PL202383B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fruktozylotransferazę, wektor, komórka gospodarza, komórka rośliny, sposób wytwarzania rośliny, roślina, materiał propagacyjny rośliny, nadające się do zbiorów części roślin, żywność dla zwierząt, sposób wytwarzania komórek gospodarza, sposób wytwarzania fruktozylotransferazy, fruktozylotransferaza, sposób wytwarzania polifruktozy, sposób wytwarzania środka powierzchniowo czynnego, zastosowanie komórek gospodarza, zastosowanie fruktozylotransferazy i zastosowanie polifruktozy - Google Patents

Abstract

W wynalazku opisano cz asteczk e kwasu nukleinowego koduj ac a fruktozylotransferaz e, wektor, komórk e gospodarza i komórk e ro sliny. Opisano tak ze sposób wytwarzania ro sliny, ro slin e, materia l propagacyjny ro sliny, nadaj ace si e do zbiorów cz esci ro slin, zywnosc dla zwierz at, sposób wytwarza- nia komórek gospodarza, sposób wytwarzania fruktozylotransferazy, fruktozylotransferaz e, sposób wytwarzania polifruktozy, sposób wytwarzania srodka powierzchniowo czynnego, zastosowanie komó- rek gospodarza, zastosowanie fruktozylotransferazy i zastosowanie polifruktozy. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fruktozylotransferazę, wektor, komórka gospodarza, komórka rośliny, sposób wytwarzania rośliny, roślina, materiał propagacyjny rośliny, nadające się do zbiorów części roślin, żywność dla zwierząt, sposób wytwarzania komórek gospodarza, sposób wytwarzania fruktozylotransferazy, fruktozylotransferaza, sposób wytwarzania polifruktozy, sposób wytwarzania środka powierzchniowo czynnego, zastosowanie komórek gospodarza, zastosowanie fruktozylotransferazy i zastosowanie polifruktozy.

Rozpuszczalne w wodzie polimery liniowe mogą służyć do różnych zastosowań, na przykład do zwiększania lepkości układów wodnych, jak detergenty, czynniki zawiesinowe lub do przyspieszania sedymentacji i kompleksowania lecz także do wiązania wody. Polimery na bazie sacharydów, na przykład polisacharydy fruktozylowe są szczególnie interesujące, jako materiały wyjściowe, ponieważ podlegają one rozkładowi biologicznemu.

Poza ich zastosowaniem, jako surowcowe materiały odnawialne w produkcji przemysłowej i wytwórczej, polimery fruktozylowe są atrakcyjne, jako dodatki do żywności na przykład, jako słodziki. Do różnych zastosowań wymagane są polimery o różnych długościach łańcucha. O ile dla sektora spożywczego preferowane są polimery o łańcuchu średnim lub krótkim, o tyle techniczne zastosowania, na przykład do wytwarzania środków powierzchniowo czynnych wymagają polimerów z wysokim stopniem polimeryzacji (DP).

Opisywane były różne sposoby produkcji polisacharydów fruktanowych w roślinach przez ekspresję fruktozylotransferaz pochodzenia bakteryjnego lub produkcji polifruktoz o średniej długości łańcucha poprzez ekspresję fruktozylotransferaz pochodzenia roślinnego. PCT/US89/02729 opisuje na przykład możliwość generowania węglowodanowych polimerów, zwłaszcza dekstranu lub polifruktozy w roślinach transgenicznych, a szczególnie w owocach roślin transgenicznych. W celu wytworzenia roślin, które są zmodyfikowane na takiej drodze proponuje się zastosowanie lewanu sacharozy z mikroorganizmów zwłaszcza z Aerobacer levanicum, Streptococcus salivarius i Bacillus subtilis lub dekstranu sacharozy z Leuconostoc mesenteroides. Nie opisano do tej pory ani generowania aktywnych enzymów ani wytwarzania lewanu lub dekstranu ani też produkcji roślin transgenicznych.

PCT/EP93/02110 ujawnia sposób wytwarzania transgenicznych roślin posiadających ekspresję genu Isc lewanosacharozy z gram ujemnych bakterii Erwinia amylovora. Rośliny te wytwarzają wielkocząsteczkowy i silnie rozgałęziony lewan.

PCT/NL93/00279 opisuje transformację roślin genami chimerycznymi, które zawierają gen sacB z Bacillus subtilis. Rośliny takie wytwarzają rozgałęziony lewan. Bakteryjne fruktozylotransferazy stosowane w PCT/US89/02729, PCT/EP93/02110 i PCT/NL93/00279 syntetyzują lewan - polimer fruktozylowy z wiązaniami β-2, 6, który ma liczne rozgałęzienia β-2,1. Jednakże, ponieważ lewan posiada wielokrotne rozgałęzienia, posiada on zdecydowanie niekorzystne cechy co dla technicznego jego wytwarzania i dlatego jest dużo mniej pożądany jako techniczny materiał początkowy niż inulina, która posiada wiązania β-2,1. Obecnie, tylko jeden gen bakteryjny jest znany jako gen, którego wytwór jest związany z syntezą inuliny, wspomnianym genem jest gen ftf z Streptococcus mutans. PCT/NL93/00279 opisuje transformację roślin wspomnianym genem, który syntetyzuje wielkocząsteczkową inulinę lecz w tak małych ilościach, że nie mogą one być ekonomicznie wykorzystane. Również PCT/EP97/02195 opisuje sposób wytwarzania transgenicznych, wytwarzających inulinę roślin z genem ftf z Streptococcus mutans. Podobnie jak rośliny opisane w PCT/NL93/00279 wydajność wielkocząsteczkowej inuliny jest niska. O ile ekspresja genu jest możliwa to w ogóle możliwa w roślinach, jeżeli gen ten był genetycznie wcześniej przetworzony, to wydajność inuliny jaką może uzyskać z transgenicznych roślin jest tak niska, że transgeniczne rośliny nie mogą być ekonomicznie wykorzystane.

Ponadto PCT/NL96/00012 ujawnia sekwencje DNA, które kodują enzymy syntetyzujące polimer węglowodanowy, jak również wytwarzanie transgenicznych roślin przy zastosowaniu wspomnianych sekwencji DNA. Ujawnione sekwencje pochodzą z Helianthus tuberosus. Zgodnie z PCT/NL96/00012 ujawnione sekwencje mogą być stosowane do modyfikowania profilu fruktanowego petunii i ziemniaka lecz także do samego Helianthus tuberosus. Ekspresja ujawnionych sekwencji, które kodują zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy (SST) lub transferazę fruktan fruktozyl w roślinach transgenicznych pozwala na produkcje inuliny. Jednak średni stopień polimeryzacji inuliny jest od DP=6 do DP=10. Z takim stopniem polimeryzacji inulina nie może być uważana za długołańcuchową. Sposób opisywany w PCT/NL96/00012 nie pozwala na produkcję inuliny o wysokim ciężarze cząsteczkowym.

PL 202 383 B1

Ostatnio, Rehm i wsp. (J. Bacteriology 180 (1998), 1305-1310) opisali wytwarzanie oligosacharydów w drożdżach przez wprowadzenie SST z Aspergillus foetidus. Jednakże stopień polimeryzacji produktu otrzymanego był jedynie DP=3.

DE 19708774.4 dotyczy wytwarzania 1-kestozy i nystozy stosując enzymy posiadające aktywność polimerazy fruktozylu. Tri- i tetra- sacharydy mogą być wytwarzane w roślinach transgenicznych. Wydajność jest wysoka i w ziemniakach odpowiada komórkowej zawartości sacharozy. Jednakże produkcja długołańcuchowej inuliny nie jest opisywana. Synteza polifruktoz przez grzyby jest również dyskutowana w wielu publikacjach. Barthomeuf i Pourrat (Biotechnology Letters 17 (1995), 911-916), opisują na przykład preparat enzymatyczny Penicillium rugulosum, który posiada aktywność fruktozylotransferazy. Preparat ten przejawia różne właściwości enzymatyczne i dlatego nie reprezentuje czystej fruktozylotransferazy. Sekwencje DNA genu fruktozylotransferazy nie są znane. Cairns i wsp. (New Phytologist 129 (1995), 299-308) opisują przejściową syntezę tri-, tetra- i penta- sacharydów z sacharozy w poż ywce hodowlanej Monographella nivalis. Podkre ś lana enzymatyczna aktywno ść okazuje się być w głównej mierze natury hydrolitycznej, ponieważ polifruktozy są ponownie degradowane przez ten enzym wraz ze wzrostem wyczerpywania się substratu. Ponieważ nieznana jest sekwencja DNA nie można ocenić - w oparciu o homologię z fruktofuranozydazami (inwertazami) jak się cytuje - czy obecna jest fruktozylotransferaza we właściwym tego słowa znaczeniu czy też inwertaza.

Wykazano dla grzybów Aspergillus sydowi IAM 2544, że zdolne są one do generowania polifruktoz typu inuliny. Harada i wsp. (w: Nishinari i Doi (Eds.), Food Hydrocolloids: Structures, Properties and Fructions, Plenum, New York (1994), 77-82) opisują na przykład syntezę inuliny przez konidia Aspergillus sydowi. 125 g konidii inkubowano w 25 l 20% roztworu sacharozy. Generowany produkt był oczyszczony na HPLC. Jednakże, taki proces sam nie prowadzi do produkcji inuliny na dużą skalę. Maramatsu i wsp. (Agric. Biol. Chem. 52 (1988), 1303-1304) opisują wytwarzanie fruktooligosacharydów przez grzybnię tego samego szczepu grzyba (A. sydowi IAM 2544). Opisany stopień polimeryzacji wynosi od 3 do 13. Enzymy zaangażowane w tym procesie nie były w ogóle, lub tylko były tylko częściowo oczyszczone. Sekwencje aminokwasowe lub sekwencje DNA odpowiadających genów nie są znane. Instrukcje oczyszczania białek nie są podane lub są niepełne.

Zagadnieniem, które rozwiązuje niniejszy wynalazek jest dlatego dostarczenie cząsteczek kwasu nukleinowego i sposobów pozwalających na wytworzenie genetycznie zmienionych organizmów, które zdolne są do generowania polifruktozy typu inuliny.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fruktozylotransferazę wybrana z grupy obejmującej:

(a) cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białko zawierające sekwencję aminokwasową wskazaną na SEQ ID nr 2;

(b) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencję nukleotydową regionu kodującego wskazaną na SEQ ID nr 1 lub odpowiadającą sekwencję rybonukleotydową;

(c) cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z nicią komplementarną do cząsteczek kwasu nukleinowego wspomnianych w (a) lub (b); i (d) cząsteczki kwasu nukleinowego sekwencji, nukleotydowej, której odchylenia od sekwencji cząsteczki kwasu nukleinowego wspomnianej w (c) związane są z degeneracją kodu genetycznego; jak również cząsteczki kwasu nukleinowego komplementarne do nich. Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego jest cząsteczką DNA lub RNA. Bardziej korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd grzybowy. Grzybem korzystnie może być grzyb z rodzaju Aspergillus.

Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego, specyficznie hybrydyzuje z cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku lub z komplementarną do niej nicią, przy czym hybrydyzacja ma miejsce w następujących warunkach: hybrydyzacja w 50% formamidzie, 5xSSC, 5x roztwór Denhardt'a, 40 mM fosforan sodowy pH 6,8, 0,5% (w/v) BSA, 1% (w/v) SDS, 0,1 mg/ml DNA spermy śledzia w temperaturze hybrydyzacji 42°C i nastę pnie przemywanie 0,5xSSC/0,5% w 60°C.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fruktozylotransferazę, jak zdefiniowano powyżej. W wektorze według wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z elementami regulatorowymi, które zapewniają transkrypcję i syntezę ulegającego translacji RNA w komórkach pro- i/lub eukariotycznych. Bardziej korzystnie, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera region, który koduje sekwencję sygnałową, która zmienia lokalizację wewnątrz- lub pozakomórkową fruktozylotransferazy.

PL 202 383 B1

Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza zawierająca cząsteczkę kwasu nukleinowego kodująca fruktozylotransferazę jak zdefiniowano powyżej lub wektor jak zdefiniowano powyżej, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest heterologiczna w stosunku do komórki gospodarza.

Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku jest komórką bakterii lub komórką grzyba.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka rośliny, która zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fruktozylotransferazę lub wektor jak zdefiniowano powyżej, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest heterologiczna w stosunku do komórki rośliny.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania rośliny, polegający na tym, że (a) modyfikuje się genetycznie komórkę rośliny przez wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku lub wektora wektor według wynalazku przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest heterologiczna w stosunku do komórki, i (b) regeneruje się roślinę z komórki; i ewentualnie (c) generuje się następne rośliny z komórki według regenerowanej zgodnie z etapem (b).

Przedmiotem wynalazku jest także roślina zawierająca komórki roślinne według wynalazku. Korzystnie roślina ta jest rośliną użytkową.

Przedmiotem wynalazku jest także materiał propagacyjny rośliny według wynalazku, który zawiera komórki roślinne według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są nadające się do zbiorów części roślin według wynalazku, przy czym część rośliny zawiera komórki roślinne zawierające cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku lub wektor według wynalazku.

Następnym przedmiotem wynalazku jest żywność dla zwierząt i/lub ludzi zawierająca nadające się do zbiorów części roślin jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania komórek gospodarza zawierających cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fruktozylotransferazę jak zdefiniowano powyżej polegający na tym, że odpowiednie komórki transformuje się cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku lub wektorem według wynalazku.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania fruktozylotransferazy, polegający na tym, że komórkę gospodarza lub komórkę roślinną, które zdefiniowano powyżej, hoduje się w warunkach pozwalających na syntezę fruktozylotransferazy i izoluje się fruktozylotransferazę z hodowanych komórek i/lub pożywki hodowlanej.

Przedmiotem wynalazku jest również fruktozylotransferaza kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku dająca się otrzymać sposobem jak zdefiniowano powyżej.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polifruktozy zwłaszcza polifruktozy typu inuliny, polegający na tym, że (a) hoduje się komórkę gospodarza jak zdefiniowano powyżej lub gospodarza zawierającego taką komórkę w warunkach pozwalających na wytwarzanie fruktozylotransferazy i przekształca się ewentualnie dodaną sacharozę lub równoważnik substratowy w polifruktozę; i (b) otrzymuje się polifruktozę wytwarzaną w ten sposób z hodowanych komórek, z gospodarza lub z pożywki.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania polifruktozy zwłaszcza polifruktozy typu inuliny, polegający na tym, że (a) kontaktuje się sacharozę lub równoważnik substratowy, z fruktozylotransferazą jak zdefiniowano powyżej, w warunkach pozwalających na przekształcenie w polifruktozę; i (b) otrzymuje się polifruktozę wytwarzaną w ten sposób.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polifruktozy zwłaszcza polifruktozy typu inuliny, polegający na tym, że obejmuje etap ekstrakcji polifruktozy z komórki roślinnej zawierającej cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku lub wektor według wynalazku z rośliny jak zdefiniowano powyżej, lub z części takich roślin.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania środka powierzchniowo czynnego, który obejmuje etapy (a) i (b) sposobów wytwarzania polifruktozy oraz sposobu wytwarzania polifruktozy typu inuliny lub etap ekstrakcji sposobu wytwarzania polifruktozy typu inuliny.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie komórek gospodarza według wynalazku lub komórek rośliny według wynalazku jako dodatków do żywności.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie fruktozylotransferazy według wynalazku do wytwarzania polifruktozy zwłaszcza polifruktozy typu inuliny.

PL 202 383 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polifruktozy otrzymywanej sposobami według wynalazku do wytwarzania środków powierzchniowo czynnych do podwyższania lepkości układów wodnych, jako detergent, jak czynnik zawiesinowy, do przyspieszenia sedymentacji i kompleksowania lub do wiązania wody.

Sekwencje przedstawione w SEQ ID nr 1 kodują zależny od sacharozy enzym fruktozylotransferazę fruktanu z Aspergillus sydowi, który prowadzi w komórkach roślinnych do syntezy długołańcuchowego polifruktanu typu inuliny. Nieoczekiwanie stwierdzono, że przy zastosowaniu wspomnianych sekwencji można wyprodukować długołańcuchowe polifruktany typu inuliny z dużą wydajnością w organizmach gospodarza, zwł aszcza w roś linach transgenicznych, bakteriach lub grzybach.

W niniejszym wynalazku opracowano metodę oczyszczania tego enzymu z Aspergillus sydowi. Enzym był oczyszczony aż osiągnięcia jego homogeniczności, tak aby można było wykryć sekwencję aminokwasową. Na podstawie otrzymanej informacji o sekwencji wykryto primery dla polimerazowej reakcji łańcuchowej. Fragmenty genowe były amplifikowane za pomocą tych primerów, które były stosowane do przesiewowego badania bibliotek cDNA. Poszczególne cząsteczki cDNA z homologią sekwencji do produktów PCR były preparowane i porównywane. Większość otrzymanych cząsteczek miało inserty tego samego rozmiaru. Kompletność cząsteczek cDNA była potwierdzona podczas funkcjonalnej ekspresji sekwencji DNA w Saccharomyces lub w ziemniakach.

Oczyszczanie enzymów, zaprojektowanie starterów dla PCR, identyfikacja cząsteczek cDNA i ekspresja heterologiczna opisano w przykładach. Izolowana sekwencja DNA i jej pochodne sekwencje białkowe są przedstawione odpowiednio na SEQ ID nr 1 i 2. Sekwencja DNA według wynalazku jest pierwszą, która koduje grzybową fruktozylotransferazę fruktanu zależną od sacharozy. Sekwencja DNA i sekwencja białka przez nią kodowana znacznie różni się od znanych już sekwencji DNA kodujących fruktozylotransferazy. Na przykład istnieje tylko 22,6% i 39% identyczności z fruktozylotransferazą z Aspergillus naeslundii lev j w poziomie białka i DNA. Podczas gdy istnieje tam 64 i 60,6 identyczność względem poziomu białka i DNA w porównaniu z inwertaza genu z Aspergillus niger to białko kodowane przez wspomniany gen ma całkowicie różną enzymatyczną aktywność. Pokazuje to, że cząsteczki kwasu nukleinowego i kodowane przez nie fruktozylotransferazy są cząsteczkami, które nie były dotąd opisane.

W kontekś cie niniejszego wynalazku fruktozylotransferaza jest rozumiana jako biał ko, które jest zdolne do katalizowania wiązania e-2,1-glikozydowego i/lub e-2,6-glikozydowego pomiędzy jednostkami fruktozy. Reszta fruktozylowa, która jest przenoszona pochodzi z sacharozy.

Reakcję katalizowaną przez zależną od sacharozy fruktozylotransferazę fruktanu według wynalazku można opisać następującym wzorem:

N (G - F) G - Fn + (n-1) G

Na tym schemacie G = glukoza, F = fruktoza i G-F = sacharoza. Oznacza to, że enzym przenosi reszty fruktozowe z sacharozy na polifruktan, który jest tworzony zaczynając od cząsteczki sacharozy przez wiązanie β-2,1 glikozydowe, przy czym może także występować wiązanie β-2,6 glikozydowe.

Polipeptyd z aktywnością fruktozylotransferazy kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku prowadzi do syntezy polifruktozy, a zwłaszcza w komórkach roślinnych prowadzi do syntezy polifruktozy typu inuliny (tutaj również opisywanej jako inulina).

W kontekście niniejszego wynalazku polifruktoza jest rozumiana jako polifruktan, że stopniem polimeryzacji DP > 4, korzystnie DP > 6 i szczególnie DP > 8. „Polifruktoza typu inuliny” lub „inulina” odnosi się do długołańcuchowego polimeru fruktanu, cząsteczki którego są połączone głównie wiązaniami e-2,1-glikozydowymi i ewentualnie posiadają także rozgałęzienia β-2,6. Określenie „długołańcuchowy” oznacza, że stopień polimeryzacji (DP) jest większy niż 20, korzystnie większy niż 50, bardziej korzystnie większy niż 100 i najbardziej korzystnie większy niż 200. Polimer fruktozylowy może nieść końcowe reszty glukozy, które są połączone poprzez grupę C-1 OH glukozy i grupę C-2 OH reszty fruktozy. W tym przypadku jedna cząsteczka sacharozy jest zawarta w polimerze fruktozylu.

Jeżeli do syntezy polifruktanu in vitro stosowany jest enzym, to otrzymywany jest produkt oligomerowy (DP = 4 do 10).

Enzym kodowany przez cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku może być zwłaszcza odróżniony od znanych fruktozylotransferaz dzięki reakcji katalizy. Na przykład, znana roślinna SSTs katalizuje reakcję:

G - F + G - F G - F - F + G.

Natomiast zależna od fruktanu fruktozylotransferaza fruktanu z roślin katalizuje następującą reakcję:

PL 202 383 B1

G - Fn + G - Fm G - Fn+1 + G - Fm+1, która to reakcja jest całkowicie odwracalna.

Bakteryjne fruktozylotransferazy, np. kodowane przez gen sacB z Bacillus subtilis, katalizuje także reakcję typu nG - F G - Fn + (n-1) G.

Jednakże enzymy te wytwarzają lewan, to znaczy polifruktan połączony e-2,6-glikozydowo z rozgałęzieniami β-2,1.

Chociaż białko (FTF) kodowane przez gen ftf z Streptococcus mutans indukuje syntezę inuliny o ciężarze cząsteczkowym wielu milionów Daltonów to jednak gen ftf lub białko kodowane nie wykazuje znaczącej homologii do sekwencji kwasu nukleinowego opisanej na SEQ ID nr 1 (tylko 37,3%) lub sekwencji aminokwasowej opisanej na SEQ ID nr 2 (tylko 22,6%).

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „hybrydyzacja” oznacza hybrydyzację w konwencjonalnych warunkach hybrydyzacji, korzystnie w ścisłych warunkach hybrydyzacji, takich jak opisano w Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Wydanie 2 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Przykładem ścisłych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 50% formamidzie 5 x SSC, 5 x roztwór Denhardt'a, 40 mM fosforanie sodu pH 6,8; 0,5% BSA (wag./obj.), 1% SDS (wag./obj.), 0,1 mg/ml DNA spermy śledziowej w temperaturze hybrydyzacji 42°C i następnie przemywano na filtrach w 0,5 x SSC/0,5% SDS w 60°C.

Przykładem konwencjonalnych nie-ścisłych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w warunkach wspomnianych powyżej z tą różnicą, że 30% formamid jest stosowany zamiast 50% i filtry są następnie przemywane w 2xSSC/0,5% SDS w 56°C. Cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z cząsteczkami według wynalazku mogą być izolowane z bibliotek, na przykład genomowej lub cDNA, które są korzystnie preparowane z grzybów. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego mogą by identyfikowane i izolowane stosując cząsteczki według wynalazku lub fragmenty tych cząsteczek lub odwrotne komplementy tych cząsteczek, na przykład przez hybrydyzację według standardowej metody (patrz, na przykład Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Wydanie 2 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być stosowane jako sonda hybrydyzacyjna, która wykazuje dokładnie lub zasadniczo taką samą sekwencję nukleotydową opisaną na SEQ ID nr 1 lub fragmenty tej sekwencji. Fragmenty stosowane jako sonda hybrydyzacyjna mogą także być fragmentami hybrydyzacyjnymi, które były wytwarzane stosując techniki konwencjonalne syntezy oraz także taką sekwencją, która jest zasadniczo identyczna z sekwencją cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku.

Cząsteczki hybrydyzujące z cząsteczkami kwasu nukleinowego według wynalazku zawierają także fragmenty, pochodne i warianty alleliczne opisanych powyżej, cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białko według wynalazku. „Fragmenty” są rozumiane jako części cząsteczek kwasu nukleinowego, które są wystarczająco długie do kodowania białka z aktywnością fruktozylotransferazy. Określenie „pochodna” tak jak stosuje się w niniejszym wynalazku oznacza, że sekwencje tych cząsteczek różnią się od sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego opisanych powyżej w jednej lub wielu pozycjach ale przejawiają wysoki stopień holologii do tych sekwencji. Homologia oznacza identyczność sekwencji w co najmniej 40%, zwłaszcza identyczność w co najmniej 60%, korzystnie więcej niż w 80%, i jeszcze bardziej korzystnie w więcej niż w 90%, i najkorzystniej w co najmniej w 95%. Odchylenia od opisanych powyżej cząsteczek kwasu nukleinowego mogą być wynikiem na przykład delecji, podstawienia, insercji i/lub rekombinacji. Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być innymi pochodnymi sekwencji o pochodzeniu grzybowym. Derywatyzacja sekwencji może być wymagana jako ułatwienie ekspresji w pewnych komórkach gospodarzy.

Cząsteczki kwasu nukleinowego, które są homologiczne do cząsteczek opisanych powyżej i reprezentują pochodne wspomnianych cząsteczek są regularnymi odmianami tych cząsteczek, które reprezentują modyfikacje wpływające na tą samą funkcję biologiczną. Odmiany te mogą być na przykład albo naturalnie występującymi sekwencjami z innych szczepów lub organizmów lub mutacjami. Mutacje te mogą zajść naturalnie lub mogą być wprowadzone specyficzną mutagenezą. Odmiany te mogą być także syntetycznie wytwarzanymi sekwencjami. Alleliczne warianty mogą być albo naturalnie występującymi wariantami lub syntetycznie wytwarzanymi lub generowanymi przez rekombinacyjne techniki DNA.

Białka kodowane przez różne odmiany cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku korzystnie mają pewną wspólną charakterystykę taką jak enzymatyczna aktywność, ciężar cząsteczkoPL 202 383 B1 wy, reaktywność immunologiczna lub konformacja lub właściwości fizyczne takie jak ruchliwość elektroforetyczna w elektroforezie żelowej, zachowanie się w chromatografii, współczynnik sedymentacji, rozpuszczalność, właściwości spektroskopowe, trwałość, optimum pH lub optimum temperatury.

W korzystnym wykonaniu cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku kodują polipeptyd posiadający właściwości grzybowej fruktozylotransferazy, szczególnie korzystnie z Aspergillus i najbardziej korzystnie fruktozylotransferazy z Aspergillus sydowi.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być cząsteczkami albo DNA albo RNA. Przykładami odpowiednich cząsteczek DNA są cząsteczki genomowego DNA lub cDNA. Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być izolowane że źródeł naturalnych, na przykład grzybów, zwłaszcza Aspergillus a korzystnie z Aspergillus sydowi, lub mogą być one syntetyzowane zgodnie ze znanymi metodami.

Możliwym jest także wprowadzenie różnych mutacji do cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku na drodze technik konwencjonalnych biologii molekularnej (patrz, na przykład, Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Wydanie 2 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Takie wprowadzenie indukuje syntezę białek z potencjalnie zmodyfikowanymi właściwościami biologicznymi. Jednym podejściem jest generowanie mutantów delecyjnych, w których cząsteczki kwasu nukleinowego generowane są przez stopniową delecję przy końcu 5' lub końcu 3' kodującej sekwencji DNA, co prowadzi do syntezy odpowiednio skróconych białek. Innym podejściem jest produkcja określonych enzymów, które są zlokalizowane w różnych przedziałach w związku z dodatkowymi sekwencjami sygnałowymi. W celu osiągnięcia lokalizacji białek według wynalazku w cytozolu do sekwencji wskazanej w SEQ ID nr 2 nie dodaje się sekwencji sygnałowych.

Z drugiej strony, miejsca mutacji mogą takż e być wprowadzone w tych pozycjach, gdzie modyfikacja sekwencji aminokwasowej zmienia, na przykład aktywność enzymatyczną lub kontrolę enzymu. W ten sposób mogą być wytwarzane na przykł ad mutanty ze zmodyfikowaną wartoś cią Kn, lub mutanty, które nie są dłużej przedmiotem mechanizmów kontrolnych przez regulację allosteryczną lub modyfikację kowalencyjną jakie zwykle występują w komórkach.

Ponadto, mogą być wytwarzane mutanty ze zmodyfikowaną specyficznością w stosunku do substratu lub produktu. Co więcej, mogą być wytwarzane mutanty ze zmodyfikowanym profilem aktywności temperaturowej.

W celu genetycznej manipulacji w komórkach priokariotycznych czą steczki kwasu nukleinowego według wynalazku lub fragmenty tych cząsteczek mogą być wbudowywane do plazmidów co pozwala na mutagenezę lub na modyfikację sekwencji przez rekombinację sekwencji DNA. Za pomocą standardowych technik (cf. Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Wydanie 2 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) może być przeprowadzona wymiana zasad lub mogą być dodane naturalne lub syntetyczne sekwencje. W celu powiązania fragmentów DNA mogą być do nich przyłączone adaptery lub linkery. Ponadto można wykorzystać manipulacje, które oferują odpowiednie miejsca restrykcji lub które usuwają zbędne DNA lub miejsca restrykcji. Gdziekolwiek dokonany jest insert, delecja lub podstawienie, można stosować mutagenezę in vitro, „primer repair”, restrykcję lub ligację. Do badania stosowana jest głównie analiza sekwencji, analiza restrykcji lub inne biochemiczno molekularne metody.

Wynalazek ponadto dotyczy wektorów, które zawierają cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku. Korzystnie wektorami tymi są plazmidy, kosmidy, wirusy, bakterofagi i inne powszechne w inż ynierii genetycznej wektory.

Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest operacyjnie związana w wektorze według wynalazku z elementami regulatorowymi, które pozwalają na transkrypcję i syntezę dającego się odczytać RNA w pro- i/lub eukariotycznych komórkach. Na przykład wektor według wynalazku zawiera następujące elementy:

1. Promotor zapewniający transkrypcję poniżej regionów kodujących w komórkach organizmu gospodarza i ewentualnie elementy wzmacniające.

2. Region kodujący połączony przez fuzję z promotorem, który zawiera co najmniej jedną otwartą ramkę odczytu dla translacji polipeptydu. W niniejszym wynalazku regionem kodującym jest cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku.

3. Ponadto, dodatkowe sekwencje przyłączone przez fuzję do regionu kodującego, na przykład sygnały zakończenia transkrypcji, jeżeli takie są potrzebne do pomyślnej ekspresji genu w pewnych organizmach gospodarza, lub sekwencje sygnałowe zmieniające subkomórkową lokalizację produktu genowego lub indukujące sekrecję tego białka.

PL 202 383 B1

Wektory takie mogą zawierać dodatkowe geny takie jak geny markerowe pozwalające na wyodrębnienie tego wektora w odpowiedniej komórce gospodarza i w odpowiednich warunkach. Ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje transkrypcje cząsteczki kwasu nukleinowego do nadającego się do transkrypcji mRNA. Elementy regulatorowe pozwalające na ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych są znane fachowcom w tej dziedzinie. Możliwe elementy regulatorowe, które są właściwe dla ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku w komórce gospodarza prokariotycznego obejmują na przykład promotor PL lac, trp lub tac w E.coli. Szczególnie korzystnie stosuje się promotor lacZ, który można indukować w IPTG E.coli. Przykładami elementów regulatorowych pozwalających na ekspresję w komórkach gospodarza eukariotycznego są promotory drożdżowe AOX1 i promotory GAL1 lub CMV, SV40, RSV, wzmacniacz CMV, wzmacniacz SV40 lub intron globinowy w komórkach ssaczych lub innych komórkach zwierzęcych. Na przykład do ekspresji w drożdżach stosowany jest korzystnie promotor genu dehydrogenazy alkoholowej z Saccharomyces cerevisiae, który jest wysoce aktywny w drożdż ach. Dalsze odpowiednie układy wektorowe opisano w stanie techniki, na przykł ad w Sambrook (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. i w Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology (1988) Green Publishing Associates i Wiley Intresience, N.Y.

Elementami regulatorowymi do ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku w komórkach roślinnych są zasadniczo każdy dowolny promotor, wzmacniacz, terminator itp., które jest aktywny w komórkach roślinnych. Promotor może być wybrany w taki sposób, że ekspresja zachodzi konstytutywnie lub w pewnych tkankach, w pewnym okresie czasu rozwoju rośliny lub w punkcie czasowym wyznaczonym czynnikami zewnętrznymi. W odniesieniu do roślin promotor może być homologiczny lub heterologiczny.

Odpowiednimi promotorami do ekspresji konstytutywnej są na przykład promotory 35S RNA z Cauliflower Mosaic Virus (patrz, na przykł ad, US 5,352,605) i promotor ubiquityny (patrz, na przykład, US 5,614,399) do ekspresji konstytutywnej, promotor genu patatyny B33 (Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29) dla specyficznej dla bulw ekspresji w ziemniakach lub promotor, który zapewnia ekspresję tylko w aktywnych fotosyntetycznie tkankach, na przykład promotor ST-LS1 (Stockhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), promotor Ca/b (patrz, na przyk3ad, US 5,656,496, US 5,639,952, Bansal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3654-3658) i promotor Rubisco SSU (patrz, na przykład, US 5,034,322, US 4,962,028). Jakkolwiek, mogą być też stosowane promotory, które są aktywowane tylko w pewnym okresie czasu określonym warunkami zewnętrznymi (patrz, na przykład, WO 93/07279). Promotory białek szoku termicznego pozwalające na prostą indukcję, mogą być szczególnie interesujące. Także specyficzne dla nasion promotory takie jak promotor USP z Vicia faba, mogą być stosowane co pozwala na specyficzną dla nasion ekspresję w Vicia faba i innych roślinach (Fiedler, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baumlein, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). Ponadto promotory specyficzne dla owoców mogą być stosowane, jak opisano w WO 91/01373. Do ekspresji w dojrzewających owocach pomidora, są odpowiednie, na przykład elementy regulatorowe cis promotora poligalakturonazy pomidora, które są aktywne w zewnętrznej i wewnętrznej owocni (Nicholass i wsp., Plant Mol. Biol. 28 (1995), 423-435; Montgomery i wsp., Plant Cell 5 (1993), 1049-1062). Inny promotor specyficzny dla owoców, opisywany został dla pomidora przez Van Haaren'a i wsp. (Plant Mol. Biol. 21 (1993), 625-640).

Ponadto, mogą być stosowane promotory specyficznej dla bielma ekspresji, takie jak promotor gluteinowy (Leisy, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng, Plant J. 4 (1993), 357-366), promotor HMG pszenicy, promotor USP, promotor faseoliny lub promotory genów zeiny kukurydzy (Pedersen, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93) lub kurczliwy promotor 1 (sh-1) kukurydzy (Werr, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380).

Ekspresja cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku jest szczególnie korzystna w tych częściach rośliny, które mają podwyższoną zawartość sacharozy lub które magazynują sacharozę. Takimi organami są na przykład korzenie buraka cukrowego lub łodygi trzciny cukrowej lub słodkiego sorgo. Szczególnie korzystne są zatem promotory, pośredniczące w ekspresji w tych organach, takie jak promotor patatyny B33 w Solanum tuberosum. W celu uzyskania specyficznej ekspresji w łodydze trzciny cukrowej może być stosowany promotor ubiquityny w połączeniu z pierwszym intronem.

Wektory według wynalazku mogą także posiadać dodatkowe jednostki funkcjonalne, które wpływają na stabilizację wektora w organizmie gospodarza, takie jak bakteryjne replikacyjne miejsce ori lub 2-mikron-DNA dla stabilizacji i replikacji autonomicznej w drożdżach. Mogą również zawierać

PL 202 383 B1 „lewy brzeg” i „prawy brzeg” sekwencji agrobakteryjnego T-DNA, co pozwala na trwałą integrację genomu roślinnego.

Mogą być również obecne sekwencje terminacji, które dostarczają prawidłowego zakończenia transkrypcji lub dodają koniec poli-A do transkryptu, o którym wiadomo, że posiada funkcje stabilizacji tych transkryptów. Takie elementy opisane są w literaturze (porównaj, na przykład, Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23-29) i są łatwo wymienialne.

W korzystnej postaci cząsteczka kwasu nukleinowego zawarta w wektorze według wynalazku obejmuje region, który zawiera funkcjonalną sekwencję sygnałową dla wydzielenia kodowanego enzymu. Sekwencje takie są znane.

Przykładem peptydu sygnałowego pozwalającego na lokalizację tego białka w wodniczce jest peptyd sygnałowy karboksypeptydazy Y z drożdży (CPY). Opisany był odpowiedni gen, w na przykład Valls i wsp. (Cell 48, 887-899). Roślinnymi sekwencjami sygnałowymi są na przykład geny lektyny z jęczmienia (Raikhel i Lerner, Dev. Genet. 12 (1991), 255-269) lub 43 aminokwasy z regionu N-końcowego dojrzałej fitohemaaglutyniny fasoli (Tague i wsp., Plant Cell 2 (1990), 533-546). Przykładem C-końcowego peptydu sygnałowego jest chitynaza (Neuhaus i wsp., Plant. J. 5 (1994), 45-54).

Korzystną sekwencją sygnałową jest na przykład sekwencja sygnałowa genu inhibitora proteinazy II z ziemniaka. Można jednakże stosować inną dowolną sekwencję sygnałową prowadzącą do sekrecji polipeptydu w wybranym gospodarzu. Wydzielona fruktozylotransferazą może być otrzymywana z pożywki hodowlanej i zastosowana do syntezy in vitro.

W szczególnie korzystnej postaci wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego zawarta w wektorze obejmuje region, który koduje sekwencję sygnałową do lokalizacji w wodniczce komórki roślinnej, korzystnie taką jak gen patatyny z ziemniaka (Sonnewald, Plant. J. 1 (1998), 95-106). Pozwala to na subkomórkową lokalizację fruktozylotransferazy w wodniczce genetycznie zmienionych komórek roślinnych i w roślinach, takich jak na przykład burak cukrowy lub ziemniak i nagromadzenie w wodniczkach wielocząsteczkowych polifruktoz typy inuliny. Inne sekwencje sygnałowe zlokalizowane w wodniczce opisane były przez na przykład przez Matusoaka (Journal of Experimental Botany 50 (1999), 165-174), Chrispeels (Cell 68 (1992), 613-616), Matsuoka (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 834-838), Bednarek (Plant Cell 3 (1991), 1195-1206), Nakamura (Plant Phys. 101 (1993), 1-5).

W innej postaci wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego zawarta w wektorze obejmuje region, który koduje sekwencję sygnałową plastydowej lokalizacji w komórkach roślinnych.

Jako sekwencja sygnałowa, może być stosowana na przykład sekwencja sygnałowa ferrodoksyny: NADP(+)-oksydoreduktaza (FNR) szpinaku. Sekwencja ta zawiera 5' nietranslacyjne regiony jak również sekwencję flankującą cDNA peptydu przejściowego białka plastydowego ferodoksyna:NADP(+)-oksydoreduktaza (FNR) szpinaku (nukleotyd - 171 do + 165; Jansen, Current Genetics 13 (1988), 517-522).

Jako sekwencja sygnałowa może być także stosowany peptyd przejścia białka wosku kukurydzy plus pierwsze 34 aminokwasy dojrzałego białka wosku (Klosgen, Mol. Gen. Genet. 217 (1989), 155-161). W korzystnej postaci wynalazku peptyd przejścia białka wosku kukurydzy stosowany jest bez tych pierwszych 34 aminokwasów dojrzałego białka wosku.

W szczególnie korzystnej postaci wynalazku, wynalazek dotyczy plazmidów pSK-as1, p112-as1, pA7-as1, p35-as1, p35-s3-as1, konstrukcja których jest opisana w przykładach (Fig. 1 do 5).

Cząsteczki kwasu nukleinowego i wektory ekspresji według wynalazku pozwalają na produkcje polifruktoz typu inuliny w różnych organizmach gospodarzy zwłaszcza w roślinach, grzybach i bakteriach. Te kodowane enzymy mogą być także stosowane poza organizmami gospodarzy do wytwarzania polifruktoz typu inuliny. To znaczy, możliwe jest zastosowanie cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku do wytwarzania kodowanych przez nie białek w dowolnych komórkach gospodarza w celu otrzymania białka z komórki gospodarza i/lub pożywki hodowlanej i do stosowania ich dla syntezy inuliny in vitro.

Na przykład konstrukt, który zawiera promotor dehydrogenazy alkoholowej i cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku może być stosowany do transformacji Saccharomyces cerevisiae. Ponieważ drożdże nie są zdolne do pobierania sacharozy powinny być stosowane komórki, które posiadają ekspresję nośnika sacharozy będącego wynikiem wprowadzonej heterologicznej sekwencji DNA. Wytwarzanie takich komórek opisane było na przykład w Riesmeier i wsp. (EMBO J. 11 (1992), 4705-4713). Drożdże transformowane powyżej opisanym konstruktem tworzą polifruktozy długołańcuchowe typu inuliny. Ponieważ fruktozylotransferaza z Aspergillus sydowi nie posiada peptydu sygnałowego, dlatego nie są one wydzielane. Dlatego polifruktozy długołańcuchowe są generowane w ko10

PL 202 383 B1 mórkach drożdżowych. Komórki drożdżowe zawierające te polifruktozy mogą być używane bezpośrednio jako dodatki do żywności. Jeżeli polifruktozy te mają być otrzymane na drodze fermentacyjnej w poż ywce hodowlanej, dla uzyskania sekrecji, sekwencja sygnał owa moż e być połączona przez fuzję z cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku. W kolejnej postaci, wynalazek dotyczy komórek gospodarza, które przejściowo lub trwale zawierają cząsteczki kwasu nukleinowego lub wektory według wynalazku lub które pochodzą z takich komórek. Określenie „komórka gospodarza” dotyczy organizmu, który jest zdolny do pobierania in vitro rekombinowanego DNA i ewentualnie do syntetyzowania białek kodowanych przez cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku. Komórki gospodarza mogą być pochodzenia prokariotycznego albo eukariotycznego. Określenie „prokariotyczny” obejmuje wszystkie bakterie, które mogą być transformowane lub transfekowane cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku i takie, które korzystnie pozwalają na ekspresję białek posiadających aktywność fruktozylotransferazy. Priokariotyczne komórki gospodarza obejmują na przykład zarówno bakterie gram ujemne jak i gram dodatnie, takie jak E.coli, S. typhimurium, Serratia marcescens i Bacillus subtilis. Określenie „eukariotyczne” obejmuje komórki owadzie, komórki grzybowe, komórki roślinne, komórki zwierzęce i ludzkie. Korzystnymi komórkami grzybowymi są na przykład te, które fermentują lub mogą być stosowane do fermentacji, zwłaszcza Saccharomyces, zwłaszcza korzystnie S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia itd. Korzystnie, taką komórką grzybową jest komórka rodzaju Aspergillus i szczególnie korzystnie z gatunku Aspergillus niger. Szczególnie interesującą jest ekspresja fruktozylotransferazy według wynalazku w tych komórkach w połączeniu z wydzielniczą sekwencją sygnałową, na przykład taką jak gen patatyny lub gen 1-SST z Aspergillus foetidus (Rehm i wsp., J. Bac. 180 (1998), 1305-1319), pozwalającą na wydzielenie fruktozylotransferazy do pożywki. Stosowane są korzystnie komórki posiadające zredukowaną aktywność inwertazy lub całkowicie pozbawione aktywności inwertazy. Gatunki grzybów nieposiadające swojej własnej aktywności inwertazy, to na przykład Trichoderma reesei. Protokół ekspresji β-fruktofuranozydazy (inwertaza z A.niger) była opisana na przykład w Berges i wsp. (Curr. Genet. 24 (1993), 53-59). Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku, która koduje białko posiadające aktywność fruktozylotransferazy lub odnośny wektor, może być transfekowana lub transformowana do komórki gospodarza konwencjonalnymi technikami przez fachowców w tej dziedzinie. Sposoby wytwarzania połączonych przez fuzję, operacyjnie połączonych genów i ich ekspresji w odpowiednich komórkach gospodarzy są dobrze znane ze stanu techniki i opisane były na przykład w Sambrook lub Ausubel, patrz wyżej. Korzystnymi gospodarzami są E.coli, grzyby, zwłaszcza drożdże oraz komórki roślinne.

Komórki według wynalazku korzystnie charakteryzują się tym, że cząsteczka wprowadzonego kwasu nukleinowego jest heterologiczna w odniesieniu do transformowanej komórki, to znaczy, że nie występuje ona naturalnie w tych komórkach lub że jest zlokalizowana w takim miejscu genomu, który różny jest od naturalnie występującej sekwencji.

Jeżeli cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku ulegają ekspresji w roślinach zwykle możliwe jest, że zsyntetyzowane białko zlokalizowane jest w którymś z przedziałów komórki roślinnej. W celu osiągnięcia lokalizacji w specyficznym przedziale, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może być połączona z sekwencjami DNA, które zapewniają lokalizację w pożądanym przedziale; patrz wyżej. Sekwencje takie są znane (patrz, na przykład, Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29).

Gospodarze według wynalazku zawierają zatem transgeniczne komórki roślinne, tkanki roślinne i rośliny, które są transformowane jednym lub wieloma cząsteczką(ami) kwasu nukleinowego według wynalazku, jak również transgeniczne komórki roślinne pochodzące z komórek transformowanych w ten sposób. Takie komórki zawierają jedną lub wiele cząsteczkę(ek) kwasu nukleinowego, która jest (są) korzystnie połączone z elementami regulatorowymi DNA pozwalającymi na transkrypcję w komórkach roślinnych, korzystnie z promotorem. Komórki takie mogą być odróżnione od naturalnie występujących komórek roślinnych w ten sposób, że zawierają one co najmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, która nie występuje naturalnie w tych komórkach lub, że taka cząsteczka jest zlokalizowana w takim miejscu genomu tych komórek gdzie nie występuje ona naturalnie, to znaczy w innym otoczeniu genomowym.

W kolejnej postaci wynalazku niniejszy wynalazek dotyczy komórek roślinnych zawierających w ich cytozolu białko według wynalazku. W tej postaci wynalazku, sekwencja wskazana jako SEQ ID nr 2 stosowana jest zwykle bez dodatkowych sekwencji sygnałowych.

PL 202 383 B1

W następnej korzystnej postaci, wynalazek niniejszy dotyczy komórek roślinnych zawierających w ich plastydach białko według wynalazku.

Aby dokonać lokalizacji białka według wynalazku w plastydowach, można zmodyfikować cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku i/lub wektory według wynalazku w powyżej opisany sposób.

Ponieważ wodniczka jest zwykle zdolna do gromadzenia dużych ilości sacharozy, która stanowi substrat dla białka według wynalazku, ten przedział jest najbardziej odpowiedni do generowania komórek roślinnych, które w związku z aktywnością białka według wynalazku produkowały polifruktozę w wodniczkach.

W szczególnie korzystnej postaci niniejszy wynalazek dotyczy zatem komórek roślinnych zawierających w wodniczce białko według wynalazku.

Wyjaśniono już powyżej jak cząsteczki kwasu nukleinowego i/lub wektory według wynalazku muszą być skonstruowane w celu zmiany lokalizacji białka według wynalazku w wodniczce.

Transgeniczne komórki roślinne i tkanki roślinne mogą być regenerowane do całych roślin sposobami znanymi fachowcom. Rośliny, które można otrzymać przez regenerację transgenicznych komórek roślinnych według wynalazku są także przedmiotem niniejszego wynalazku. Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku są rośliny, które zawierają transgeniczne komórki roślinne opisane powyżej. Rośliny według wynalazku mogą ogólnie być roślinami dowolnego gatunku, korzystnie są one roślinami jednoliściennymi lub dwuliściennymi. Korzystnie komórki roślinne pochodzą z roślin użytecznych rolniczo, to znaczy roślin, które są uprawiane przez człowieka w celu zaopatrzenia w żywność lub w celach technicznych a zwłaszcza przemysłowych. Korzystnie wynalazek dotyczy produkujących włókna (na przykład len, konopie, bawełna), gromadzących olej (na przykład rzepak, słonecznik, soja), gromadzących cukier (na przykład burak cukrowy, trzcina cukrowa, słodkie sorgo, banany) i gromadzących białka (na przykład strączkowe) roślin.

W następnej korzystnej postaci wynalazek dotyczy roślin pastewnych (na przykład traw na suchą paszę lub na kiszonkę, kurkumy, koniczyny itp.), warzyw (na przykład melona, pomidora, bananów, cykorii, pora, szparagów, marchwi) lub roślin gromadzących skrobię (pszenica, jęczmień, owies, żyto, ziemniaki, kukurydza, ryż, groszek, kasawa, fasola mungo).

W następnej postaci wynalazek dotyczy komórek roślinnych z roślin zawierających sacharozę (na przykład burak cukrowy, ziemniaki, ryż, pszenica, trzcina cukrowa, itp.). Szczególnie korzystnymi są burak cukrowy, cykoria, ryż, kukurydza, ziemniaki, trzcina cukrowa i pszenica. Wynalazek dotyczy także materiału propagacyjnego i produktów zbieranych z roślin według wynalazku na przykład owoców, nasion, bulw, korzeni, siewek, zrazów, kallusów, hodowli komórkowych, itp.

Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobów wytwarzania roślin transgenicznych, w których:

(a) komórka roślinna jest genetycznie zmodyfikowana przez wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku i/lub wektora według wynalazku; i (b) roślina jest regenerowana z komórki; i ewentualnie (c) dalsze rośliny są generowane z roślin według (b).

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „genetycznie zmodyfikowany” oznacza, że ta komórka roślinna jest zmodyfikowana informacją genetyczną właściwą dla wprowadzonej cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku i że obecność lub ekspresja cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku daje w wyniku modyfikację fenotypową. Modyfikacja fenotypowa korzystnie oznacza dającą się wykryć modyfikację jednej lub wielu funkcji komórek. Na przykład, genetycznie zmodyfikowane rośliny według wynalazku wykazują aktywność białka według wynalazku lub podwyższoną całkowitą aktywność fruktozylotransferazy.

Rośliny mogą być regenerowane według etapu (b) zgodnie ze sposobem dobrze znanym fachowcom biegłym w tej dziedzinie.

Generowanie następnych roślin według etapu (c) sposobu według wynalazku może być wykonane, na przykład albo wegetatywnie (na przykład, stosując sadzonki, bulwy lub hodowle kallusa i regenerację całych roślin) lub generatywnie. Propagację generatywną korzystnie przeprowadza się w kontrolowany sposób, to znaczy wybrane rośliny posiadające specyficzne właściwości są krzyżowane i rozmnażane.

Niniejszy wynalazek dotyczy roślin dających się otrzymać zgodnie ze sposobem według wynalazku.

Niniejszy wynalazek dotyczy także materiału propagacyjnego roślin według wynalazku jak też roślin transgenicznych wygenerowanych sposobem według wynalazku. Określenie „materiał propagacyjny” obejmuje te części roślin, które są odpowiednie do wytwarzania potomstwa albo na drodze

PL 202 383 B1 wegetatywnej albo generatywnej. Dla propagacji wegetatywnej stosuje się, na przykład, owoce, nasiona, siewki, protoplasty, hodowle komórkowe itp. Korzystnie materiałem propagacyjnym są bulwy i nasiona.

W innej postaci, niniejszy wynalazek dotyczy zbieranych-części roślin, wedł ug wynalazku, takich jak owoce, liście, korzenie zapasowe, korzenie, kwiaty, pączki, kiełki, łodygi, korzystnie nasiona i bulwy.

W następnej korzystnej postaci niniejszy wynalazek dotyczy pożywienia dla zwierząt i/lub ludzi, które zawiera dające się zebrać części roślin według wynalazku, korzystnie nasiona i bulwy.

Korzystnie, części roślin według wynalazku, po spożyciu, mają korzystny wpływ na zdrowie ludzi i/lub zwierząt, w porównaniu do odpowiednich części roślin, które nie były genetycznie modyfikowane w sposób opisany w wynalazku. To samo dotyczy pożywienia dla zwierząt i/lub ludzi opisanych w wynalazku. U ludzi konsumpcja żywności według wynalazku moż e na przykład prowadzić do poprawienia składu flory bakteryjnej w jelitach, zwłaszcza wzrostu zawartości bifidobakterii w jelicie, co jak wydaje się, ma pozytywny wpływ na ludzkie zdrowie (Izzo, Trends in Food Science & Technology 9 (1998), 255-257). Te pozytywne wpływy są korzystnie wpływami profilaktycznymi lub wpływami wspierającymi wykorzystanie pożywienia.

Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania komórek gospodarza, w którym odpowiednie komórki gospodarza transformowane są kwasem nukleinowym według wynalazku. Omawiane tu sposoby transformowania różnych komórek gospodarza, są znane fachowcom biegłym w tej dziedzinie.

W innej postaci niniejszy wynalazek dotyczy sposobów wytwarzania fruktozylotransferazy, w których gospodarz wedł ug wynalazku jest hodowany w warunkach wystarczają cych do ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku a następnie fruktozylotransferazę izoluje się z hodowli, to znaczy z komórek i/lub ewentualnie obecną z medium hodowlanego. W powyżej wspomnianym sposobie transformowane lub transfekowane komórki gospodarza są hodowane na przykład w fermentorach aż do uzyskania optymalnej gęstości komórkowej. Ewentualnie, w przypadku indukowalnych promotorów, ekspresja białka kodowanego przez cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku jest indukowana tylko na koniec etapu fermentacji. Białko wyrażane w ten sposób może być następnie oczyszczane z pożywki, lizatu komórkowego lub frakcji błon komórkowych zgodnie z technikami konwencjonalnymi. Białka, które były wyrażane na przykład mikrobiologicznie mogą być izolowane i oczyszczane metodami preparatywnej chromatografii lub oczyszczane immunologicznie, na przykład przez zastosowanie przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych, które rozpoznają białko kodowane przez tą cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. W tym kontekście powinno się wspomnieć, że białko posiadające aktywność fruktozylotransferazy i kodowane przez cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku może zawierać dodatkowe funkcjonalne sekwencje aminokwasowe, na przykład białka tag (GST, GFP, Flag, peptyd HA, His-tag), które mogą pochodzić z heterologicznych biał ek lub mogą być wytwarzane syntetycznie.

Ponadto wynalazek dotyczy białek posiadających aktywność fruktozylotransferazy, to znaczy fruktozylotransferazy kodowanej przez cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku lub dające się otrzymać sposobem według wynalazku. Fruktozylotransferaza według wynalazku może korzystnie być stosowana do wytwarzania polifruktoz typu inuliny. Mogą one także służyć do produkcji przeciwciał, które mogą być stosowane do wykrywania i/lub oczyszczania fruktozylotransferazy.

W kolejnym wykonaniu wynalazek dotyczy czą steczek kwasu nukleinowego, które specyficznie hybrydyzują z cząsteczkami kwasu nukleinowego według wynalazku lub ich fragmentami. Cząsteczki te korzystnie są oligonukleotydami o długości co najmniej 10, korzystnie 15 a szczególnie korzystnie co najmniej 50 nukleotydów. Oligonukleotydy według wynalazku mogą na przykład być stosowane jako primery do reakcji PCR, jako sondy hybrydyzacyjne lub podobnie.

Kolejną istotą wynalazku są sposoby wytwarzania polifruktoz, zwłaszcza typu inuliny, w którym komórki gospodarza według wynalazku lub zawierające je organizmy gospodarza, są hodowane w warunkach pozwalających na ekspresję fruktozylotransferazy według wynalazku jak również na syntezę polifruktozy.

Dzięki dostarczeniu cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku stało się możliwe wytwarzanie na drodze techniki genowej - polifruktoz, zwłaszcza typu inuliny, w organizmach, takich w jakich nie był o to moż liwe do tej pory przy zastosowaniu metod konwencjonalnych. Jest zatem moż liwe przeprowadzenie ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku w gospodarzach takich jak bakterie, grzyby lub komórki roślinne w celu podwyższenia aktywności odpowiadającej fruktozylotransferazie lub wprowadzenie jej do komórek, które normalnie nie mają ekspresji wspomnianego enzymu. Dzięki ekspresji lub ekspresji dodatkowej co najmniej jednej cząsteczki kwasu nukleinoPL 202 383 B1 wego według wynalazku, komórki gospodarza według wynalazku syntetyzują polifruktozę, zwłaszcza typu inuliny. Kolejną istotą wynalazku są dlatego polifruktozy, szczególnie typu inuliny, dające się otrzymać z komórek gospodarza według wynalazku, jak też dające się otrzymać z materiału propagacyjnego i z roślin, dających się otrzymać z roślin i produktów ich zbiorów.

Zatem niniejszy wynalazek dotyczy zwłaszcza wytwarzania polifruktoz, zwłaszcza typu inuliny, obejmującej:

(a) hodowlę komórek gospodarza według wynalazku, lub gospodarza zawierającego taką komórkę, w warunkach pozwalających na wytworzenie fruktozylotransferazy i reakcję sacharozy, ewentualnie dodanej z zewnątrz komórki, lub równoważnika substratowego dla polifruktozy typu inuliny; i (b) otrzymanie polifruktozy wytworzonej w ten sposób z hodowanych komórek gospodarza.

Komórki gospodarzy korzystnie są komórkami roślinnymi i gospodarze są korzystnie roślinami. Sposób otrzymywania polifruktozy, szczególnie typu inuliny z roślin opisany jest w, na przykład, Vogel (w: Inulin and Inulin-containing Crops, Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam, A. Fuchs (Ed.) (1993), 65-75).

Inną istotą wynalazku jest sposób wytwarzania polifruktozy in vitro, szczególnie typu inuliny, obejmujący:

(a) kontaktowanie sacharozy lub równoważnika substratu z fruktozylotransferazą według wynalazku w warunkach pozwalających na przekształcenie w polifruktozę; i (b) otrzymanie wytwarzanej w ten sposób polifruktozy.

Równoważnikiem substratowym sacharozy jest na przykład, substrat, który jest przetwarzany do sacharozy przez komórkę gospodarza lub jeden albo wiele enzym(ów). Równoważnik substratowy dla sacharozy może być także di- lub oligosacharydem, który może być alternatywnie stosowany jako substrat przez fruktozylotransferazę według wynalazku. Przykładem tych sacharydów jest trójsacharyd rafinozy. Jednakże można też zastosować sacharozę derywatyzowaną. Korzystnie, inulina otrzymana według powyżej wspomnianego sposobu jest długołańcuchową inulina i korzystnie ma stopień polimeryzacji DP>20, korzystnie DP>50, szczególnie DP>100, i szczególnie korzystnie stopień polimeryzacji DP>200.

Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania polifruktozy, a szczególnie typu inuliny, obejmujący etap ekstrakcji polifruktozy z jednej z powyżej opisanych roślin/komórek roślin i z części roślin według wynalazku. Korzystnie, sposób ten również obejmuje etap zbierania wyhodowanych roślin i/lub części tych roślin przed ekstrakcją polifruktozy i szczególnie korzystnie etap hodowli roślin według wynalazku przed ich zbiorem. Sposoby ekstrakcji polifruktozy roślin lub części roślin są znane fachowcom i opisane były przez, na przykład Gibson (International Sugar Journal 96 (1994), 381-387), Vogel (Stud. Plant Sci. 3 (1993), Inulin and Inulin-Containing Crops, 65-75).

Wynalazek dotyczy polifruktozy, zwłaszcza typu inuliny, którą można otrzymać z komórek gospodarza według wynalazku lub zgodnie z opisanym powyżej sposobem. Ta polifruktoza może korzystnie być użyta do wytworzenia surfaktanów lub dla podwyższenia lepkości układów wodnych, jako detergent, jako czynnik zawiesinowy, dla przyspieszenia sedymentacji kompleksowania lub do związania wody.

Także, komórki gospodarza według wynalazku, które syntetyzują polifruktozę, szczególnie typu inuliny mogą być stosowane jako dodatki do żywności. Takie zastosowanie jest korzystne, ponieważ fruktany mają pozytywny wpływ na zdrowie (Roberfroid i wsp., J. of Nutrition 128 (1998), 11-19; Kleesen i wsp., Am. J. Clin. Nutr. 65 (1997), 1397-1402).

Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania polifruktozy zwłaszcza typu inuliny, i polega na tym, ż e grzybową fruktozylotransferazę stosuje się do wytwarzania polifruktozy lub stosuje się organizm gospodarza, który posiada ekspresję grzybowej fruktozylotransferazy. Korzystnie mogą być stosowane fruktozylotransferazy według wynalazku lub komórki gospodarza według wynalazku. Niniejszy wynalazek po raz pierwszy pokazał, że możliwym jest zastosowanie takich grzybowych fruktozylotransferaz do wytwarzania polifruktozy typu inuliny.

Na koniec, niniejszy wynalazek dostarcza zastosowania grzybowych fruktozylotransferaz do wytwarzania polifruktozy zwłaszcza typu inuliny.

Dodatkowe piśmiennictwo dotyczące opisanych powyżej sposobów, środków i zastosowań, które mogą być wykorzystane w niniejszym wynalazku, mogą być wzięte ze stanu techniki, na przykład z bibliotek publicznych, na przykład stosując noś niki elektroniczne. Do tego celu uż yteczne są dostępne poprzez internet publiczne bazy danych takie jak „Medline”, na przykład pod adresem internetowym http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Inne bazy danych i adresy są znane fachow-

PL 202 383 B1 com w danej dziedzinie i mogą być znalezione w internecie na przykład pod adresem http://www.lycos.com. Przegląd źródeł i informacji odnośnie patentów biotechnologicznych lub zgłoszeń patentowych dostarczony jest w Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Figura 1 pokazuje budowę pSK-as1 dla transformacji bakterii.

Figura 2 pokazuje budowę plazmidu p112-as1 dla transformacji komórek drożdży.

Figura 3 pokazuje budowę plazmidu pA7-as1 dla transformacji komórek roślin.

Figura 4 pokazuje budowę plazmidu p35-as1 dla transformacji roślin.

Figura 5 pokazuje budowę plazmidu p35-s3-as1 dla transformacji roślin.

Figura 6 pokazuje analizę cienkowarstwowej chromatografii transformowanej E.coli przy pomocy pSK-as1. Pasek 1 pokazuje doświadczenie kontrolne z wektorem bez insertu (wstawki) pBluescript SK. Pasek 2 pokazuje doświadczenie z plazmidem pas1, w którym region kodujący as1 nie jest w ramce z genem lacZ (pasek 2). W tym przypadku translacja regionu kodującego as1 jest prowadzona nie jako fuzja z β-glukoronidazą ale zachodzi ze zredukowaną wydajnością, rozpoczynając się od endogennego regionu startowego. Paski 3 do 6 pokazują doświadczenia z różnymi transformantami konstruktu pSK-as1. Po hodowli, bakterie do OD 600 z 0,4, kultury indukowano przy pomocy 100 mM IPTG. Po 2 godzinach indukcji komórki były zbierane i poddawane lizie w 50 mM fosforanie sodowym pH 6. Ekstrakty białka inkubowano przez 12 godzin w 600 mM sacharozie w 37°C. Jako standard dla chromatografii cienkowarstwowej, na paskach 7-9 naniesiono odpowiednio 1-kestozę (7), sacharozę (8) i fruktozę (9).

Figura 7 pokazuje analizę cienkowarstwowej chromatografii transformowanych komórek drożdży zawierających plazmid p112-as1 (pasek 2) lub p112-as1L (pasek 3). Wektor p112-as1L zawiera 5'-lider przenośnika sacharozy szpinaku. Pasek 1 pokazuje doświadczenie kontrolne z nietransformowanymi komórkami drożdży. Aktywność fruktozylotransferazy była wykrywana w ekstraktach białkowych z komórek drożdży. Jako standard naniesiono fruktozę (pasek 4), mieszaninę 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy (pasek 5) i sacharozę (pasek 6).

Figura 8 pokazuje analizę cienkowarstwowej chromatografii komórek roślin zawierających plazmid pA7-as1. Pasek 1 pokazuje transformację wektorem bez insertu pA7 (50 μg); paski 2 do 5 pokazują transformacje wektorem pA7-as1 (pasek 2: 10 μg; pasek 3: 20 μg; pasek 4 i 5: 50 μg). Jako standard naniesiono, mieszaninę 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy (pasek 6), sacharozy (pasek 7) oraz fruktozy (pasek 8).

Dla każdego doświadczenia stosowano 500000 protoplastów. Po transformacji protoplasty inkubowano przez dwa dni w 25°C a następnie uzyskiwano ekstrakt białkowy w 50 mM fosforanie sodowym pH 6, który był inkubowany przez 20 godzin w 28°C z 500 mM sacharozą. Nanoszono 4 μl mieszaniny o rozcieńczeniu 1/10.

Figura 9 pokazuje analizę cienkowarstwowej chromatografii roślin, które były transformowane konstruktem 35-as1. Wybrano dwanaście przypadkowych roślin. Każde 20 mg materiału liści ekstrahowano w 200 μl wody. Nanoszono 4 μl ekstraktu. Jako standard naniesiono fruktozę (pasek F), sacharozę (pasek S) i mieszaninę 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy (pasek St).

Figura 10 pokazuje analizę cienkowarstwowej chromatografii roślin, które były transformowane konstruktem 35-S3as1. Wybrano dwanaście przypadkowych roślin. Każde 20 mg materiału liści ekstrahowano w 200 μl wody. Nanoszono 4 μl ekstraktu. Jako standard nanoszono fruktozę (pasek F), sacharozę (pasek S) i mieszaninę 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy (pasek St).

Figura 11 pokazuje eluat „400 do 0 mM siarczanem amonowym” kolumny fenylosuperozowej, na którą nałożono ekstrakt białkowy z Aspergillus sydowi wzbogacony fruktozylotransferaza (pasek E). W paskach oznaczonych jako „M” wskaźnik rozmiaru jest oddzielony. Masy cząsteczkowe białek wskaźnikowych są oznaczone na prawej stronie kDaltonach.

Wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami.

P r z y k ł a d I

Oczyszczanie afl-SST z Aspergillus sydowi Aspergillus sydowi IAM2544 był hodowany w pożywce hodowlanej, która zawierała 2% ekstraktu słodowego, 0,5% peptonu i 2% sacharozy. Pożywka była zestalana przez dodanie 2% agaru. Zarodniki były nanoszone i hodowlę utrzymywano w 25°C aż do całkowitego wyschnięcia płytek. Konidia zbierano z płytek i rozcieńczano w 50 mM fosforanie sodowym pH 6. Lizę konidi przeprowadzano w trzech pasażach przez „French Pressure Cell”.

W celu oczyszczenia homogenat absorbowano na Sepharose Q. Związane białko eluowano w liniowym gradiencie 0 do 1000 mM KCl. Frakcje aktywne sacharozolitycznie otrzymywane były pomiędzy 500 a 700 mM KCl. Frakcje te łączono i dializowano wobec fosforanu sodowego pH 6. W celu

PL 202 383 B1 wzbogacenia białka było ono ponownie adsorbowane na Sepharose Q (objętość złoża 2 ml) i eluowane w objętości 10 ml.

Eluat doprowadzano do 2 M siarczanem amonowym i adsorbowano na fenylosuperozie. Elucję przeprowadzono po przemyciu 2 M siarczanem amonowym, 100 mM fosforanem sodowym pH 7 w liniowym gradiencie od 2 M do 0 M siarczan amonowy. Frakcje aktywne były otrzymane w gradiencie elucji pomiędzy 400 a 0 mM siarczanem amonowym. Mieszanina otrzymanego białka była analizowana na SDS-PAGE. Wyniki są przedstawione na fig. 11. Podobne wzbogacenie aktywności sacharozolitycznej - chociaż z grzybni Aspergillus sydowi - było opisane przez Muramatsu i Nakakuki (Biosci Biotech Biochem 59 (1995), 208-212). Oczyszczanie nie dało homogennego białka, które mogłoby być odpowiednie do na przykład sekwencjonowania.

Dla identyfikacji fruktozylotransferazy zastosowano semi-natywny żel poliakryloamidowy, na który nałożono 10 μg eluatu białka z kolumny fenyl superoza w 0,1% SDS, 10% glicerol, 50 mM Tris pH 6,8. Po elektroforezie żel był ponownie buforowany trzykrotnie przez 10 minut w 50mM fosforanie sodowym pH 6,0, 1% Tritonie X 100 i następnie inkubowany przez 30 minut w 50 mM fosforanie sodowym pH 6, 1% Tritonie X 100, 500 mM sacharozie. Następnie żel był gotowany w 0,1% (w/v) chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolowym (TTC), 0,5 M NaOH. W ten sposób TTC tworzy barwnik czerwonego formazanu razem z cukrami redukującymi.

Pasek białka oznaczony na fig. 11 prowadzący do zabarwienia związanego z aktywnością sacharozolityczną tego białka, które mogłoby w ten sposób mogłoby być identyfikowane jako fruktozylotransferaza z Aspergillus sydowi. Pasek ten był izolowany z żelu preparatywnego, białko było eluowane z żelu i stosowane do sekwencjonowania. Ponieważ białko to jest zablokowane N-końcowo, odczepienie przeprowadzono endopektydazą LysC i AspN, peptydy oczyszczano na HPLC i poddano sekwencjonowaniu według Edmann'a. Następujące sekwencje były otrzymane:

LysC: VLPSTSQASEK (SEQ ID nr 3)

AspN: DDLVTYR (SEQ ID nr 4)

DPYVFQNHEV (SEQ ID nr 5)

W celu sklonowania genu skonstruowano bibliotekę cDNA w fagu Lambda Zap II (Stragene, Heidelberg). Ponieważ nie było możliwym spreparowanie RNA z konidii, RNA spreparowano z grzybni według Logemann i wsp. (Anal. Biochem. 163 (1987), 16-20). Poli A+ - RNA było otrzymane w polyATract System (Promega, Madison, USA). Synteza cDNA i klonowanie w Lambda Zap II było przeprowadzone zgodnie z instrukcją producenta (Stratagene, Heidelberg). Zgodnie z sekwencja białkową zaprojektowano następujące startery:

Starter asp19 do dołu: 5'-GAYGAYYTNGTNACNTAYMG (SEQ ID nr 6)

Starter asp19 do góry: 5'-CKRTANGTNACNARRTCRTC (SEQ ID nr 7)

Starter asp31 do dołu 5'-GTNTTYCARAAYCAYGARG (SEQ ID nr 8)

Starter asp31 do góry 5'-TGRTTYTGRAANACRTANGG (SEQ ID nr 9)

Starter lys1 do góry 5'-GCYTGNSWNGTNSWNGG (SEQ ID nr 10)

W reakcji PCR z pełną biblioteką cDNA jako matrycą i kombinacją primerów asp19 do dołu/asp31 do góry (temperatura topnienia 40°C), otrzymano fragment DNA o około 350bp. Wspomniany fragment zastosowany był po wyznakowaniu radioaktywnym (Megaprime Kit, Boehringer Mannheim, Mannheim) do badania przesiewowego biblioteki cDNA. Otrzymane klony były amplifikowane po wycięciu in vivo jako plazmidy pBluescript. Inserty cDNA porównywano po rozszczepieniu restrykcyjnym i inserty klonów były całkowicie zsekwencjonowane. Sekwencja insertu cDNA jest pokazana na SEQ ID nr 1. Sekwencja pochodna jest pokazana na SEQ ID nr 2.

P r z y k ł a d II

Wytwarzanie konstruktów zawierających regiony kodujące grzybowej fruktozylotransferazy przygotowano do transformacji różnych pro- i eukariotycznych komórek gospodarzy.

Do transformacji różnych komórek gospodarzy grzybową fruktozylotransferazą przygotowano wiele różnych konstruktów zgodnie z standardowymi technikami biologii molekularnej (Sambrook i wsp., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Konstrukty te są pokazane na Figurach 1 do 5. Szczegółowo konstrukty przygotowywano w następujący sposób:

pSK-as1 jest pochodną pas1, która była otrzymana jako wycinek in vivo z klonu Lambda Zap II biblioteki cDNA Aspergillus sydowi. pas1 zawiera cDNA jako fragment EcoRI/Xhol. pSK-as1 otrzymany z pas1 przez rozszczepienie BamHI i Smal, wypełnienie kohezyjnego końca i ponowną ligację wektora. Przez usuniecie czterech nukleotydów regionu kodującego as1 jest przełączany do ramki odczytu genu lacZ (Fig. 1).

PL 202 383 B1 p112-as1 W wektorze p112A1NE (patrz Riesmeier i wsp., EMBO J. 11 (1992), 4705-4713), który był rozszczepiony przez BamHI, wypełniony i następnie rozszczepiony przez NotI, klonowano fragment as1 z pas1 (rozszczepiony przez asp718 wypełniony i rozszczepiony przez NotI) (Fig.2).

pA7-as1 był generowany z pA7 przez klonowanie regionu kodującego pas1 jako fragmentu Smal/Asp718, lepkie końce którego były wypełnione w wektorze wypełnionym Asp718 i miejscem restrykcyjnym Smal. Właściwą orientację tego fragmentu potwierdzono za pomocą rozszczepienia przez HindIII, które dało w wyniku fragment około 1900bp. pA7 jest pochodną pUC18, który zawiera pomiędzy EcoRI i Asp718 promotor RNA 35S wirusa mozaiki kalafiorowej (CaMV; 528 bp; nt 6909-7437, Franek i wsp., Cell 21 (1980), 285-294), jak również pomiędzy SphI i HindIII terminator genu syntetazy oktopiny z Agrobacterium tumefaciens (Gielen i wsp., EMBO J. 3 (1984), 835-846) (Fig. 3).

p35-as1 był generowany z pBinAR przez ligację fragmentu as1 z pas1 (rozszczepionego przez Asp718/NotI i następnie wypełnionego) do wektora, który był rozszczepiony przez Smal. pBinAR jest pochodną pBinl9 (Bevan, Nuci. Acids Res. 12 (1984), 8711), który zawiera pomiędzy Eco RI i Asp718 promotor RNA 35S wirusa mozaiki kalafiorowej (CaMV; 528 bp; nt 6909-7437, Franek i wsp., loc. cit.), jak również pomiędzy SphI i HindIII terminator genu syntazy oktopiny z Agrobacterium tumefaciens (Gielen i wsp., loc. cit.) (Fig. 4).

p35-s3-as1 był klonowany w dwóch etapach. Pierwszy, fragment BamHI /Asp718 z pas1, zwarty koniec którego wypełniony był przez polimerazę T4, klonowany był do wektora pS3, który był rozszczepiony przez BamHI i następnie wypełniony. W ten sposób otrzymano pS3-as1. Wektor pS3 zawiera fragment PCR genu patatyny B33 (Rosahl i wsp., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 214-220), który zawiera nukleotydy 725 do 1400. Ten fragment PCR jest wyposażony w miejsce restrykcji Asp718 (GGTACC) przy nt 725, z sekwencją ATGG przy nt 1400, które w połączeniu z nt 1399 i 1400 daje miejsce restrykcji Ncol. Fragment PCR jest wstawiony pomiędzy Asp718 i miejscem restrykcji Smal. Z pS3-as1 był preparowany fragment Sacl (wypełniony)/Xbal, który zawiera fuzję S3-as1. Fragment ten był klonowany pomiędzy miejscem restrykcji Smal i Xbal w pBinAR (Fig.5).

Odpowiednich gospodarzy transformowano standardowymi technikami. E.coli transformowano zgodnie z metodą Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580), Saccharomyces cerevisiae transformowano zgodnie z metodą Dohmen i wsp. (Yeast 7 (1991), 691-692), przejściowa ekspresje genu w protoplastach tytoniu przeprowadzono zgodnie z metodą Damm i Willmitzer (Mol. Gen. Genet. 213 (1989), 15-20), stałą transformacje roślin ziemniaka według metody Dietze i wsp. (w: Potrykus, I. i G. Spangenberg (Ed.). Gene transfer to plants. xxii+361 (1995), 24-29; Springer-Verlag: Berlin, Germany; New York, New York, USA. ISBN 3-540-58406-4).

P r z y k ł a d III

Analizy aktywności fruktozylotransferazy w komórkach transgenicznego gospodarza lub w organizmach z ekspresją grzybowej fruktozylotransferazy.

Synteza inuliny in vivo

Komórki transgenicznego gospodarza lub organizmy z ekspresją grzybowej fruktozylotransferazy były hodowane w pożywce z 2% sacharozy - o ile nie była to tkanka roślinna. W przypadku Escherichia coli K12 jako organizm gospodarza, funkcjonalny gen cscB kodujący permeazę sacharozy E.coli był wprowadzony jako konstrukt do wektora pACYC184. W przypadku Saccharomyces cerevisiae gen transportera sacharozy szpinaku był wprowadzony do wektora p112AINE (Riesmeier i wsp., EMBO J. 11 (1992), 4705-4713). Komórki hodowano przez co najmniej 24 godziny w obecności sacharozy, następnie zbierano i rozbijano po przemyciu 50 mM fosforanem sodowym pH 6.

Rośliny z ekspresją grzybowej fruktozylotransferazy były hodowane na glebie. Po czterech tygodniach liście i inne próbki tkanek pobierano i ekstrahowano w 1 ml wody/g świeżej masy w obecności nierozpuszczalnego poliwinylopolipyrolidonu, resztki komórek były usuwane przez wirowanie.

μl każdego z ekstraktów nanoszono na żel krzemionkowy na błonie pre-cast DC (Schleicher i Sch^l, Dassel, Germany) i rozwijano dwukrotnie w układzie aceton/woda (87:13). Badanie reszt fruktozylu przeprowadzono w odczynniku mocznik -kwas fosforowy (Rober i wsp., Planta 199 (1992), 528-536).

Synteza inuliny in vitro

Komórki z ekspresją grzybowej fruktozylotransferazy były rozbijane w 50 mM fosforanie sodowym pH 6, 50 μΜ PMSF, 1 mM DTT, 10% (v/v) glikolu etylenowym. Ekstrakty komórek inkubowano

PL 202 383 B1 w 50 mM fosforanie sodowym pH 6, 500 mM sacharozie, 50 μ M PMSF, 1 mM DTT, 0,02% (w/v)

NaN3, 10% glikolu etylenowym przez 12 godzin w 25°C. Mieszaniny te rozcieńczano w wodzie 1:10, następnie 4 μΐ nanoszono na żel krzemionkowy na błonie pre-cast DC (Schleicher i Sch^l, Dassel, Germany) i rozwijano dwukrotnie w układzie aceton/woda (87:13). Badanie reszt fruktozylu przeprowadzono w odczynniku mocznik kwas fosforowy (Rober i wsp., loc. cit.).

Wyniki poszczególnych analiz pokazano na figurach 6 do 10. Figury te pokazują błony z żelem krzemionkowym po chromatografii cienkowarstwowej inkubowanych mieszanin lub homogenatów komórkowych i barwienie za pomocą cukru zawierającego fruktozę. Na drodze chromatografii cienkowarstwowej w układzie aceto/woda (87:13) węglowodany mono-, oligo- i polimeryczne są oddzielane według rozmiaru. Fruktoza przemieszcza się dalej niż sacharoza, która z kolei przenosi się dalej niż kestoza, itd. Oligomery DP>7 nie są oddzielane i pozostają w miejscu naniesienia.

Na fig. 6 można zobaczyć, że klony E.coli, które są transformowane wektorem pBbluescript bez wstawki nie są zdolne do przekształcenia sacharozy (pasek 1), podczas gdy te transformowane plazmidem pas1 syntetyzują trisacharyd kestozy. Klony, które są transformowane plazmidem pSK-as1 są również zdolne do syntetyzowania wyższych oligomerów (paski 3-6). Podobnie, reszty fruktozy są przenoszone do wody, tworząc przez to fruktozę. Wspomniana przemiana katalizowana jest przez SFT z Aspergillus sydowi. Figura 7 pokazuje, że ekstrakty białkowe drożdży, które są transformowane plazmidem 112-as1 mogą syntetyzować fruktan. Aktywność fruktozylotransferazy jest większa w tych drożdżach niż tamtych, które były transformowane konstruktem 112-as1L. Ten drugi - z powodu mniejszej aktywności fruktozylotransferazy osiąganej w dostępnym w doświadczeniu czasie - może syntetyzować tylko trisacharydy. Wielkość syntetyzowanych fruktanów zależy od czasu reakcji i aktywności fruktozylotransferazy. Figura 8 przedstawia, że rozmiar syntetyzowanego fruktanu w ekstrakcie transformowanych protoplastów tytoniu zależy przy danym czasie reakcji od osiągniętej wielkości aktywności fruktozylotransferazy, która z kolei zależy od ilości transformowanego plazmidu pA7-as1. Na paskach 3-5 można zobaczyć, że były syntetyzowane oligo- i polimery z DP>7 które podczas chromatografii nie przenoszą się z miejsca naniesienia. To samo odnosi się do ekstraktów roślin z trwale transformowanych roślin jak pokazano na fig. 9 i 10.

PL 202 383 B1

Spis sekwencji <110> Max-Planck-Gesellschaft zur Forderung der Wissenschaften e.V.

<120> Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące enzymy posiadające aktywność fruktozylotransferazy i ich zastosowanie <130> C 1056 PCT <140>

<141>

<160> 10 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> i <211> 2197 <212> DNA <213> Aspergillus sydowi <400> 1 gaattcggca cgaggccgcc atgaagctcc cctcttcact ggacattctt ctcgccagac 60 aggcggttgg cggtactgag gtcgactacg actcaccacc ccctgacctg acgacgctcc 120 ctgagaactc gctgttcgag acctggagac ccaagatcca cgttctgccc ccaaatggcc 180 aaatcgggga cccatgcgct cattacaatg acccggcgac gggtttgttc catgtcggat 240 tcctccacaa tggcaccggc atttccagcg tctacaccga tgacctggtg acctatcgtg 300 atatcaatcc taacggcggc tacattattg ttgctggtgg ccccaatgac cccgaagccg 360 tctttgatgg atctgtcatc cccagcggaa tcgatgacct gcccacgctc ctttatacct 420 ctgtgacatc gttgccaatc cactggactc taccttatac ccccggaagc gagactcagt 480 cactggccgt aagtgacgat ggtggtcacc acttcgataa gcttgaccga ggcccagtca 540 ttccacttcc gccagatgga ctcgatgtta cagccttccg tgacccttat gtattccaga 600 accacgaggt agacgaagtt accggtagtg acccagatac atggtatgcc gccatatccg 660 ggggtgtcca tgatgtaggg cccggaatct ttctctaccg caaccaagac tcctcctttg 720 agaactggga atatctaggc gagtggtggc aagaacccgc caactcgact tggggtgacg 780 gcacttgggc caaacgctgg ggctacaatt tcgaaaccgg caacgtcttc tctctcgatc 840 gagaagggta caacgttgac ggccacacgt ttatgactat tggagttgag ggtgcatacg 900 cgcccatcca gccctcggtt acatctatgc atgccatgct gtgggcagcg ggaaatgttt 960 cctcagagaa tggcgaaaac gttaccttca cgccttatat ggccggtgct ttggactggg 1020 gcatggccgc atacgccggt gctggaaagg ttctacccag cacatctcag gcttctgaga 1080 agagtggagc gcccgaccgc ttcatctcgt gggtttgget tacaggtgat gaatttggtg 1140 ctgccgctgg atttcctgct gcccagcagg ggtggcagaa tactctcctg cttccgcgtg 1200 aattgagtat acacacaatc cagaatgtgg tcgacaacga actcatccac gagactgcat 1260 cctggcgtgt ggcagaacat ggcggcgaga ggagatctgg tggtgtcgag ctggagacac 1320 tgggaatcaa tattgcgagg gagacctacg atgcaatcgt ctcttctggg acctcgtttg 1380 aggagccttc gcgagacatt aatgaatccg gcaccattcc atttgagcgc tcgcccacta 1440 gcaggttctt cgcccttgaa gcccaaatct ccttccccca gtctgcgcga gactcggaag 1500 tccagtccgg atttcaaatc cttgcttctg aactcgagtg gacgacgatc tattatcagt 1560 tttcgaatga gtcgattgtc attgaccgta accacacaag tgctgcgtcc gagactacac 1620 ctggtctcgg tactgtgact gagtctggcc gtatccggct tttcgatatc gcgggtggtt 1680 gcgatcatga tggacatggc ggccacgatg gcggcaacga tgatgaccac aacggtgacg 1740 gtgatcatag cggtgacggt gaccacaatg acgatgatga ccataacgtc gacggcgatg 1800 acaaggagcg tgctcgttac caaaagcgag atggcccttg cgataaagac catgataagg 1860 ttgagacatt ggatctcacc attgtcgtcg ataactcagt gcttgaagtt tacgccaact 1920 cacgatttgt ggtgtcgacc tgggttcggc cttggtacac caattcaacg gagattcgct 1980 tcttccacaa cggcgagggt gaggtcagct ttgacaacat tgcggttcat gatggtctgt 2040 atgatgcata tccggacagg gacaactgaa gatttcactg gttgatgtat tagcttgcga 2100 gctataaaga tggcgataat tagtagattt aatccaatga attacctgcc gagattgcag 2160 atttattctt acaaaaaaaa aaaaaaaaaa actcgag 2197

PL 202 383 B1

<21

0> 2

<21

1> 6

82

<21.

2> P

RT

<21.

3> A,

speri

gillus s;

ydcw

i

<40!

0> 2

Met

Lys

Leu

Pro

Ser

Ser

Leu

Asp

Ile

Leu

Leu

Ala

Arg

Gin

Ala

Val

1

5

10

15

Gly

Gly

Thr

Glu

Val

Asp

Tyr

Asp

Ser

Pro

Pro

Pro

Asp

Leu

Thr

Thr

20

25

30

Leu

Pro

Glu

Asn

Ser

Leu

Phe

Glu

Thr

Trp

Arg

Pro

Lys

Ile

His

Val

35

40

45

Leu

Pro

Pro

Asn

Gly

Gin

Ile

Gly

Asp

Pro

Cys

Ala

His

Tyr

Asn

Asp

50

55

60

Pro

Ala

Thr

Gly

Leu

Phe

His

Val

Gly

Phe

Leu

His

Asn

Gly

Thr

Gly

65

70

75

30

Ile

Ser

Ser

Val

Tyr

Thr

Asp

Asp

Leu

Val

Thr

Tyr

Arg

Asp

Ile

Asn

85

90

95

Pro

Asn

Gly

Gly

Tyr

Ile

Ile

Val

Ala

Gly

Gly

Pro

Asn

Asp

Pro

Glu

100

105

110

Ala

Val

Phe

Asp

Gly

Ser

Val

Ile

Pro

Ser

Gly

Ile

Asp

Asp

Leu

Pro

115

120

125

Thr

Leu

Leu

Tyr

Thr

Ser

Val

Thr

Ser

Leu

Pro

Ile

His

Trp

Thr

Leu

130

135

140

Pro

Tyr

Thr

Pro

Gly

Ser

Glu

Thr

Gin

Ser

Leu

Ala

Val

Ser

Asp

Asp

145

150

155

160

Gly

Gly

His

His

Phe

Asp

Lys

Leu

Asp

Arg

Gly

Pro

Val

Ile

Pro

Leu

165

170

175

Pro

Pro

Asp

Gly

Leu

Asp

Val

Thr

Ala

Phe

Arg

Asp

Pro

Tyr

Val

Phe

180

185

190

Gin

Asn

His

Glu

Val

Asp

Glu

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Pro

Asp

Thr

Trp

195

200

205

Tyr

Ala

Ala

Ile

Ser

Gly

Gly

Val

His

Asp

Val

Gly

Pro

Gly

Ile

Phe

210

215

220

Leu

Tyr

Arg

Asn

Gin

Asp

Ser

Ser

Phe

Glu

Asn

Trp

Glu

Tyr

Leu

Gly

225

230

235

240

Glu

Trp

Trp

Gin

Glu

Pro

Ala

Asn

Ser

Thr

Trp

Gly

Asp

Gly

Thr

Trp

245

250

255

Ala

Lys

Arg

Trp

Gly

Tyr

Asn

Phe

Glu

Thr

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Leu

260

265

270

Asp

Arg

Glu

Gly

Tyr

Asn

Val

Asp

dy

His

Thr

Phe

Met

Thr

Ile

Gly

275 280 285

PL 202 383 B1

Val

Glu 290

Gly Ala

Tyr

Ala

Pro 295

Ile

Gin

Pro

Ser

Val 300

Thr

Ser

Met

His

Ala

Met

Leu

Trp

Ala

Ala

Gly

Asn

Val

Ser

Ser

Glu

Asn

Gly

Glu

Asn

305

310

315

320

Val

Thr

Phe

Thr

Pro

Tyr

Met

Ala

Gly

Ala

Leu

Asp

Trp

Gly

Met

Ala

325

330

335

Ala

Tyr

Ala

Gly

Ala

Gly

Lys

Val

Leu

Pro

Ser

Thr

Ser

Gin

Ala

Ser

340

345

350

Glu

Lys

Ser

Gly

Ala

Pro

Asp

Arg

Phe

Ile

Ser

Trp

Val

Trp

Leu

Thr

355

360

365

Gly

Asp

Glu

Phe

Gly

Ala

Ala

Ala

Gly

Phe

Pro

Ala

Ala

Gin

Gin

Gly

370

375

380

Trp

Gin

Asn

Thr

Leu

Leu

Leu

Pro

Arg

Glu

Leu

Ser

Ile

His

Thr

Ile

385

390

395

400

Gin

Asn

Val

Val

Asp

Asn

Glu

Leu

Ile

His

Glu

Thr

Ala

Ser

Trp

Arg

405

410

415

Val

Ala

Glu

His

Gly

Gly

Glu

Arg

Arg

Ser

Gly

Gly

Val

Glu

Leu

Glu

420

425

430

Thr

Leu

Gly

Ile

Asn

Ile

Ala

Arg

Glu

Thr

Tyr

Asp

Ala

Ile

Val

Ser

435

440

445

Ser

Gly

Thr

Ser

Phe

Glu

Glu

Pro

Ser

Arg

Asp

Ile

Asn

Glu

Ser

Gly

450

455

460

Thr

Ile

Pro

Phe

Glu

Arg

Ser

Pro

Thr

Ser

Arg

Phe

Phe

Ala

Leu

Glu

465

470

475

480

Ala

Gin

Ile

Ser

Phe

Pro

Gin

Ser

Ala

Arg

Asp

Ser

Glu

Val

Gin

Ser

485

490

495

Gly

Phe

Gin

Ile

Leu

Ala

Ser

Glu

Leu

Glu

Trp

Thr

Thr

Ile

Tyr

Tyr

500

505

510

G1 n

Phe

Ser

Asn

Glu

Ser

Ile

Val

Ile

Asp

Arg

Asn

His

Thr

Ser

Ala

515

520

525

Ala

Ser

Glu

Thr

Thr

Pro

Gly

Leu

Gly

Thr

Val

Thr

Glu

Ser

Gly

Arg

530

535

540

Ile

Arg

Leu

Phe

Asp

Ile

Ala

Gly

Gly

Cys

Asp

His

Asp

Gly

His

Gly

545

550

555

560

Gly

His

Asp

Gly

Gly

Asn

Asp

Asp

Asp

His

Asn

Gly

Asp

Gly

Asp

His

565

570

575

Ser

Gly

Asp

Gly

Asp

His

Asn

Asp

Asp

Asp

Asp

His

Asn

Val

Asp

Gly

580

585

590

Asp

Asp

Lys

Glu

Arg

Ala

Arg

Tyr

Gin

Lys

Arg

Asp

Gly

Pro

Cys

Asp

595

600

605

Lys

Asp

His

Asp

Lys

Val

Glu

Thr

Leu

Asp

Leu

Thr

Ile

Val

Val

Asp

PL 202 383 B1

610

615

620

Asn 625

Ser

Val

Leu

Glu

Val 630

Tyr

Ala

Asn

Ser

Arg 635

Phe

Val

Val

Ser

Thr 640

Trp

Val

Arg

Pro

Trp 645

Tyr

Thr

Asn

Ser

Thr 650

Glu

Ile

Arg

Phe

Phe 655

His

Asn

Gly

Glu

Gly 660

Glu

Val

Ser

Phe

Asp 665

Asn

Ile

Ala

Val

His 670

Asp

Gly

Leu

Tyr

Asp 675

Ala

Tyr

Pro

Asp

Arg 680

Asp

Asn

<210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Aspergillus sydowi

<400> 3
Val Leu Pro	Ser Thr Ser Gin Ala	Ser Glu Lys
1	5	10

<210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Aspergillus sydowi <400> 4

Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Aspergillus sydowi

<400> 5
Asp Pro Tyr Val	Phe Gin Asn His	Glu Val
1	5	10

<210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja sztuczna <400> 6 gaygayytng tnacntaymg 20 <210> 7

PL 202 383 B1 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja sztuczna <400> 7 .

ckrtangtna cnarrtcrtc <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja sztuczna <400> 8 gtnttycara aycaygarg <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja sztuczna <400> 9 tgrttytgra anacrtangg <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja sztuczna <400> 10 gcytgnswng tnswngg

Claims (27)

1. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca fruktozylotransferazę wybrana z grupy obejmującej:

(a) cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białko zawierające sekwencję aminokwasową wskazaną na SEQ ID nr 2;

(b) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencję nukleotydową regionu kodującego wskazaną na SEQ ID nr 1 lub odpowiadającą sekwencję rybonukleotydową;

(c) cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z nicią komplementarną do cząsteczek kwasu nukleinowego wspomnianych w (a) lub (b); i

PL 202 383 B1 (d) cząsteczki kwasu nukleinowego sekwencji, nukleotydowej, której odchylenia od sekwencji cząsteczki kwasu nukleinowego wspomnianej w (c) związane są z degeneracją kodu genetycznego;

jak również cząsteczki kwasu nukleinowego komplementarne do nich.

2. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że jest cząsteczką DNA lub RNA.

3. Cząsteczka kwasu nukleinowego według z zastrz. 1 lub 2, znamienna tym, że koduje polipeptyd grzybowy.

4. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 3, znamienna tym, że grzyb jest z rodzaju Aspergillus.

5. Wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 4.

6. Wektor według zastrz. 5, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z elementami regulatorowymi, które zapewniają transkrypcję i syntezę ulegającego translacji RNA w komórkach pro- i/lub eukariotycznych.

7. Wektor według zastrz. 6, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera region, który koduje sekwencję sygnałową, która zmienia lokalizację wewnątrz- lub pozakomórkową fruktozylotransferazy.

8. Komórka gospodarza zawierająca cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 4 lub wektor jak zdefiniowano w zastrz. od 5 do 7 przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest heterologiczna w stosunku do komórki gospodarza.

9. Komórka gospodarza według zastrz. 8, znamienna tym, że jest komórką bakterii lub komórką grzyba.

10. Komórka rośliny, która zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 4 lub wektor jak zdefiniowano w zastrz. od 5 do 7, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest heterologiczna w stosunku do komórki rośliny.

11. Sposób wytwarzania rośliny, znamienny tym, że:

(a) modyfikuje się genetycznie komórkę rośliny przez wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 4 i/lub wektora jak zdefiniowano w zastrz. od 5 do 7, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest heterologiczna w stosunku do komórki, i (b) regeneruje się roślinę z komórki; i ewentualnie (c) następne rośliny generuje się z komórki według (b).

12. Roślina zawierająca komórki roślinne jak zdefiniowano w zastrz. 10.

13. Roślina według zastrz. 12, znamienna tym, że jest rośliną użytkową.

14. Materiał propagacyjny rośliny jak zdefiniowano w zastrz. 12 lub 13 zawierający komórki roślinne jak zdefiniowano w zastrz. 10.

15. Nadające się do zbiorów części roślin jak zdefiniowano w zastrz. 12 lub 13, przy czym część rośliny zawiera komórki roślinne jak zdefiniowano w zastrz. 10.

16. Żywność dla zwierząt i/lub ludzi zawierająca nadające się do zbiorów części jak zdefiniowano w zastrz. 15.

17. Sposób wytwarzania komórek gospodarza jak zdefiniowano w zastrz. 8 lub 9, znamienny tym, że odpowiednie komórki transformuje się cząsteczką kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 4 lub wektorem jak zdefiniowano w zastrz. od 5 do 7.

18. Sposób wytwarzania fruktozylotransferazy, znamienny tym, że komórkę gospodarza jak zdefiniowano w zastrz. 8 lub 9 lub komórkę roślinną, jak zdefiniowano w zastrz. 10, hoduje się w warunkach pozwalających na syntezę fruktozylotransferazy i izoluje się fruktozylotransferazę z hodowanych komórek i/lub pożywki hodowlanej.

19. Fruktozylotransferaza kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 4 lub dająca się otrzymać sposobem jak zdefiniowano w zastrz. 18.

20. Cząsteczka kwasu nukleinowego, według zastrz. 1, znamienna tym, że specyficznie hybrydyzuje z cząsteczką kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 4 lub z komplementarną do niej nicią, przy czym hybrydyzacja ma miejsce w następujących warunkach: hybrydyzacja w 50% formamidzie, 5xSSC, 5x roztwór Denhardfa, 40 mM fosforan sodowy pH 6,8, 0,5% (w/v) BSA, 1% (w/v) SDS, 0,1 mg/ml DNA spermy śledzia w temperaturze hybrydyzacji 42°C i następnie przemywanie 0,5xSSC/0,5% w 60°C.

PL 202 383 B1

21. Sposób wytwarzania polifruktozy zwłaszcza polifruktozy typu inuliny, znamienny tym, że:

(a) hoduje się komórkę gospodarza jak zdefiniowano w zastrz. 8 lub 9 lub gospodarza zawierającego taką komórkę w warunkach pozwalających na wytwarzanie fruktozylotransferazy i przekształca się ewentualnie dodaną sacharozę lub równoważnik substratowy w polifruktozę; i (b) otrzymuje się polifruktozę wytwarzaną w ten sposób z hodowanych komórek, z gospodarza lub z pożywki.

22. Sposób wytwarzania polifruktozy zwłaszcza polifruktozy typu inuliny, znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się sacharozę lub równoważnik substratowy, z fruktozylotransferazą jak zdefiniowano w zastrz. 19, w warunkach pozwalających na przekształcenie w polifruktozę; i (b) otrzymuje się polifruktozę wytwarzaną w ten sposób.

23. Sposób wytwarzania polifruktozy zwłaszcza polifruktozy typu inuliny, znamienny tym, że zawiera etap ekstrakcji polifruktozy z komórki roślinnej jak zdefiniowano w zastrz. 10, z rośliny jak zdefiniowano w zastrz. 12 lub 13, lub z części takich roślin.

24. Sposób wytwarzania środka powierzchniowo czynnego, który obejmuje etapy (a) i (b) sposobów jak zdefiniowano w zastrz. 21 lub 22 lub etap ekstrakcji sposobu jak zdefiniowano w zastrz. 23.

25. Zastosowanie komórek gospodarza jak zdefiniowano w zastrz. 8 lub 9 lub komórek rośliny jak zdefiniowano w zastrz. 10 jako dodatków do żywności.

26. Zastosowanie fruktozylotransferazy jak zdefiniowano w zastrz. 19 do wytwarzania polifruktozy zwłaszcza polifruktozy typu inuliny.

27. Zastosowanie polifruktozy otrzymywanej sposobem jak zdefiniowano w zastrz. od 21 do 23 do wytwarzania środków powierzchniowo czynnych do podwyższania lepkości układów