CN101363009B - 一种表达右旋糖酐蔗糖酶基因工程菌及其构建方法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种表达右旋糖酐蔗糖酶基因工程菌由右旋糖酐蔗糖酶基因(dexYG)插入到表达质粒pET28a中，构建出重组表达质粒pET28-dexYG，将此重组表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，获得高效表达右旋糖酐蔗糖酶的基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG。在合适的诱导条件下，工程菌可以高表达、稳定地发酵生产右旋糖酐蔗糖酶。以蔗糖为底物，用右旋糖酐蔗糖酶在较为简单的催化条件下生产右旋糖酐，摩尔转化率达到70～85％。本发明从根本上提升国内现有的右旋糖酐生产工艺，得到工艺先进、品质优良的右旋糖酐生产工艺。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种基因工程菌及其制备方法和用途，特别涉及大肠杆菌构建的基因工程菌和用途，具体地说是一种高效表达右旋糖酐蔗糖基因工程菌及其构建方法和用途。
二、背景技术
右旋糖酐(dextran)，又名葡聚糖，是蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，主要由葡萄糖基α(1-6)苷键连接而成。因其具有安全、无毒、生物相容性好等多种优点，已被广泛应用于医药、食品、色谱分析等多个领域(Malten M，等.Biotechnol.&bioeng.2004，88：778-787)。临床上应用的有三种规格：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。右旋糖酐70是目前公认的优良血浆代用品之一，有增加血容量作用，临床主要用于治疗因失血、创伤、烧伤和中毒等引起的失血性休克。右旋糖酐40和右旋糖酐20具有改善微循环作用，主要通过解除红细胞聚集，减少血液粘度等作用而改善微循环，同时也具有一定的补充血容量作用。右旋糖酐-20降低血小板粘附与聚集作用优于右旋糖酐-40，可防止和治疗血栓，临床上主要用于治疗各种类型的中毒性休克、烧伤、冻伤、胰腺炎、脂肪栓塞等引起的微循环紊乱和衰竭。对防止和治疗动脉、静脉血栓塞症，血栓塞、闭塞性脉管炎、眼底动脉栓塞有一定疗效。低分子量的葡聚糖可作为药用辅料挂接药物。
目前国内的药用右旋糖酐大多是以高浓度蔗糖为培养碳源经肠膜状明串珠菌(L.mesenteriodes)发酵生产的，生产工艺主要采用厌氧发酵、乙醇捏洗、盐酸水解、乙醇划分等。该工艺乙醇消耗量大，生产环境恶劣，发酵过程中菌体与右旋糖酐互相缠绕，致使菌体与产品很难分离，生产中又引入了杂氮、氯离子、硫酸盐灰分等杂质，致使其右旋糖酐产品质量低，指标达不到日本、欧美的药典标准，且临床副反应多，同时无法进入国际市场，缺少竞争力。国内对右旋糖酐生产工艺研究仅限于在传统发酵工艺中对发酵液过滤，水解、分级划分等单元操作的改进，不能从工艺本质上提高产品质量。
分析发现，要升级右旋糖酐生产工艺，有2个关键技术尚待解决：①获得纯化的游离右旋糖酐蔗糖酶技术。因为培养该微生物的碳源与酶反应的底物为同一种物质即蔗糖，导致在培养过程中随着右旋糖酐蔗糖酶的出现也生成了右旋糖酐，高分子的葡聚糖与酶缠绕在一起很难分离，难以获得游离酶；②去除细菌体技术。随着细菌的生长而生成的葡聚糖使菌体难以分离，部分菌体与酶一起被固定化，导致酶反应变化因素较多，条件控制复杂。大量文献分析表明从原始菌种出发进行的酶法制备技术由于其难以避免的缺点，研究人员已经借助现代生物工程技术来构建基因工程菌以改变微生物的培养基和获得纯酶技术来制备右旋糖酐。右旋糖酐蔗糖酶是一种由肠膜状明串珠菌产生的、以蔗糖为底物催化合成葡聚糖的水解合成酶。该酶由从1250到1600个不同的氨基酸构成(Monchois V，FEMS.Microbiology Reviews1999，23：131～151)其催化原理如下式所示：
1996年第一个右旋糖酐蔗糖酶基因被分离出来，截止到2006年8月，经检索在NCBI的GenBank中登记的来自不同国家的此酶基因有8种(Lee J H，等.FEMS.Microbiol Lett 2006，259：240-248)。
迄今为止，有关利用右旋糖酐蔗糖酶或基因工程技术制备右旋糖酐在国内外文献未见报道。国外对右旋糖酐生产工艺的改进方法研究较多，其中对右旋糖酐蔗糖酶的结构解析、酶催化原理等酶特性的基础研究报道居多，瑞士的Neubauer H.等克隆出右旋糖酐蔗糖酶基因dsrD并在酵母菌转化获得基因工程菌，摩尔转化率达到60％，但利用原核生物高表达右旋糖酐蔗糖酶，国内外均未见报道。基因工程法制备右旋糖酐工艺技术是目前国际研究热点和解决问题的关键。
三、发明内容用
本发明旨在用右旋糖酐蔗糖酶取代肠模状明串珠菌生产高质量的右旋糖酐，所要解决的技术问题是用基因工程的手段构建能高效表达右旋糖酐蔗糖酶的基因工程菌株并通过诱导制备该酶用于右旋糖酐的生产。
本发明所称的基因工程菌株是大肠杆菌基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG，它具有高效表达右旋糖酐蔗糖酶的特性。
本基因工程菌株由含右旋糖酐蔗糖酶基因的重组表达质粒在宿主菌中转化而得，并经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证。所述的宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，购自Promega公司。所述的重组表达质粒是用右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG插入到载体pET28a(+)中构建而成，载体pET28a(+)购自Novagen公司。所述的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG是以工业菌株肠膜状明串珠菌LM-0326的基因组为模板，运用PCR扩增技术克隆得到的。申请人已成功完成了右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG的克隆和测序工作，共有碱基4584bp。同时注册GenBank，Accession No.DQ345760。
具体地说本基因工程菌与现有技术的区别在于：是由克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG插入到表达载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28-dexYG于大肠杆菌BL21(DE3)中转化得到的基因工程菌BL21(DE3)/pET28-dexYG。
构建本基因工程菌的技术方案包括引物设计、重组表达质粒和宿主菌转化，所述的引物设计是根据已经克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因(dexYG)序列，按照载体pET28a(+)的序列特征，借助VectorNT9.0软件设计引物如下：
正向引物：5’CCGTAGATCTTCATGCCATTTACAGAAAAATG 3’(包含一个BglII位点)；
反向引物：5’CCGCTCGAGCTTATGCTGACACAGCATCC 3’(包含一个XhoI位点)。
所述的重组表达质粒是以已经克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因(dexYG)为模版，利用PCR扩增技术，得到含BglII和XhoI酶切位点的基因克隆产品。将上述的克隆产品用BglII和XhoI酶切，酶切产品连接到载体pET28a(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET28-dexYG。
所述的宿主菌转化是将重组表达质粒pET28-dexYG转化到经CaCl2处理的E.coli BL21(DE3)中，CaCl2法大肠杆菌感受态细胞制备见文献(Sambrook J，等.A Laboratory Manual.2ndEd.，1989)，经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后，获得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG。
由基因工程菌高效表达右旋糖酐蔗糖酶的发酵培养的技术方案包括接种、培养、诱导、破碎和分离，具体地说就是将基因工程菌BL21(DE3)/pET28-dexYG接种到含40～60μg/mL卡那霉素的LB培养基中，转速250r/min，35～40℃培养，当菌浓度OD600达到0.6～1.0时加入浓度为0.5～1.0mmol/L IPTG发酵液，23～28℃发酵诱导4～6小时，发酵液离心分离得到菌体，向菌体中加入pH5～6醋酸缓冲液，超声破碎，离心分离，上清液即为粗酶液，经浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶产品，酶活达15～20U/mL。
实验表明在培养、诱导过程中，培养液的pH值会逐步升高，并且是导致在诱导后其酶活迅速下降的主要原因，当培养液起始pH6.0～6.5时，按上述条件进行培养、发酵、诱导，酶活达到30～35U/mL，底物的摩尔转化率达70～85％。
右旋糖酐蔗糖酶活力的测定采用3，5-二硝基水杨酸试剂法测还原糖的量(DNS法)。步骤为：取5mL发酵液，8000r/min离心10min，取上清液2ml(酶液)与2ml底物(0.2M NaAc860mL，0.2M HAc 140ml，蔗糖100g，pH5.4)混合，取出0.5ml加入0.375ml DNS试剂，在沸水浴中加热5min，待其冷却到室温后，加入5.375ml蒸馏水，摇匀放入冰箱作为空白。余下的混合溶液25℃下培养60min，取出0.5mL加入0.375ml DNS试剂，在沸水浴中加热5min，待其冷却到室温后，加入5.375ml蒸馏水，摇匀。在520nm波长下，测其OD值。同时配制标准曲线，从标准曲线上查出酶液的果糖含量，计算在各种培养条件下右旋糖酐蔗糖酶的酶活力。酶底物反应液配制。酶活力定义：在35℃下，每小时催化底物蔗糖产生0.1mg果糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
本基因工程菌的用途是由该基因工程菌发酵制备得到的右旋糖酐蔗糖在以蔗糖为底物制备右旋糖酐中的应用。
应用上述右旋糖酐蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，其步骤为：
1)酶底物反应液配制：0.2M NaAc 860mL，0.2M HAc 140ml，蔗糖100g，pH5.4。不同体积可按此比例配制；
2)按底物反应液：右旋糖酐蔗糖酶粗酶液＝2∶1～1.5的体积比例加酶液；
3)上述混合液在30～35℃、时间1～5小时进行催化反应；通过控制温度、时间和加酶量控制右旋糖酐的聚合度。
4)将催化后的反应液进行过滤、超滤、浓缩、醇沉洗涤，真空干燥称重，摩尔转化率达到70～85％。
本发明构建的高效表达右旋糖酐蔗糖酶基因工程菌，改变原有微生物的培养基；分离随着细菌的生产过程中出现的菌体，获得较纯的右旋糖酐蔗糖酶酶；直接用右旋糖酐蔗糖酶液制备右旋糖酐，从根本上提升国内现有的右旋糖酐生产工艺，得到工艺先进、品质优良的右旋糖酐生产工艺，消除杂蛋白和氯离子等杂质，提高产品品质。
四、具体实施方式
实施例1：重组表达质粒pET28-dexYG的构建
根据已经克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因(dexYG)序列，按照表达载体pET28a(+)的序列特征，借助VectorNT9.0软件设计引物如下：
正向引物：5’CCGTAGATCTTCATGCCATTTACAGAAAAATG 3’(包含一个BglII位点)；
反向引物：5’CCGCTCGAGCTTATGCTGACACAGCATCC 3’(包含一个XhoI位点)。
以已经克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因(dexYG)为模版，利用PCR扩增技术，得到含BglII和XhoI酶切位点的基因克隆产品，PCR产品回收程序如下：
(1)将DNA电泳凝胶置于长波紫外灯下，切出含所需DNA片段的凝胶，装入一个预先称重的Eppendorf离心管，称出凝胶的重量。
(2)加入三倍体积的6mol/L NaI(0.1g凝胶加300μl)，于45℃水浴保温5min。
(3)加入5μl Glass Milk，于旋涡混和器混匀。
(4)置于冰浴中保持10min，并每隔1~2min振荡一次离心管，使DNA尽可能被Glass Milk吸附。
(5)离心(台式离心机，15,000r/min，5sec)沉淀Glass Milk，弃去上清液。
(6)加入200μl冷冻保存(-20℃)的New Wash缓冲液，于旋涡混和器悬浮Glass Milk，离心(台式离心机，15,000r/min，5sec)洗涤。此过程需重复三次，最后一次洗涤应尽可能吸干残余在管底的New Wash缓冲液。
(7)加入5～10μl无菌蒸馏水，振荡使Glass Milk悬浮，放置45℃水浴保温5min，使吸附的DNA被解吸，离心(台式离心机，15,000r/min，5sec)，将洗脱液移入一个新离心管。此过程需重复三次，合并三次洗脱液。
(8)离心(台式离心机，15,000r/min，5sec)沉淀可能带入的Glass Milk，将洗脱液移入一个新离心管。此时，洗脱液含有BglII和XhoI酶切位点的基因克隆产品，可直接用于酶切反应。
构建重组表达质粒pET28-dexYG：将上述洗脱液(克隆产品)用BglII和XhoI酶切，酶切产品连接到pET28a(+)的双酶切位点上，得到重组表达质粒pET28-dexYG。表达载体与酶切产物连接体系：表达载体pET28a(+)0.5μl、基因酶切1.5μl、T4 DNA连接酶0.5μl、buffer2.5μl，16℃连接过夜。
实施例2：基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG的构建
将重组表达质粒pET28-dexYG转化到经CaCl2处理的E.coli BL21(DE3)中，CaCl2法大肠杆菌感受态细胞制备见文献(Sambrook J，等.A Laboratory Manual.2ndEd.，1989)，经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后，获得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG。
大肠杆菌感受态细胞制备(CaCl2法)流程如下：
(1)用新鲜生长的平板单菌落或甘油冷冻保存菌液接种2ml LB的液体培养基，于37℃振荡培养过夜。
(2)以1％的接种量接种装有20ml LB的液体培养基的250ml三角瓶，于37℃振荡培养2h左右，控制OD600在0.3～0.5。
(3)将菌液移入50ml的无菌Beckman塑料离心管，在冰浴中放置10min。
(4)离心(Beckman Avanti J-25，转子JA17，6,000r/min，4℃，10min，下同)回收菌体。
(5)倾去培养液，并将离心管倒置以使最后残留的痕量培养液流尽。
(6)将菌体沉淀悬浮于10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，菌体经洗涤后离心回收。
(7)将菌体重新悬浮于10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，在冰浴中保持30min。
(8)离心回收菌体细胞，倾去上层溶液并将离心管倒置以使最后残留的溶液流尽。
(9)将菌体悬浮于800μl用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，置于4℃或-70℃冰箱保存。
(10)新鲜制备和4℃冰箱保存(48h之内)的感受态细胞都可直接用于转化。
大肠杆菌质粒转化流程如下：
(1)将微量DNA连接产物(体积≤10μl，DNA≤50ng)用冷却的无菌吸头加入含有100μl感受态细胞、预先置于冰浴的Eppendorf离心管中，用手指轻叩离心管底部，小心混匀，在冰浴中保持30min。
(2)将含有转化DNA和感受态细胞的离心管在42℃恒温水浴中热激90sec，其间不要摇动离心管。
(3)快速将离心管置于冰浴中保持5min。
(4)加入800μl LB液体培养基，颠倒混匀，37℃振荡温育1h使细胞繁殖。
(5)将转化的细胞涂布于含有100μg/ml Am+IPTG+X-gel的琼脂平板表面。
(6)将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平板，于37℃培养(不超过16h)。挑选阳性菌落，酶切验证后获得右旋糖酐蔗糖酶工程菌株。
实施例3：基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG右旋糖酐蔗糖酶的表达
将工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG接种到含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中37℃培养，当OD600达到0.6时加入1mmol/L IPTG进行诱导，每1h取样1次，共取样8次，对所取样品做SDS-PAGE电泳分析。其中第3-6h酶量较多，所表达出的右旋糖酐蔗糖酶蛋白分子量与预测值一致(约170kDa)。
实施例4：基因工程菌产酶发酵1
基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG，按照以下条件进行诱导产酶发酵：按3％接种到含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中、转速250r/min、37℃培养，当菌浓OD600达到1.0时，加入1.0mmol/L IPTG并在发酵温度25℃、诱导5h，发酵后的液体在4℃、12000r/min离心15min得菌体后加入pH5.4醋酸缓冲液，超声破碎10min，离心取上清液得粗酶液，酶活达到15～20U/mL。
实施例5：基因工程菌产酶培养2
基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG，按照以下条件进行诱导产酶发酵：按3％接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中、起始pH6.0、转速250r/min、37℃培养，当菌浓OD600达到1.0时，加入0.5mmol/L IPTG并在发酵温度25℃、诱导4～5h，发酵后的液体在4℃、12000r/min离心15min得菌体后加入pH5.4醋酸缓冲液，超声破碎10min，离心取上清液得粗酶液，酶活达到30～35U/mL。
实施例6：转化实验1
应用上述右旋糖酐蔗糖酶粗酶液水解合成右旋糖酐，其步骤为：
1)酶底物反应液配制：0.2M NaAc 860mL，0.2M HAc 140ml，蔗糖100g，pH5.4。不同体积可按此比例配制；
2)按底物反应液∶右旋糖酐蔗糖酶粗酶液＝2∶1的体积比例加酶液；
3)上述混合液在30℃、时间1小时进行催化反应；
4)将催化后的反应液进行过滤、超滤、浓缩、醇沉洗涤，真空干燥称重即得小分子量的右旋糖酐产品，摩尔转化率达到70％。
实施例7：转化实验2
应用基因工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG发酵后所得的右旋糖酐蔗糖酶粗酶液制备右旋糖酐，其步骤为：
1)酶底物反应液配制：0.2M NaAc 860mL，0.2MHAc 140ml，蔗糖200g，pH5.4。不同体积可按此比例配制；
2)按底物反应液∶右旋糖酐蔗糖酶粗酶液＝2∶1.5的体积比例加酶液；
3)上述混合液在35℃、时间5小时进行催化反应；
4)将催化后的反应液进行过滤、超滤、浓缩、醇沉洗涤，真空干燥称重即得大分子量的右旋糖酐产品，摩尔转化率达到85％。
Claims (5)
1.一种表达右旋糖酐蔗糖酶的基因工程菌，其特征在于：由以工业菌株肠膜状明串珠菌LM-0326基因组为模板经克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG插入载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28-dexYG于大肠杆菌BL21(DE3)中转化得到的基因工程菌BL21(DE3)/pET28-dexYG。
2.由权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，包括引物设计、重组表达质粒和宿主菌转化，其特征在于：
(1)所述的引物设计是根据右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG序列和表达载体pET28a(+)的序列特征借助VectorNT9.0软件设计如下含一个BglII位点的正向引物和含一个XhoI位点的反向引物：
正向引物：5’CCGTAGATCTTCATGCCATTTACAGAAAAATG 3’
反向引物：5’CCGCTCGAGCTTATGCTGACACAGCATCC 3’；
(2)所述的重组表达质粒是以右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG为模版，运用PCR扩增技术，得到含有正、反向引物的克隆产物，将该产物用BglII和XhoI双酶切，最后将酶切产物连接到pET28a(+)的双酶切位点上得到重组表达质粒pET28-dexYG；
(3)所述的宿主菌转化就是将重组表达质粒pET28-dexYG转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经卡那霉素抗性筛选和酶切验证后获得右旋糖酐蔗糖酶工程菌BL21(DE3)/pET28-dexYG。
3.由权利要求1所述的基因工程菌制备右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括接种、培养、诱导、破碎和分离，其特征在于：首先将基因工程菌BL21(DE3)/pET28-dexYG接种到含40～60μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于35～40℃培养至菌浓度0D600达到0.6～1.0时加入浓度为0.5～1.0mmol/L IPTG发酵液，25℃发酵诱导4～6小时，离心分离得到菌体，向菌体中加入pH5～6醋酸缓冲液，超声破碎后分离，取其上清液即得粗酶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于将基因工程菌接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中、起始pH6.0、37℃培养，当菌浓OD600达到0.6～1.0时，加入0.5～1.0mmol/L IPTG发酵液并在发酵温度25℃、诱导4～5h，发酵液经离心得菌体，再加入pH5.4醋酸缓冲液，超声破碎取上清液即为粗酶液。
5.由权利要求1所述的基因工程菌的用途：其特征在于：由该基因工程菌发酵培养得到的右旋糖酐蔗糖酶在以蔗糖为底物制备右旋糖酐中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| H. Neubauer et al..Molecular characterization and expression analysis of thedextransucrase DsrD of Leuconostoc mesenteroides Lcc4 inhomologous and heterologous Lactococcus lactis cultures.Microbiology149.2003,149973-982. * |
| 张洪斌等.发酵法生产右旋糖酐的工艺研究.合肥工业大学学报（自然科学版）27 7.2004,27(7),783-787. |
| 张洪斌等.发酵法生产右旋糖酐的工艺研究.合肥工业大学学报(自然科学版)27 7.2004,27(7),783-787. * |
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| CN101363009A (zh) | 2009-02-11 |
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