200610085922.2(2007年公开)描述了一种采用乳酸细菌转化D-半乳糖为D-塔格糖的方法。该方法的基本步骤为：将乳酸菌(比如Lactobacillus plantarum)接种在含有D-半乳糖的发酵培养基中在一定条件下进行发酵，得到含有D-塔格糖的发酵液。该方法虽然绿色安全，所用的菌株为安全微生物，但是转化率较低，每100毫升发酵液最多得到450毫克的D-塔格糖。
L-塔格糖已被利用作为合成一些药物的前体，由于目前L-塔格糖非常昂贵，限制了其使用，因此研究廉价的L-塔格糖的制备方法对推广L-塔格糖的使用非常重要。日本香川大学(Kagawa University)的Shimonishi Tsuyoshi等人描述了一种利用克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)发酵D-卫矛醇来制备L-塔格糖的方法(J Ferment Bioeng，1995，79：620-622)，该菌能将1％的D-卫矛醇以90％的转化率转化为L-塔格糖。但是该方法采用的宿主菌为致病菌，而且发酵过程中会分泌毒素因子到培养基中，存在安全隐患，不宜推广使用。因此寻求一种安全廉价的制备L-塔格糖的方法对推广L-塔格糖的使用非常重要。D-卫矛醇又指D-半乳糖醇、甜醇或者环己醇，CAS号为608-66-2，英文为D-galactitol或dulcitol。
总之，依靠现行的技术来制备D-塔格糖或者L-塔格糖存在生产成本高以及安全隐患等缺点，因此开发一种廉价、绿色高效的D或L-塔格糖制备方法显得非常必要。本发明的目的即为开发一种廉价、绿色安全的D-塔格糖以及L-塔格糖的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供制备D-塔格糖与L-塔格糖的方法。本发明的方法绿色安全、转化效率高，适合用来制备医药级D-塔格糖与L-塔格糖。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种利用D-卫矛醇同时制备D-塔格糖与L-塔格糖的方法，包括如下步骤：
步骤一，制备培养基，培养基的成分为：1L培养基由以下组分组成，D-卫矛醇：20克；山梨醇：10克；葡萄糖：5～50克；酵母粉：10克；无水硫酸镁：0.5克；碳酸钙：10克；余量为水；
步骤二，将产酸细菌接种在含有步骤一所得的培养基中，25～35℃振荡培养，得到一级种子液；
步骤三，将一级种子液接种到含有步骤一所得的培养基中，25～35℃振荡培养，培养得到二级种子液；
步骤四，将二级种子液按照体积比为5～20％的接种量接种到发酵培养基中，培养得到含有D-塔格糖与L-塔格糖的水溶液；发酵培养基的成分为，1L发酵培养基由以下组分组成：D-卫矛醇：10～100克；山梨醇：5～20克；葡萄糖：5～50克；酵母粉：5～50克；硫酸镁：0.5克，磷酸氢二钾：2克；余量为水。
步骤二中，所述产酸细菌来自于醋酸杆菌属(Acetobacter)、氧化葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)或者葡糖酸杆菌属(Gluconacetobacter)。
所述醋酸杆菌属的细菌选自弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)、汉逊醋酸杆菌(Acetobacter hansenii)或者巴氏醋酸杆菌(Acetobacterpasteurianus)中的一种。
所述醋酸杆菌属的细菌为弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)。
所述氧化葡萄糖杆菌属的细菌选自氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)或者Gluconobacterfrateurii中的一种。
所述葡萄酸杆菌属的细菌为汉逊葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacterhansenii)。
本发明还涉及一种采用静息细胞来转化D-卫矛醇同时制备D-塔格糖与L-塔格糖的方法，包括如下步骤：
步骤一，制备培养基，培养基的成分为：1L培养基由以下组分组成，D-卫矛醇：10克；山梨醇：10克；葡萄糖：20克；酵母粉：15克；硫酸镁：0.5克；磷酸氢二钾：2克；碳酸钙：5克；余量为水；将醋酸杆菌属、氧化葡萄糖杆菌属或者葡糖酸杆菌属细菌接种于培养基中进行培养；
步骤二，培养结束后，离心得到菌体细胞，用含有质量分数为1％～10％的D-卫矛醇的水溶液悬浮菌体细胞，28～32℃、300rpm下培养24～96小时，得到含有D-塔格糖与L-塔格糖的水溶液。
本发明还涉及一种采用固定化细胞来转化D-卫矛醇同时制备D-塔格糖与L-塔格糖的方法，包括如下步骤：
步骤一，制备培养基，培养基的成分为：1L培养基由以下组分组成，D-卫矛醇：10克；山梨醇：10克；葡萄糖：20克；酵母粉：15克；硫酸镁：0.5克；磷酸氢二钾：2克；碳酸钙：5克；余量为水；将醋酸杆菌属、氧化葡萄糖杆菌属或者葡糖酸杆菌属细菌接种于培养基中进行培养；
步骤二，培养结束后，离心得到菌体细胞；用0.1M的海藻酸钠溶液充分悬浮菌体细胞，得到悬浮溶液；将悬浮溶液滴入0.1M的无菌氯化钙溶液中，搅拌，静置，弃上清，再加入0.1M氯化钙溶液，4℃凝固2小时，弃上清，洗涤沉淀，得到固定化细胞；按5～20％的接种量将固定化细胞接入增殖培养基中，28～32℃、300rpm培养24小时；增殖培养基的成分为：1L培养基由以下组分组成，山梨醇：10克；甘油：5克；葡萄糖：20克；酵母粉：15克；余量为水；
步骤三，培养结束后用无菌水洗涤固定化细胞，将固定化细胞加入含有质量分数为1％～10％的D-卫矛醇无菌水溶液中，28～32℃、300rpm培养24～96小时，得到含有D-塔格糖与L-塔格糖的水溶液。
本发明所涉及的菌株为公认安全的菌株，均已公开。
本发明具有如下的有益效果：本发明的方法不但能从D-卫矛醇制备D-塔格糖，还能从D-卫矛醇制备L-塔格糖，具有绿色安全、转化效率高的优点，适合用来制备医药级D-塔格糖与L-塔格糖。
附图说明
图1为海藻酸包埋法固定化细胞培养60h后HPLC图谱；
图2为琼脂糖凝胶包埋法包埋法固定化细胞培养60h后HPLC图谱；
图3为明胶包埋法固定化细胞培养60h后HPLC图谱；
图4为静息细胞转化D-卫矛醇为塔格糖的HPLC图谱；
图5为高密度静息细胞转化D-卫矛醇为塔格糖的HPLC图谱；
图6为Acetobacter suboxydans细胞发酵D-卫矛醇为塔格糖的HPLC图谱。
具体实施方式
以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
本发明所涉及的菌株为公认安全的菌株，均已公开。
实施例1
菌株的筛选
本发明所使用的菌株包括：Acetobacter aceti，Acetobactersuboxydans，Ace tobac ter hansenii，Acetobacter liquefaciens，Acetobacterlovaniensis，Acetobacter pasteurianus，Acetobacter orleanenis，Acetobacter wieringae，Gluconobacter oxydans，Gluconobacter suboxydans，Gluconobacter frateurii，Gluconacetobacter hansenii，Gluconacetobacterliquefaciens，Gluconacetobacter xylinus。首先将上述菌株在种子培养基中于30℃、250rpm培养24小时得到种子菌液。每升种子培养基含：D-卫矛醇：5克；甘油：5克；葡萄糖：10克；酵母粉：10克；磷酸氢二钾：2克；碳酸钙：5克，用水补加到一升，pH6.0。培养结束后，取10ml加入到发酵培养基中，在30℃、250rpm培养72小时。每升发酵培养基含：D-卫矛醇：30克；甘油：5克；葡萄糖：20克；酵母粉：15克；磷酸氢二钾：2克；硫酸镁0.2克；碳酸钙：5克，用水补加到一升，pH6.0。培养结束后取1ml发酵液离心取上清过0.22um的膜，进行HPLC检测，检验哪种菌由D-卫矛醇转化为D-塔格糖以及L-塔格糖的能力最强。表1结果表明，Acetobacter suboxydans是供试菌株中由D-卫矛醇转化为D-塔格糖以及L-塔格糖能力最强，转化效率最高的菌株。
表1供试菌株产D、L-塔格糖的产量比较
| 菌株 | D-塔格糖(g L-1) | L-塔格糖(g L-1) | 残留的D-卫矛醇(gL-1) |
| Acetobacter aceti | 0.25 | 1.36 | 29.77 |
| Acetobacter suboxydans | 8.57 | 12.46 | 9.54 |
| Acetobacter hansenii | 1.64 | 2.52 | 25.78 |
| Acetobacter liquefaciens | 1.85 | 2.76 | 26.98 |
| Acetobacter lovaniensis | 2.67 | 4.03 | 22.43 |
| Acetobacter pasteurianus | 1.41 | 3.19 | 25.24 |
| Acetobacter orleanenis | 1.22 | 2.86 | 26.01 |
| Acetobacter wieringae | 1.12 | 2.93 | 26.13 |
| Gluconobacter oxydans | 1.35 | 3.72 | 23.91 |
| Gluconobacter suboxydans | 0.87 | 1.86 | 23.93 |
| Gluconobacter frateurii | 2.14 | 4.22 | 22.73 |
| Gluconacetobacter hansenii | 1.38 | 3.57 | 24.72 |
| Gluconacetobacterliquefaciens | 0.74 | 1.94 | 27.05 |
| Gluconacetobacter xylinus | 0.83 | 1.96 | 27.37 |
实施例2
海藻酸包埋法固定化细胞的制备并用于转化D-卫矛醇为D-塔格糖以及L-塔格糖
将Acetobacter suboxydans在种子培养基中于30℃、250rpm培养48小时得到种子菌液。每升种子培养基含：D-卫矛醇：5克；甘油：5克；葡萄糖：10克；酵母粉：10克；磷酸氢二钾：2克；碳酸钙：5克，用水补加到一升，pH6.0。培养结束后离心弃上清得到菌体，菌体用0.1M的无菌海藻酸钠溶液重新悬浮，吸入无菌注射器，缓缓滴入0.1M CaCl2溶液中使形成固体小球沉淀，置于4℃冰箱中2-4小时或过夜，然后弃上清并用无菌水洗涤一次，置于增殖培养基中在28-32℃、300rpm培养过夜。所述增殖培养基的成分为：0.5-5％山梨醇、0.5-5％甘油、1-5％葡萄糖、0.5-5％酵母粉。然后将增殖后的固定化细胞以20％的接种量(w/v)加入50ml 3％的D-卫矛醇水溶液中，在32℃、300rpm培养60小时，培养结束后HPLC分析转化率以及塔格糖的含量，结果如图1。经积分计算，D-塔格糖与L-塔格糖的含量分别为4.53g/L与7.71g/L，残留的D-卫矛醇为16.2g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的总转化率为40.8％，产率为0.204g/L·h。
实施例3
琼脂糖包埋法固定化细胞的制备并用于转化D-卫矛醇为D-塔格糖以及L-塔格糖
将Acetobacter suboxydans在种子培养基中于30℃、250rpm培养48小时得到种子菌液。每升种子培养基含：D-卫矛醇：5克；甘油：5克；葡萄糖：10克；酵母粉：10克；磷酸氢二钾：2克；碳酸钙：5克，用水补加到一升，pH6.0。培养结束后离心弃上清得到菌体，用无菌水悬浮，加入40℃琼脂糖溶液中(20g/L，w/v)充分混匀并使之凝固，切成小块，加入增殖培养基在28-32℃、300rpm培养过夜。所述增殖培养基的成分为：0.5-5％山梨醇、0.5-5％甘油、1-5％葡萄糖、0.5-5％酵母粉。其余步骤同实施例2。培养结束后HPLC分析转化率以及塔格糖的含量，结果如图2。经积分计算，D-塔格糖与L-塔格糖的含量分别为4.89g/L与4.74g/L，残留的D-卫矛醇为18.9g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的总转化率为30.2％，产率为0.165g/L·h。
实施例4
明胶包埋法固定化细胞的制备并用于转化D-卫矛醇为D-塔格糖以及L-塔格糖将Acetobacter suboxydans在种子培养基中于30℃、250rpm培养48小时得到种子菌液。每升种子培养基含：D-卫矛醇：5克；甘油：5克；葡萄糖：10克；酵母粉：10克；磷酸氢二钾：2克；碳酸钙：5克，pH6.0。培养结束后离心弃上清得到菌体，用无菌水悬浮，加入40℃的明胶溶液中(100g/L，w/v)充分混匀并使之凝固，切成小块，浸入10％戊二醛溶液中交联固定2小时，用无菌水洗涤2次，加入增殖培养基在28-32℃、300rpm培养过夜。所述增殖培养基的成分为：0.5-5％山梨醇、0.5-5％甘油、1-5％葡萄糖、0.5-5％酵母粉。其余步骤同实施例2。培养结束后HPLC分析转化率以及塔格糖的含量，结果如图3。经积分计算，D-塔格糖与L-塔格糖的含量分别为3.93g/L与3.51g/L，残留的D-卫矛醇为20.45g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的总转化率为28.1％，产率为0.128g/L·h。
实施例5
静息细胞转化D-卫矛醇为塔格糖
将Acetobacter suboxydans在种子培养基中于30℃、250rpm培养48小时得到种子菌液。种子培养基成分同实施例4。培养结束后离心弃上清得到菌体，加入20ml 2.5％D-卫矛醇水溶液，菌体密度OD600在10。在30℃、300rpm培养60h，检测塔格糖的转化率以及含量。结果如图4。经积分计算，D-塔格糖与L-塔格糖的含量分别为6.57g/L与6.63g/L，残留的D-卫矛醇为10.12g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的总转化率为52.8％，产率为0.22g/L·h。
实施例6
高密度静息细胞转化D-卫矛醇为塔格糖
将Acetobacter suboxydans在种子培养基中于30℃、250rpm培养48小时得到种子菌液。种子培养基成分同实施例4。培养结束后离心弃上清得到菌体，加入20ml 3.0％D-卫矛醇水溶液，菌体密度OD600在20。30℃、300rpm培养60h，检测塔格糖的转化率以及含量。结果如图5。经积分计算，D-塔格糖与L-塔格糖的含量分别为10.68g/L与12.96g/L，残留的D-卫矛醇为7.65g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的总转化率为78.8％，产率为0.39g/L·h。
实施例7
Acetobacter suboxydans细胞发酵D-卫矛醇为塔格糖
将Acetobacter suboxydans在种子培养基中于30℃、250rpm培养48小时得到种子菌液。种子培养基成分同实施例4。按照5％接种量接种到50ml的发酵培养基中，发酵培养基成分为(g/L)：D-卫矛醇30克，甘油5克，山梨醇5克，葡萄糖10克，酵母粉20克，磷酸氢二钾2克，硫酸镁0.2克，碳酸钙5克，并用水补加到一升，pH6.5。在30℃、250rpm在培养72h，分析塔格糖的含量，如图6。经积分计算，D-塔格糖与L-塔格糖的含量分别为8.04g/L与9.15g/L，残留的D-卫矛醇为12.06g/L，由D-卫矛醇转化为塔格糖的总转化率为57.3％，产率为0.24g/L·h。
Claims (2)
1.一种采用静息细胞来转化D-卫矛醇同时制备D-塔格糖与L-塔格糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，制备培养基，每升种子培养基含：D-卫矛醇：5克；甘油：5克；葡萄糖：10克；酵母粉：10克；磷酸氢二钾：2克；碳酸钙：5克，pH6.0，将Acetobacter suboxydans在种子培养基中于30℃、250rpm培养48小时得到种子菌液；
步骤二，培养结束后离心弃上清得到菌体，加入20ml 2.5％D-卫矛醇水溶液或3％D-卫矛醇水溶液，在30℃、300rpm培养60h，从而得到含量分别为6.57g/L与6.63g/L的D-塔格糖和L-塔格糖，或得到含量分别为10.68g/L与12.96g/L的D-塔格糖和L-塔格糖。
2.一种采用固定化细胞来转化D-卫矛醇同时制备D-塔格糖与L-塔格糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，制备培养基，每升种子培养基含：D-卫矛醇：5克；甘油：5克；葡萄糖：10克；酵母粉：10克；磷酸氢二钾：2克；碳酸钙：5克，用水补加到1升，pH6.0，将Acetobactersuboxydans在种子培养基中于30℃、250rpm培养48小时得到种子菌液；
步骤二，培养结束后离心弃上清得到菌体，用0.1M的无菌海藻酸钠溶液重新悬浮，吸入无菌注射器，缓慢滴入0.1M的氯化钙溶液中使形成固体小球沉淀，置于4℃冰箱中2-4小时或过夜，然后弃上清并用无菌水洗涤一次，置于增殖培养基中在28～32℃、300rpm培养过夜；
所述的增殖培养基的成分为：0.5-5％山梨醇、0.5-5％甘油、1-5％葡萄糖、0.5-5％酵母粉；
步骤三，将增殖后的固定化细胞以质量体积比20％的接种量加入50mL 3％的D-卫矛醇水溶液中，在28～32℃、300rpm培养60小时，得到含量分别为4.53g/L和7.71g/L的D-塔格糖与L-塔格糖。
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