CN1833026A - 生产透明质酸的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及透明质酸的生产方法，该方法包括(1)用表达重组载体转化植物的步骤，所述载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有合成透明质酸的活性的多肽的DNA，(2)培养通过转化获得的转化子的步骤，(3)分离由转化子生产的透明质酸的步骤。

Description

生产透明质酸的植物
技术领域
本发明主要涉及用植物、转化植物细胞或具有透明质酸生产能力的转化植物生产透明质酸(或透明质素，透明质酸盐；HA)的方法，以及它们的制备方法。
背景技术
植物是以低能荷生产碳水化合物的理想系统，在该系统中，碳水化合物通过光合作用由水和二氧化碳生产。除一部分生物外，其它生物自身都不能合成碳水化合物而利用源自植物的糖类。另一方面，动物和微生物生来具备利用源自植物的碳水化合物作为资源、通过修饰糖类和扩增糖链来合成碳水化合物的能力，并且存在植物不能生产而源自动物和微生物的糖衍生物和碳水化合物。植物不能生产而由动物和微生物生产的碳水化合物包括透明质酸。
透明质酸是由Meyer和Palmer在1934年从牛眼球的玻璃体中分离的糖胺聚糖(粘多糖)(Meyer，K.和Palmer，J.W.(1934)J.Biol.Chem.，107，629-634).他们证实，这种物质是由葡糖醛酸β-1，3-N-乙酰葡糖胺β-1，4二糖的重复单位形成的直链多糖(Weissman，B.和Meyer，K.(1954)J.Am.Chem.Soc.，76，1753-1757)。
随后，从1950年代到1960年代，用来自A群链球菌的无细胞系统进行了透明质酸的生物合成研究。在透明质酸的生产过程中，采用脲嘧啶-5’-二磷酸葡糖醛酸(下文写作UDP-葡糖醛酸或UDP-GlcA)和脲嘧啶-5’-二磷酸-N-乙酰葡糖胺(下文写作UDP-N-乙酰葡糖胺或UDP-GlcNAc)两种糖核苷酸展示出了局限于膜部分上的链球菌酶活性(Markovitz，M.，Cifonelli，J.A.和Dorfman，A.(1959)J.Biol.Chem.，234，2343-2350)。在一段长时间内，人们难于将透明质酸合成酶溶解并以稳定的活性形式高度纯化，但是编码链球菌透明质酸合成酶的基因(hasA)在1993年被克隆(DeAngelis，P.L.，Papaconstantiou，J.和Weigel，P.H.(1993)J.Biol.Chem.，268，14568-14571)。此后，报道了在哺乳动物细胞中克隆编码透明质酸合成酶的基因(Itano，N.和Kimata，K.(1996)J.Biol.Chem.，271，9875-9878；Itano，N.和Kimata，K.(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.，222，816-820；Spicer，A.P.，Augustine，M.L.和McDonald，J.A.(1996)J.Biol.Chem.，271，23400-23406；Spicer，A.P.，Olson，J.S.和McDonald，J.A.(1997)J.Biol.Chem.，272，8957-8961；Shyjan A.M.，Heldin，P.，ButcherE.C.，Yoshino T.和Briskin，M.J.(1996)J.Biol.Chem.，271，23395-23399；Watanabe，K.和Yamaguchi，Y.(1996)J.Biol.Chem.，271，22945-22948)，又在小球藻(Chlorella)病毒PBCY-1(DeAngelis，P.L.，Jing，W.Graves，M.V.，Burbank D.E.，和vam Etten，J.L.(1998)Science，278，1800-1804)和多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)(DeAngelis，P.L.，Jing，W.Drake，R.R和Achyuthan，A.M.(1998)J.Biol.Chem.，273，8454-8458)中发现了编码透明质酸合成酶的基因，并获得了有活性的重组酶。
和这些研究进展同时，透明质酸的生理功能也被广范围地阐明，证实了它独特的物理化学性质和生物学功能。高分子量的透明质酸被用于治疗变形性关节病，眼科用手术助剂，防止粘联和促进伤口愈合。还报道说，低分子量的透明质酸具有生理活性作用，因此可望被应用作生物材料和新的医学用途。
迄今，透明质酸均通过从哺乳动物组织中提取或微生物发酵来生产。然而，从哺乳动物组织抽提有被污染的危险，例如传染性海绵状脑病(朊病毒)或传染病毒给人类。哺乳动物细胞的保存困难，需要昂贵的培养基，而且生长速率低。另一方面，对于微生物发酵而言，含糖的培养基和设备投资都是问题。在大肠杆菌中，不出现蛋白质的加工过程，很容易形成包含体，并且产物会被蛋白酶降解，这些都是问题(Petrides，D.等(1995)Biotechol.Bioeng.，48，529)。当在微生物中生产治疗性物质时，纯化的成本由于要防止内毒素污染而变得异常昂贵。
根据这些原故，如果通过光合作用在植物中生产糖类原料，并且采用这些糖类可在植物中生产透明质酸，显然在安全和廉价方面具有工业生产的优点。
不过，虽然已有源自哺乳动物或微生物细胞的蛋白质在植物中表达的例子(Giddings，G.等(2000)Nat.Biotecnol.，18，1151-1155；Daniell，H.等(2001)Trends Plant Sci.，6，219-226)，但是为保持蛋白质功能所要求的构象和糖链结构却与原始生物中的不同，因此，生产的蛋白质常常没有原始的功能。例如红细胞生成素能在烟草BY-2细胞中表达，但在体内没有生理活性(Matsumoto，S.等(1995)Plant Mol.Biol.，27，1163-1172)。
在常规技术中，主要是将源自哺乳动物或微生物细胞的蛋白质在植物中表达，然后提取出该蛋白质来应用，而将源自哺乳动物或微生物细胞的蛋白质在植物中表达，再利用在植物中表达的该蛋白质来生产某种物质的工作，则几乎没有报道。
在植物中生产的物质，已经报道的是将人β-1，4-半乳糖基转移酶在烟草BY-2细胞中表达，并导致半乳糖通过β-1，4键新近结合到常规存在的糖蛋白的糖链上(Palacpac，N.Q.等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，4692-4697)。不过，这个反应是利用糖基转移酶从一种糖核苷酸上转移一个糖的反应，它与通过数千次地将两种类型的糖从糖核苷酸上转移而生产透明质酸这样的大分子是完全不同的。
透明质酸合成酶一般有多个跨膜或与膜相关的结构域。当外源基因在宿主中表达时，则在诸如透明质酸合成酶的膜结合蛋白中，跨膜或与膜相关的结构域不能总是保持正确的结构。例如，有人认为，在有活性的透明质酸合成酶中，一个透明质酸合成酶蛋白和大约14到18个分子的心磷脂(普遍存在于膜上的磷脂之一种)形成复合物而影响透明质酸合成酶的活性(Tlapak-Simmons，V.L.(1999)J.Biol.Chem.，274，4239-4245)。于是可以预料到，要在植物中表达植物中本来并没有的透明质酸合成酶想必是困难的。
虽然在植物中生产透明质酸的技术估计是非常有用的，但透明质酸是植物不能生产的外源碳水化合物，从常规技术来考虑，要用植物来生产植物本来不能生产的物质，而且是透明质酸这样的大分子物质，显然是相当困难的。
本发明主要目的是在植物中表达透明质酸合成酶，并利用植物细胞或植物生产植物不能天然生产的透明质酸。
附图简要说明
图1：透明质酸酶消化后生产的透明质素寡聚糖的HPLC图谱。
图2：用DNA的琼脂糖凝胶电泳分析转化烟草叶片中cv HAS的RT-PCR结果。
本发明公开内容
为解决上述问题而开展的积极研究，本发明者发现，用编码透明质酸合成酶的DNA或编码具有透明质酸合成活性的多肽的DNA转化植物细胞或植物，可在植物细胞或植物中表达用于合成透明质酸的活性酶，进而在植物中生产出透明质酸，通过进一步的广泛研究，完成了本发明。
本发明由以下诸部分组成。
[1]生产透明质酸的方法，包括步骤(1)用表达重组载体转化植物细胞，所述载体包括(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA；步骤(2)培养转化获得的转化子；步骤(3)分离由转化子生产的透明质酸。
[2]生产透明质酸的方法，包括步骤(1)用表达重组载体转化植物，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA；步骤(2)培养转化获得的转化子；步骤(3)分离由转化子生产的透明质酸。
[3]制备具有透明质酸生产能力的转化植物细胞的方法，包括用表达重组载体转化植物细胞的步骤，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
[4]制备具有透明质酸生产能力的转化植物的方法，包括用表达重组载体转化植物的步骤，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
[5]根据[4]所述的方法，其中的表达重组载体是包含：(1)(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA；(2)器官特异或组织特异的启动子的表达重组载体，并且最终得到的转化植物是能够生产器官特异或组织特异的透明质酸的转化植物。
[6]根据[1]至[5]任一项所述的方法，其中所述透明质酸合成酶是源自脊椎动物或微生物的透明质酸合成酶。
[7]根据[1]至[5]任一项所述的方法，其中所述透明质酸合成酶是源自小球藻病毒的透明质酸合成酶。
[8]用表达重组载体转化植物细胞获得的具有透明质酸生产能力的转化植物细胞，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
[9]用表达重组载体转化植物获得的具有透明质酸生产能力的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
[10]根据[9]的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述植物是选自被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物的植物。
[11]根据[9]的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述器官是选自根、茎、块茎、叶、花、块根、种子和茎尖的一种、两种或多种器官。
[12]根据[9]的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述组织是选自表皮部、韧皮部、薄壁组织、木质部及维管束的一种、两种或多种组织。
[13]根据[9]的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述表达重组载体是包含：(1)(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA；和(2)器官特异或组织特异的启动子的表达重组载体，并且最终得到的转化植物是能够生产器官特异或组织特异的透明质酸的转化植物。
[14]用表达重组载体转化植物细胞获得的生产透明质酸合成酶的转化植物细胞，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
[15]用表达重组载体转化植物获得的生产透明质酸合成酶的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
[16]根据[8]或[14]所述的转化植物细胞，其中所述透明质酸合成酶源自脊椎动物或微生物。
[17]根据[9]至[13]任一项所述的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述透明质酸合成酶源自脊椎动物或微生物。
[18]根据[8]或[14]所述的转化植物细胞，其中所述透明质酸合成酶源自小球藻病毒。
[19]根据[9]至[13]任一项所述的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述透明质酸合成酶源自小球藻病毒。
[20]由[8]或[14]所述的转化植物细胞或由[9]至[13]任一项所述的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织生产的透明质酸。
下面，对本发明进行更详细的说明。
本发明中，使用如下DNA对植物细胞或植物进行转化：编码透明质酸合成酶的DNA，或编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
透明质酸合成酶的来源并无特定限制，只要该合成酶以UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰葡糖胺作为底物合成的透明质酸具有由葡糖醛酸和乙酰葡糖胺重复结构构成的聚合物结构即可。例如可以使用源自人类、小鼠、兔、鸡、牛或爪蟾的透明质酸合成酶，属于链球菌属(Streptococcus)或巴斯德氏菌属(Passterurella)的细菌的透明质酸合成酶，源自小球藻病毒的透明质酸合成酶等。
在这些透明质酸合成酶中，源自小球藻病毒的透明质酸合成酶为特别优选。
透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入，并具有透明质酸合成活性的多肽，是发生了一定程度突变，然而没有丧失透明质酸合成活性的多肽，它包括两种多肽，一种是透明质酸合成酶的一部分，具有合成透明质酸的活性；另一种是透明质酸合成酶发生了氨基酸缺失、置换、添加或插入，并具有透明质酸合成活性的多肽。
作为透明质酸合成酶一部分并具有透明质酸合成活性的多肽是上述透明质酸合成酶中包含了发挥透明质酸合成活性所必需的氨基酸位点，缺失了非必需氨基酸位点而具有透明质酸合成活性的多肽。
作为透明质酸合成酶的氨基酸序列中发生了一个或多个氨基酸缺失、置换、添加或插入，并具有透明质酸合成活性的多肽的一个例子，是报道过的源自多杀巴斯德氏菌的透明质酸合成酶，该酶甚至在约270个似与跨膜或与膜相关的结构域对应的氨基酸残基缺失时仍具有透明质酸合成活性(Jing等，2000，Glycobiology，10，883-889)。
这种突变会自发发生，也包括人工诱变。发生突变的氨基酸数目并无限制，只要不丧失透明质酸合成活性即可。
本发明中，编码透明质酸合成酶的DNA或编码透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入形成的具有透明质酸合成活性的多肽氨基酸序列的DNA，并无特定限制，只要该DNA编码前述透明质酸合成酶或多肽，并且包括由于密码子简并性而具有的不同序列的DNA。
可任选地采用熟知的透明质酸合成酶基因作为此类DNA。例如可以使用源自人类、小鼠、兔、鸡、牛或爪蟾、链球菌属(Streptococcus)、巴斯德氏菌属(Passteurella)和小球藻病毒等的透明质酸合成酶基因。
更具体地，可采用源自人类的透明质酸合成酶基因(hHAS)HAS1、HAS2和HAS3，源自小鼠的透明质酸合成酶基因(mHAS)HAS1、HAS2和HAS3，源自鸡的透明质酸合成酶基因(gHAS)HAS1、HAS2和HAS3，源自大鼠的透明质酸合成酶基因(rHAS)HAS2，源自牛的透明质酸合成酶基因(bHAS)HAS2，源自爪蟾的透明质酸合成酶基因(xHAS)HAS1、HAS2和HAS3，源自多杀巴斯德氏菌的透明质酸合成酶基因(pmHAS)，源自酿脓链球菌的透明质酸合成酶基因(spHAS)，源自类马链球菌(Streptococcus equisimilis)的透明质酸合成酶基因(seHAS)和源自小球藻病毒PBCV-1的透明质酸合成酶基因(cvHAS)。
某些透明质酸合成酶基因(HAS)具有多种类型，如HAS1、HAS2和HAS3，这些类型并无特别限定。
在这些基因中，源自小球藻病毒的HAS基因特别适合应用。
本发明的转化子，换句话说，即被转化的植物细胞或被转化的植物是用表达重组载体转化植物或植物细胞制备的转化植物或植物细胞，该载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
本发明的转化植物细胞或转化植物可通过导入表达重组载体来获得，其中将(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有合成透明质酸的活性的多肽的DNA，插入到待转化的宿主中，以便目的基因得以表达。
此处所谓之宿主指任何植物全株、种子、植物器官(如叶、花、茎、根、块根等)、植物组织(如表皮部、韧皮部、薄壁组织、木质部和维管束等)，以及培养的植物细胞。
此处所谓之植物指多细胞植物，包括种子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物和地衣，包括植物全株的任何部分，种子、植物器官(如叶、花、茎、根、块根等)、植物组织(如表皮部、韧皮部、薄壁组织、木质部和微管束等)，以及培养的植物细胞。
由培养转化子生产的透明质酸通过转化和分离由转化子生产的透明质酸而获得。
可采用通常用于制备转化植物细胞或转化植物的载体作为上述表达重组载体。
此类载体并无特别限定，只要该载体包含能够在植物细胞中被转录的启动子序列，并包含使转录本得以稳定所需的多腺苷酸化的位点。例如质粒、“pBI121”、“pBI221”、“pBI101”、“pIG121Hm”等都可以采用。
当采用培养的植物细胞作为宿主时，可以通过导入表达重组载体进行转化，其中将(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有合成透明质酸的活性的多肽的DNA，借助电穿孔术、土壤杆菌的二元载体法或颗粒轰击法被插入到培养的植物细胞中。导入了表达载体的植物细胞可以根据对抗生素如卡那霉素的抗性来选择。转化植物细胞可以用于细胞培养、组织培养和器官培养，还可以用已知常用的植物组织培养方法繁殖植物。
经过转化的植物细胞的实例包括由烟草而来的BY-2细胞和T-13细胞，由胡萝卜而来的kurodagosun细胞，由葡萄而来的VR细胞和VW细胞，由美洲商陆(Phytolacca Americana L.)而来的PAR细胞、PAP细胞和PAW细胞，由拟南芥(Arabidopsis)而来的T87细胞，由芦笋而来的Asp86细胞、A.per细胞、A.pas细胞和A.plo细胞，由西瓜而来的Cba-1细胞，由西红柿而来的Sly-1细胞，由薄荷而来的1-Mar细胞，由马达加斯加长春花(Madagascar periwinkle)而来的CRA细胞和V208细胞，由大米草而来的Spi-WT细胞、Spi-WI-1细胞、Spi-12F细胞，由葫芦而来的Lcy-1细胞、LcyD6细胞和LcyD7细胞，由水稻而来的OS-1细胞，由长春花(Vinca rosea)而来的Vma-1细胞，由芝麻而来的PSB细胞、PSW细胞和PSG细胞，以及由鱼尾菊(Zinnia elegns)而来的ZE3细胞。
当用植物、植物器官或植物组织作为宿主时，通过导入表达重组载体进行转化，其中将(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有合成透明质酸的活性的多肽的DNA，借助土壤杆菌二元载体法或颗粒轰击法插入到采集的植物切片中，或借助电穿孔法插入原生质体中，再分离由转化而获得的瘤组织、茎干或根毛。
也可以直接利用按此法获得的瘤组织、茎干或根毛进行细胞培养、组织培养或器官培养。还可以用常规的已知植物组织培养方法，投给适当浓度的植物激素繁殖该植物。
要由导入了透明质酸合成酶基因的植物细胞繁殖植物，可将该植物细胞培养在再分化培养基中，或无激素的MS培养基中。该转基因植物可以通过将长出根的植物幼体转移到土壤中栽培来培育。繁殖(再分化)的方法，因植物细胞类型不同而不同，但可以任选地采用常用的植物组织培养方法。
例如Fujimura等的方法(Fujimura等，(1955)Plant Tissue CultureLett.，vol.2：p74)可以在水稻上应用；Shillito等的方法(Shillito等，Bio/Technology，vol.7：p581；Gorden-Kamm，1990，Plant Cell，2，603，1989)可以用在玉米上；Visser等的方法(Visser等，Theor.Appl.Genet，vol.78：p589，1989)可以用在土豆上；Nagata等的方法(Nagata等，Planta99，12，1971)可以用在烟草上；Akama等的方法(Akama等，Plant CellRep.，vol.12：p7)可以用在拟南芥上。
用这些方法培植的植物或具有相同性质的该植物的子代(繁殖媒介，例如由种子、块茎和切穗得到的植物)也是本发明的对象。
当具有透明质酸合成活性的酶在植物中表达，并进而在该植物中生产、积累或分泌透明质酸时，可优选地控制该透明质酸合成酶基因使透明质酸合成酶特异地在植物的合适组织或器官中表达。
为了进行这种控制，要进一步将组织特异或器官特异的启动子插入表达重组载体中。
器官特异的启动子的例子包括根特异启动子、块根特异启动子、叶特异启动子、种子特异启动子和茎特异启动子。
组织特异的启动子的例子包括绿色组织特异启动子。
更具体地，可应用的启动子是组成型高表达启动子，包括CaMV35S启动子，它是花椰菜花叶病毒的35S RNA的启动子。对绿色组织特异的启动子有编码核酮糖-1，5-二磷酸酯羧化酶的小亚基蛋白质的rbs基因的启动子，编码叶绿素a/b结合蛋白的CAB基因的启动子，编码戊二醛-3-磷酸酯脱氢酶A亚基蛋白质的GapA基因的启动子。对种子特异的启动子有脂肪氧合酶基因的LOX启动子，凝集素基因的Ps1启动子，以及淀粉酶基因的AmylA启动子。对根特异的启动子有天仙子胺6b-羟化酶基因的A6H6H启动子和腐胺N-甲基转移酶基因的PMT启动子。对茎特异的启动子有蔗糖合成酶Sus4基因的启动子和编码糖蛋白的马铃薯糖蛋白基因的启动子。
也考虑过用诱导性启动子控制透明质酸合成酶基因的表达。诱导性启动子的例子如下所述。
Prla启动子是与抗病有关的基因启动子，它的表达水平因创伤或加入水杨酸而增强，rd29A基因启动子的表达则因干旱、低温、高浓度盐或转化脱落酸而增强。由用作化学农药的化合物诱导表达的启动子，有编码谷胱甘肽转S酶的27kDa亚基蛋白的GST-27基因，它的表达被除草剂Safener诱导；被苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲基酯(BTH)诱导的激酶基因启动子和PR基因蛋白质启动子。另外，为了在植物细胞中更稳定地表达透明质酸合成酶基因，可以采用绝缘子，可以加入信号肽使透明质酸合成酶局限在目标细胞器中，而且透明质酸合成酶可以发生部分置换或缺失。
接受转化作用的植物包括所有能够导入基因的植物。
本发明中的植物或植物体包括被子植物中的单子叶和双子叶植物，以及裸子植物。这些植物包括任选的有用植物，特别是粮食作物、蔬菜植物、花卉植物和木材植物。
本发明中的植物或植物体也包括蕨类植物和苔藓植物。
用于本发明中的植物的种属具体包括属于以下各科的植物：茄科(Solanaceae)、禾本科(Gramineae)、十字花科(Cruciferae)、蔷薇科(Rosaceae)、豆科(Leguminosae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、百合科(Liliaceae)、藜科(Chenopadiaceae)、伞形科(Umbeliferae)、桃金娘科(Myrtaceae)和旋花科(Convolvulaceae)。
属于茄科的植物包括属于以下各属的植物：烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、曼陀罗属(Datura)、番茄属(Lycopersion)或矮牵牛属(Petunia)，包括诸如烟草、茄子、土豆、番茄、红辣椒和矮牵牛花等。
属于禾本科的植物包括属于以下各属的植物：稻属(Oryza)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、甘蔗属(Saccharum)、稗属(Echinochloa)或玉蜀黍属(Zea)，包括稻米、大麦、黑麦、圆果雀稗、玉蜀黍和玉米等。
属于十字花科的植物包括属于以下各属的植物：萝卜属(Raphanus)、芥属(Brassica)、拟南芥属(Arabudiosis)、山嵛菜属(Wasabia)或荠菜属(Capsella)，包括东方辣根、白菜、拟南芥、山嵛菜和酢浆草等。
属于蔷薇科的植物包括属于以下各属的植物：Orunus、苹果属(Malus)、梨属(Pynus)、草莓属(Fragaia)或蔷薇属(Rose)，包括诸如杏、桃、苹果、梨、草莓和玫瑰等。
属于豆科的植物包括属于以下各属的植物：大豆属(Glycine)、豇豆属(Vigna)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、蚕豆属(Vicia)、花生属(Arachis)、三叶草属(Trifolium)、苜蓿属(Alphalfa)或紫苜蓿属(Medicago)，包括诸如黄豆、赤豆、利马豆、豌豆、蚕豆、花生、三叶草和苜蓿草等。
属于葫芦科的植物包括属于以下各属的植物：丝瓜属(Luffa)、葫芦属(Cucurbita)或胡瓜属(Cucumis)，包括葫芦、南瓜、黄瓜和甜瓜等。
属于唇形科的植物包括属于以下各属的植物：熏衣草属(Lavadula)、薄荷属(Mentha)或紫苏属(Perilla)，包括熏衣草、薄荷和紫苏等。
属于百合科的植物包括属于以下各属的植物：葱属(Allium)、百合属(Lilium)或郁金香属(Tulipa)、包括诸如洋葱、蒜、百合和郁金香等。
属于藜科的植物包括属于菠菜属(Spinacia)的植物，包括例如大米草等。
属于伞形科的植物包括属于以下各属的植物：当归属(Angelica)、胡萝卜属(Daucus)、鸭儿芹属(Cryptotaenia)或旱芹属(Apitum)，包括独活、胡萝卜、野细叶芹、西芹等。
属于旋花科的植物包括属于甘薯属(Ipomoea)的植物，包括甘薯等。
与上述转化植物具有同样性质的其子代或其器官、组织也是本发明的对象。
本发明包括生产透明质酸合成酶的转化植物细胞。生产透明质酸合成酶的转化植物、与该植物具有同样性质的其子代或其器官、组织也包括在内。
生产透明质酸合成酶的转化植物细胞，可以通过用表达重组载体转化植物细胞获得，该载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入，并具有合成透明质酸的活性的多肽的DNA。
生产透明质酸合成酶的转化植物，可以通过用表达重组载体转化植物而获得，该载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入，并具有合成透明质酸的活性的多肽的DNA。
在该转化植物细胞或转化植物中，透明质酸合成酶基因的表达形式为具有透明质酸合成活性的酶。
利用具有透明质酸生产能力的转化植物细胞或转化植物，或利用生产透明质酸合成酶的转化植物细胞或转化植物，可在植物中生产透明质酸。
分离获得用转化植物细胞或转化植物生产的透明质酸的方法，包括下述数例方法。
培养转化植物细胞或转化植物，并在该植物中生产透明质酸，然后用已知常规方法即可任选地从该转化植物细胞或转化植物中提取透明质酸。
例如，采用转化植物时，则将该植物的干叶片经破碎后用适当溶剂提取。
将含有透明质酸的提取溶液过滤，获得不含植物细胞的透明质酸滤液。用渗滤法除去低分子量的杂质从而纯化溶液。可以用净化水对含有溶解透明质酸的滤液进行渗滤，然后连续地弃去滤液，从而分离出透明质酸。如果需要医药用的产品，要再进行溶液中的核酸沉淀操作。这一步骤可以通过加入氯化十六烷基吡啶鎓的季铵化合物等阳性表面活性剂来实现。
用本发明获得的透明质酸可以用作化妆品和医药或生物材料的组分。具体而言，这种透明质酸可以用作化妆品的保湿成分，或作为关节炎、风湿性关节炎、烧伤或割伤的治疗剂，或作为滴眼药的组分。
按照本发明，在植物中生产自然界植物不能生产的透明质酸。
按照本发明，透明质酸合成酶在植物中表达，进而在植物中生产透明质酸。
作为通过遗传操作生产蛋白质的宿主系统，通常可采用遗传修饰的植物、培养的植物细胞、源自微生物例如大肠杆菌和酵母菌的细胞、培养的哺乳动物细胞和遗传修饰的动物。然而，所有的系统都有优缺点，必须从目标重组蛋白的预期应用、性质和产量考虑，选择合适的系统。从植物以外的生产系统看，在大肠杆菌中，不存在蛋白质的加工过程，有可能形成包含体，其中存在的蛋白酶造成的降解也带来问题。在酵母菌中，糖链受到修饰，而这种修饰作用是酵母菌所固有的。当用微生物生产治疗用物质时，产品纯化的成本会非常昂贵，因为要防除内毒素的污染。对于哺乳动物细胞来说，则难于供养细胞，并需要昂贵的培养基。此外，也很难大规模生产，因为它的生长速率很低，另外还有污染病毒和癌基因的风险。采用遗传修饰的动物，则除供养问题外还存在伦理性问题。
同时，对于植物生产系统中培养的植物细胞和植物，存在开发期长和含有植物碱的问题，但是可以采用常规的农业生产系统，容易放大生产，也可大量廉价生产目标物质。也不需担心毒素和传染性病毒，而后二者是用微生物和哺乳动物细胞作宿主时要考虑的问题。因此，培养植物细胞和植物是有前途的物质生产系统。
本发明中用植物生产透明质酸的系统是有产业化优势的生产系统，因为安全性更高而成本和能荷比用哺乳动物或微生物细胞的常规生产系统要小。
迄今在植物生产系统中，即使是表达源自哺乳动物和微生物细胞的蛋白质，由于遗传背景不同，并没有保持所需的构象和糖链结构，因而生产的蛋白质常常没有其原有的功能。按照惯例，源自哺乳动物和微生物细胞的蛋白质是在植物中表达，并将蛋白质提取出来供使用。然而，几乎还没有报道过象本发明所述技术，即源自哺乳动物和微生物细胞的蛋白质(酶)在植物中表达，并利用在植物中表达的该酶在植物中生产产品。曾经有报道称，重组有源自人类的糖基转移酶的植物中天然存在的糖链结构中的糖结构发生了转换。在这种情况下，植物中天然产生的糖链结构发生了改变。
象本发明中这样，在植物中生产植物完全不生产的物质如透明质酸的实例，还从未有过。此外，更没有在植物中生产象透明质酸这样的由两种糖类按一定顺序成千次重复排列构成的大分子物质的实例。
透明质酸合成酶一般具有多个跨膜或与膜相关结构域。当像透明质酸合成酶这样的外来性膜结合蛋白在宿主中表达时，经常不能保持跨膜或与膜相关结构域的正常构象。特别是有人认为，在有活性的透明质酸合成酶中，每个透明质酸合成酶蛋白质分子与通常存在于膜上的大约14-18个磷脂化合物心磷脂分子形成复合物以影响透明质酸合成酶的活性。因此，本发明中，植物中天然不存在的透明质酸合成酶在植物中被表达，并且保持着能生产透明质酸的构象，这是超出常规预期的。
这样，本发明中生产透明质酸的植物是按常规技术观念无法预测的技术，并且在产业上有极其有利的效益。
为实施发明的最佳方式
本发明将通过以下实例作更具体的描述，但该发明并不仅限于此。
实例
1源自小球藻病毒的透明质酸合成酶基因的分离
为了用PCR分离小球藻病毒透明质酸合成酶基因(cvHAS)制备了PCR引物。引物的设计参考了已知的小球藻病毒基因组的序列信息(Kutish等1996，Virology，223，303-317)(Li等1995，Virology，212，134-150)(Li等1997，Virology，237，360-377)(Lu等.1995，Virology，206，339-352)(Lu等.1996，Virology，216，102-123)和小球藻病毒透明质酸合成酶基因的鉴定信息(DeAngelis等，1997，Science，278，1800-1803)，并通过加入为导入表达载体所需的限制性酶切位点进行了制备。作为限制性酶切位点，将NdeI位点加进了5’-引物，XbaI位点加进了3’-引物。
5’-引物(序列ID No：3)
5’-GCC GCC GCA TAT GGG TAA AAA TAT AAT CAT AATGGT TTC G-3’
3’-引物(序列ID No：4)
5’-CTT GCA GTC TAG ATC ACA CAG ACT GAG CAT TGG TAG-3’
小球藻病毒毒株CVHI1和毒株CVKA1(由广岛大学高等物质科学研究生院分子生物工程系Takashi Yamada教授提供)的基因组DNA被用作模板。
用KOD-plus-(东洋纺织)作多聚酶进行PCR，反应程序是在94℃持续2分钟，2个循环(94℃ 15秒、40℃ 30秒、68℃ 1分钟)，和25个循环(94℃ 15秒，60℃ 30秒，68℃ 1分钟)。所得到的PCR片段被插入到经修饰的大肠杆菌表达载体(经修饰的pBS)中，从而使pBluescript II KS(+)(缩写为pBS)的β-半乳糖苷酶基因的起始密码子ATG位点是NdeI位点。用DNA序列仪测定该插入片段的DNA序列，得到源自毒株CVHI1的透明质酸合成酶基因cvHAS-HI的序列(序列ID No：1)和源自毒株CVKA1的透明质酸合成酶基因cvHAS-KA的序列(序列ID No：2)。
2.cvHAS在大肠杆菌中的表达及其提取
在含有50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基(LB：10g/L聚胨，5g/L酵母膏和5g/L NaCl)中37℃过夜培养携带了cvHAS-HI或cvHAS-KA的大肠杆菌JM109，接种到50mL(1∶100)含有50μg/ml氨苄青霉素、0.2％葡萄糖和0.3mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的新鲜LB培养基中。在20℃进行72小时IPTG诱导。离心收集IPTG诱导的细胞，再悬浮在30mL缓冲液(含有20mM Tris-HCl(pH7.5)，0.2M NaCl，1mM EDTA，1mM苄脒和1mM 2-巯基乙醇(2-ME))中，进行匀化。离心(12,000rpm，20分钟)破碎了的微生物细胞抽提含有cvHAS的膜组分，上清液进行超速离心(X 100,000g，1小时)，再悬浮在200μL缓冲液(成分同上)中制成cvHAS提取液。
2cvHAS活性测定
合成透明质酸的活性，用在大肠杆菌中生产的cvHAS提取液体外合成透明质酸，并测量反应混合液中透明质酸浓度来表示。体外合成透明质酸的反应混合液含有100mM Tris-HCl(pH 7.0)，40mM MgCl2，0.2mM EGTA，20mM 2-ME，0.1％ BSA，2mM UDP-GlcA，2mM UDP-GlcNAc，20％甘油和10μL HAS提取液，将总体积调整到50μL，37℃反应2小时、4小时和20小时(O/N)。将反应混合液在90℃加热3分钟终止反应。离心反应混合液，上清液用来测定透明质酸。
采用透明质酸测定板“Chugai”(Fujirebio公司)来测定透明质酸。该平板采用透明质酸结合蛋白作为测定透明质酸的试剂。
透明质酸测定板“Chugai”(Fujirebio公司)是采用透明质酸结合蛋白形成夹层(sandwich)型结合的透明质酸定量方法。样品中的透明质酸与固定在微滴定板上的透明质酸结合蛋白相结合，再结合经酶标记的透明质酸结合蛋白，形成夹层。然后加入四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢，TMB被作为标记酶的过氧化物酶氧化而产生颜色。加入反应终止液，样品中的透明质酸浓度可以用酶标仪以620nm波长作对照，在450nm波长测定光吸收(A450)来定量。
用试剂盒随带的标准透明质酸溶液制作标准曲线，将样品的光吸收值(ΔA450)减去不含透明质酸的模拟溶液(Mock)的光吸收值，即可确定样品中含有的透明质酸的浓度。表1所述为透明质酸的浓度(HA浓度，ng/mL)。
要获得透明质酸合成酶活性的数值，按下述计算方法换算光吸收值，透明质酸的合成量以摩尔表示。标准透明质酸的光吸收值(浓度为100ng/mL)为A，每个样品的光吸收值为B。反应液总量为50μL。然后按下式计算各透明质酸合成酶的活性：
B×100ng/mL/A×50μL/1000＝C ng/反应时间。
透明质酸的组成单位(GlcA-Glc NAc)的分子量是398.35，因此，(GlcA-Glc NAc)n的分子量可用398.5×n-18×(n-1)表示。这样，当n＝10时，(GlcA-Glc NAc)10的分子量则398.8×10-18×(10-1)＝3821.5Da。
因此，每个反应时间段整合到透明质酸中的GlcA分子可按下述计算：C/3821.5×n(n＝10)×100＝D pmol
提取液中的蛋白质浓度用BSA作标准蛋白，以Bio-Rad蛋白质检测试剂(Bio-Rad)测定。结果在表1中以蛋白质量表示。
在表1中，将透明质酸合成酶的活性表示为HAS活性，其通过计算对透明质酸提取液中所含的每1mg蛋白，每合成一小时整合到透明质酸中的GlcA分子数(pmol)而获得。
表1中，模拟(Mock)表示从用不含有透明质酸合成酶基因的载体转化的大肠杆菌中提取的溶液。用带有源自酿脓链球菌的透明质酸合成酶基因的载体转化的大肠杆菌，其透明质酸合成酶提取液用spHAS表示。用带有源自小球藻病毒毒株CVKA1的透明质酸合成酶基因的载体转化的大肠杆菌，其透明质酸合成酶提取液用cvHAS-KA表示。重复两次获得的结果分别用cvHAS-KA1和cvHAS-KA2表示。用带有源自小球藻病毒毒株CVHI1的透明质酸合成酶基因的载体转化的大肠杆菌，其透明质酸合成酶提取液用cvHAS-HI表示。重复两次获得的结果分别用cvHAS-HI1和cvHAS-HI2表示。
HAS活性的表示方法与以下作者表示的方法相同：JP 200-4886A，tano，N.和Kimata，K.(1996)J.Biol.Chem.，271，9875-9878；Tlapak-Summons.L等，(1999)J.Biol.Chem.，274，4246-4253。
表1cvHAS在大肠杆菌中的表达分析
样品   反应时间(小时)   A450(平均数)   ΔA450   HA浓度(ng/ml)   HA浓度((pmol-GlcA)   蛋白质含量*   HAS活性(pmol/mg蛋白/h)
  模拟(Mock)   24   0.0350.059   --   --   --   --   --
  spHAS   24   0.0620.122   0.0270.063   14.233.2   5,31212,395 3.12   851993
  cvHAS-KA1   24O/N   0.0450.0900.231   0.0100.0310.172   5.316.390.5   1,9676,09933,841 2.31   426660732
  cvHAS KA2   24O/N   0.0450.0800.232   0.0100.0210.173   5.311.191.1   1,9674,13234,038 2.07   475499822
  cvHASHI1   24O/N   0.0940.1500.117   0.0590.0910.058   31.147.930.5   11,60817,90411.411 1.86   3,1202,4061,534
  cvHASHI2   24O/N   0.0570.1060.271   0.0220.0470.212   11.624.7111.6   4,3289,24741,711 1.72   1,2581,3441,213
如表1结果所示，证实了分离的基因产物具有透明质酸合成酶的活性。
4植物表达载体的构建
采用经PCR添加了限制性酶切位点的PCR引物，用上述实例3中制备的并证实有HAS活性的含有cvHAS-HI或cvHAS-KA的质粒DNA作为模板，对cvHAS-HI和cvHAS-KA的片段进行PCR扩增。作为5’-PCR引物，设计了在修饰的pBS序列上加入限制性酶切位点DraI的引物，作为3’-PCR引物，则采用在修饰的pBS的多克隆位点中含有限制性酶切位点ScaI的区域。
5’-引物(序列ID No：5)
5’-GTG TGG AAT TTA AAG CGG ATA ACA ATT TCA CACAGG-3’
3’-引物(序列ID No：6)
5’-GGG CGA ATT GGA GCT CCA CCG CGG-3’
然后，用SmaI和ScaI消化pBI121，用DraI和ScaI消化待插入的cvHAS，从而将cvHAS插入用于转化植物的载体pBI121中(Jefferson等，1987，EMBO J，6，3901-3907)，由此得以制备含有cvHAS-HI的质粒pBI121(pBI121cvHI)和含有cvHAS-KA的质粒pBI121(pBI121cvKA)。
5.电穿孔感受态细胞的制备
为制备电穿孔感受态细胞，取根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404菌株的单菌落接种在5mL LB培养基中，在28℃振荡培养过夜。将此培养物接种在500mL LB培养基中，在28℃振荡培养，直到培养液浊度在600nm波长下达到0.5。离心(5000rpm，10分钟，4℃)培养液收集微生物细胞，除去上清液。加入500mL无菌水悬浮洗涤微生物细胞，再离心(5000rpm，10分钟，4℃)收集微生物细胞，除去上清液。重复两次上述操作。然后加入20mL冷的10％无菌甘油溶液到沉淀中，从而悬浮微生物细胞，离心(5000rpm，10分钟，4℃)收集微生物细胞，除去上清液。再加入3mL冷的10％无菌甘油溶液到沉淀中，从而悬浮微生物细胞，将其分装在1.5mL的离心管中，每管40μL，在液氮中冷冻，保存于-80℃下。
6.将cvHAS-HI和cvHAS-KA导入土壤杆菌LBA4404菌株中
制备质粒DNA pBI121cvHI或pBI121cvKA，并用电穿孔法将其导入根瘤土壤杆菌LBA4404菌株中。用40μL为进行电穿孔准备的根瘤土壤杆菌LBA4404菌株的感受态细胞，与1μL表达质粒(200μg/mL)混合，所得悬浮液注入预先置冰中冷却的、电极间距离为1mm的小杯中，施加脉冲电场(1.8kV，25μF，200Ω)。立即加入500μL SOC，将细胞在28℃培养3小时。然后将培养物涂布在含有卡那霉素的LB平板培养基中，25℃培养3天，获得携带了pBI121cvHI或pBI121cvKA的土壤杆菌细胞。
7.用携带了pBI121cvHI或pBI121cvKA的土壤杆菌LBA4404菌株侵染培养的烟草细胞(BY-2)
采用烟草(Nicotiana tabacum L)cv Bright Yellow2(有时缩写为BY-2，Nagata等，1981，Mol Gen Genet，184，161-165)作为用于转化的培养烟草细胞。烟草BY-2细胞按Nagata等的方法(Nagata等，1981，Mol GenGenet，184，161-165)，采用改良LS(Linsmaier和Skoog)培养基(Linsmaier和Skoog，1965，Phsiol Plant，18，100-127)进行培养，其中KH2PO4和硫胺素HCl的浓度分别增加为370mg/L和1mg/L，加入蔗糖使其最终浓度为3％，并加入2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)使其最终浓度为0.2mg/L。
烟草BY-2细胞的转化基本上按An的方法(An，1985，PhsiolPlant，79，568-570)进行。在5mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，28℃过夜培养携带了pBI121cvHI或pBI121cvKA的土壤杆菌培养物(100μL)，与4mL培养4天的烟草BY-2细胞悬液置于陪替氏培养皿中，充分混合并置暗处在25℃共同培养2天。为除去土壤杆菌，将陪替氏培养皿中的培养液转移至50mL离心管中，再加入20mL含有100mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素的改良LS培养液，离心(1000rpm，4分钟)除去上清液。立即加入25mL新鲜的改良LS培养液，离心(1000rpm，4分钟)洗涤细胞。此操作重复3次。将除去土壤杆菌的培养细胞转移到含有100mg/L卡那霉素、250mg/L羧苄青霉素和0.3％结冷胶的改良LS培养液中，在暗处培养。3周以后，将愈伤(callused)细胞转移到新的平板中，挑选生长的克隆。最后，将克隆转移到含有100mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素的30mL改良LS培养液中，并进行液体培养。
8.用培养细胞生产cvHAS并提取
150mL在改良LS培养液中培养7天的烟草BY-2细胞经离心(1000rpm，20分钟)从培养液中分离。细胞悬浮在30mL缓冲液(含有20mMTris-HCl，pH 7.5，0.2M NaCl，1mM EDTA，1mM苄脒和10mM 2-ME)中，并进行匀化。对破碎了的微生物细胞进行离心(12,000rpm，20分)，并超速离心(100,000g，1小时)上清液，从而提取含cvHAS的膜组分，将其重悬浮于300μL缓冲液(含有20mM Tris-HCl，pH 7.5，0.2M NaCl，1mM EDTA，1mM苄脒和10mM 2-ME)中制备成cvHAS提取液。
9.培养细胞生产透明质酸的定量
上述细胞培养后从细胞分离出的培养液、cvHAS提取液，以及经透明质酸酶处理过的cvHAS提取液，用作定量测定烟草BY-2细胞生产透明质酸的样品。两个分别携带有cvHAS-HI和cvHAS-KA的烟草BY-2细胞的细胞株用于测定。用冷冻干燥法将分离出细胞的培养液浓缩2倍。采用源自公牛睾丸的透明质酸酶(Sigma)，将其溶解在含有150mM NaCl的、浓度为100mg/L的100mL磷酸缓冲液(pH 5.3)中，将该酶溶液加入至cvHAS提取液中，37℃孵育4小时，从而进行透明质酸酶的消化作用。然后在90℃加热3分钟，离心(12,000rpm，10分钟)，上清液用于定量测定透明质酸。透明质酸用透明质酸平板“Chugai”(Fujirebio公司)进行定量，结果见表2。
在表2中，用含有源自小球藻病毒CVKA1的透明质酸合成酶基因的载体转化的BY-2的样品以cvHAS-KA表示，重复两次获得的结果分别以cvHAS-KA1和cvHAS-KA2表示；用含有源自小球藻病毒CVKHI1透明质酸合成酶基因的载体转化的BY-2的样品以cvHAS-HI表示，重复两次获得的结果分别以cvHAS-HI1和cvHAS-HI 2表示；透明质酸平板“Chugai”(Fujirebio公司)附带的标准透明质酸溶液写作“标准品透明质酸”。括号中的浓度表示标准透明质酸溶液中的透明质酸浓度。
表2培养细胞生产透明质酸的定量
  样品   A450   透明质酸浓度(ng/mL)
  培养液   cvHAS-HI1   0.824   2,035
  cvHAS-HI2   0.672   1,655
  cvHAS-KA1   0.654   1,610
  cvHAS-KA2   0.903   2,233
  CvHAS提取液   cvHAS-HI1   0.332   805
  cvHAS-HI2   0.300   725
  cvHAS-KA1   0.285   688
  cvHAS-KA2   0.357   868
  用透明质酸酶消化后的cvHAS提取液   cvHAS-HI1   0.013   -
  cvHAS-HI2   0.013   -
  cvHAS-KA1   0.010   -
  cvHAS-KA2   0.010   -
  标准品透明质酸
  0ng/mL   0.010   -
  100ng/mL   0.042   -
  200ng/mL   0.080   -
  500ng/mL   0.187   -
如表2中所示，证明各烟草BY-2细胞系均生产有透明质酸。
10.培养细胞生产的cvHAS活性测定
合成透明质酸的活性，用在植物细胞培养液中生产的cvHAS提取液体外合成透明质酸，并测量反应液中透明质酸浓度来进行测定。为了进行透明质酸的体外合成，将含有100mM Tris缓冲液、40mMMgCl2，0.2mM EGTA，20mM 2-巯基乙醇，0.1％ BSA，2mM UDP-GlcA，2mM UDP-GlcNAc，20％甘油和10μL HAS提取液混合，将反应混合液总体积调整到50μL，在37℃反应0至2小时。反应后，将反应混合液在90℃加热3分钟终止反应。离心该反应混合液，上清液用于测定透明质酸。采用透明质酸测定板“Chugai”(Fujirebio公司)通过透明质酸结合蛋白测定透明质酸。HAS提取液中的蛋白质浓度用BSA作标准蛋白质，以Bio-Rad蛋白质检测试剂(Bio-Rad)测定。结果在表3中表示。
表3烟草BY-2细胞生产的cvHAS活性测定
样品   反应时间(小时)   A450(平均数)   ΔA450   HA浓度(ng/ml)   HA浓度(pmol-GlcA   蛋白质含量*  HAS活性(pmol/mg蛋白/h)
  cvHAS-HI 1   02   0.3320.475 0.143 358 133,829 24.2 2,765
  cvHAS-HI2   02   0.3000.403 0.103 258 96,477 14.8 3,258
  cvHAS-KA1   02   0.2850.475 0.190 475 177,567 32.8 2,707
  cvHAS-KA2   02   0.3570.483 0.126 315 177,755 25.0 2,355
如表3结果所示，证实了细胞中生产的cvHAS，包括cvHAS-HI和cvHAS-KA均具有合成透明质酸的活性。并且认为，其他来源的透明质酸合成酶也可在植物细胞中合成透明质酸。
11.转化的培养烟草细胞生产的含透明质酸部分的制备
在含有卡那霉素(100mg/L)、羧苄青霉素(250mg/L)的改良LS培养基中培养10天的转化BY-2细胞悬浮液(150mL)经离心(1000rpm，20分钟)，收集上清液。培养液经超滤(amicon YM-10)浓缩到大约1/4，随后加入2倍量的乙醇，离心收集沉淀。已经证实，将沉淀溶解在水中获得了含有透明质酸的部分，用透明质酸测定板检测溶解状态的透明质酸。取等体积的透明质酸酶溶液加入至含有透明质酸的部分，以最终为2kU/mL的浓度在37℃开始透明质酸酶反应，所述透明质酸酶溶液为将源自公牛睾丸的透明质酸酶(Sigma)溶解于含150mM NaCl的100mM磷酸盐缓冲液(pH5.3)中而获得。一定时间段后，反应混合液在95℃加热20分钟终止反应。离心反应混合液获得上清液，对上清液进行高效液相色谱(HPLC)分析。HPLC基本按照Tawada等的方法(Tawada等，2002，Glycobiology，12，421-426)，取50μL样品，采用氨基柱YMC-Pack NH2(4.6mm×15cm)，以恒定流速(1mL/min)，在50℃用30分钟线性梯度的20-500mM NaH2PO4作为流动相，用UV(210nm)检测。图1是透明质酸酶消化后生产的透明质素寡聚糖混合物的HPLC图谱。
开始反应1小时后检测到多糖峰，推测其对应于透明质酸酶消化生产的低分子量透明质酸混合物。随着透明质酸酶处理时间的推移，低分子量透明质酸混合物的分子量向低分子量一侧移动，开始反应24小时后，初期出现的混合物峰大部分消失，只检测到反应终产物四糖和六糖。这种随透明质酸酶处理时间推移观察到的寡糖降解方式，和透明质酸酶降解已知透明质酸的方式相同，说明从BY-2细胞培养液中获得的组分含有高分子量透明质酸。
12用含有pBI121cvHI或pBI121cvKA的土壤杆菌LBA4404菌株侵染烟草
烟草(Nicotiana tabacum L)的转化，采用土壤杆菌按叶片法(leafdisc method)进行(Plant Biotechnology II，Yasuyuki Yamada和Yoshimi Okada，等编，Tokyo Kagaku Dojin，1991)。灭菌的烟草叶片在含有pBI121cvHI或pBI121cvKA的土壤杆菌培养液中浸泡3分钟，所述土壤杆菌在含50mg/L卡那霉素的5ml LB培养液中于28℃过夜培养。然后将多余的微生物细胞在滤纸上除去。然后将叶片放在分化培养液中，该培养液是在MS(Murashige和Skoog)无机盐(Murashige和Skoog，1962，Physiol.Plant，15，473)培养液中加入了3％蔗糖、维生素B5、1mg/L苄胺基嘌呤、1mg/L乙酸萘和0.3％结冷胶，并调节pH为5.7，在暗处于28℃放置2天。用无菌水洗涤被侵染的叶片3次，在滤纸上吸干多余的水。然后将叶片放在含有卡那霉素(100mg/L)和claforan(250mg/L)的分化培养基上，于25℃光照16小时诱导形成愈伤组织。开始诱导起3周后，选择形态正常的苗(shoot)，在长有茎和叶的情况下切出，转移到含有卡那霉素(100mg/L)和claforan(250mg/L)的生根培养基中(MS无机盐、3％蔗糖、维生素B5、0.3％结冷胶，pH为5.7)，于25℃光照16小时诱导生根。2周后，长根后的苗转移到新鲜的生根培养基上，得到多个长有茎叶的株系。
13.转化烟草生产的透明质酸的定量
将来自上述用土壤杆菌感染获得的转化烟草的6个株系的叶片(约100mg)转移到2mL试管中，悬浮在200μL缓冲液中(含有20mM Tris-HCl pH 7.5，0.2M NaCl，1mM EDTA和10mM 2-ME)，再加入400mg氧化锆小珠(直径2mm)。用小型球磨机(和研药BS-12型)振荡和搅拌(2500rpm，5分钟)试管，研磨烟草叶片。离心(15,000rpm，10分钟)研磨后的溶液，收集上清液即为粗抽提液。将粗抽提液稀释10倍作为测定样品。用透明质酸测定板“Chugai”(Fujirebio公司)对透明质酸进行定量。结果如表4所示。用来自烟草野生株和模拟(mock)(以pBI121转化的烟草)的叶片进行同样的研磨处理，作为对照。由于在cvHAS-KA转化的一个株系中，明显的检测到透明质酸，也确认在通过转化获得的烟草植物中也生产透明质酸。
表4转化烟草生产的透明质酸的定量
  样品   A450   透明质酸浓度(ng/mL)
  CvHAS-HI3 No.1   0.062   0
  CvHAS-HI3 No.2   0.054   0
  CvHAS-HI3 No.3   0.054   0
  CvHAS-HI3 No.4   0.052   0
  CvHAS-KA1 No.1   0.083   0
  CvHAS-KA1 No.2   0.780   4,211
  模拟(Mock)   0.068   0
  野生株   0,057
  标准透明质酸(0ng/mL)   0.055   -
  标准透明质酸(20ng/mL)   0.090   -
  标准透明质酸(50ng/mL)   0.254   -
  标准透明质酸(100ng/mL)   0.337   -
  标准透明质酸(200ng/mL)   0.566   -
  标准透明质酸(500ng/mL)   0.840   -
14.转化烟草中cvHAS转录的鉴定
从上述用土壤杆菌侵染获得的转化烟草的6个株系的叶片中提取总RNA。总RNA的提取用Rneasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN)，按其附带的实验指导进行。将叶片(100mg)放在用液氮充分冷却的研钵中，在液氮中用研杵研磨成粉状。立即将研磨的细胞悬浮在450μL含有1％2-巯基乙醇的RFT缓冲液中，用旋涡混合器搅匀。将此研磨液转移到QIA研磨机的自旋柱中，离心除去细胞碎片和组织匀浆。在研磨液的离心上清液中加入半倍量的乙醇，转到Rneasy Mini柱中。然后根据操作规程，顺序进行洗涤和洗脱，用以抽提总RNA。用来自烟草野生株和模拟(mock)(以pBI121转化的烟草)的叶片进行同样的研磨处理，作为对照。
然后，用上述总RNA作为模板进行RT-PCR。根据实验规程，第一条cDNA链用Rever Tra Ace-α-(东洋纺织)由1μg上述总RNA和随机引物合成。用第一条cDNA链作为模板，用KOD Dash DNA聚合酶(东洋纺织)作为聚合酶，按30个循环程序(95℃ 30秒，59℃ 2秒，74℃ 30秒)进行PCR。用5’-引物(序列ID No：3)和3’-引物(序列ID No：4)作为引物。图2表示用DNA的琼脂糖凝胶电泳进行转化烟草叶片中cvHAS的RT-PCR分析结果。只在cvHAS-KA的一个株系中检测到具有相应尺寸的清晰的扩增带，该株系是在用cvHAS转化的烟草株系中观察到生产透明质酸的株系，cvHAS基因的转录作用由此得以鉴定。
序列表
<110>东洋纺织株式会社(TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA)
<120>透明质酸合成酶(Hyaluronic Acid Synthase)
<130>SCT060215-25
<150>JP2003-204896
<151>2003-07-31
<150>JP2004-89135
<151>2004-03-25
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1707
<212>DNA
<213>小球藻病毒(Chlorella virus)
<400>1
atgggtaaaa atataatcat aatggtttcg tggtacacca tcataacttc aaatctaatc    60
gcggttggag gagcctctct aatcttggct ccagcaatta ctgggtatat tctacattgg    120
aatattgctc tctcgacaat ctggggagta tcagcttatg gtattttcgt ttttggtttt    180
ttccttgcac aagttttatt ttcagaactg aacaggaaac gtcttcgcaa gtggatttct    240
ctcagaccta agggttggaa tgatgtccgt ttggctgtga tcattgctgg ataccgcgaa    300
gatccctata tgttccaaaa gtgtctcgag tcagtgcgtg actctgacta cggtaacgtt    360
gctcgtctca tttgtgttat tgacggcgat gacgacgctg atatgaagat gtccgatgtt    420
tacaagacga tctacaacga taatatcaag aagcccgagt ttgtcttgtg tgagtcagac    480
gacaaggaag gtgaacgcat cgactctgat ttctctcgcg acatttgtgt tctccagcct    540
caccgtggca agagggagtg tctctatact ggtttccaac ttgcaaagat ggaccccagt     600
gtcaacgccg tcgttttgat tgacagcgat actgttctcg agaaggatgc tattctggaa     660
gttgtatacc cacttgcatg cgatcctgag atccaagccg tcgcaggtga gtgtaagatt     720
tggaacacag acactctttt gagtcttctc gtcgcttggc ggtactattc tgcgttttgt     780
gtggagagga gtgcccagtc ttttttcagg actgttcagt gcgttggggg cccgctgggt     840
gcctacaaga ttgatatcat taaggagatt aaggacccct ggatttccca gcgctttctt     900
ggtcagaagt gtacttacgg tgacgaccgc cggctaacca acgagatctt gatgcgtggt     960
aaaaaggttg tgttcactcc atttgctgtt ggttggtctg acagtccgac caatgtgttt     1020
cgatacatcg ttcagcagac ccgctggagt aagtcgtggt gccgcgaaat ttggtacacc     1080
ctcttcgccg cgtggaagca cggtttgtct ggaatttggc tggcctttga atgtttgtat     1140
caaattacat acttcttcct cgtgatttac ctcttttctc gcctagccgt tgaggccgac     1200
cctcgctccc agacagccac agtgattgtg agcaccacgg ttgcattgat taagtgtggg     1260
tatttttcat tccgagccaa ggatattcgg gctttttact ttgtgcttta tacatttgtt     1320
tactttttct gtatgattcc ggccagggtt actgcaatga tgacgctttg ggacattggc     1380
tggggtactc gcggtggaaa cgagaagcct tccgttggca cccgggtcgc tctgtgggca     1440
aagcaatatc tcattgcata tatgtggtgg gccgcggttg ttggcgctgg agtttacagc     1500
atcgtccata actggatgtt cgattggaat tctctttctt atcgttttgc tttggttggt     1560
atttgttctt acattgtttt tattactatt gtgctggtga tttatttcac cggcaaaatt     1620
acgacttgga atttcacgaa gcttcagaag gagctaatcg aggatcgtgt tctgtacgat     1680
gcatctacca atgctcagtc tgtgtga                                         1707
<210>2
<211>1707
<212>DNA
<213>小球藻病毒(Chlorella virus)
<400>2
atgggtaaaa atataatcat aatggtttcg tggtacacca tcataacttc aaatctaatc     60
gcggttggag gagcctctct aatcttggct ccagcaatta ctggatatat tctacattgg     120
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gcatctacca atgctcagtc tgtgtga                                        1707
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
gccgccgcat atgggtaaaa atataatcat aatggtttcg                          40
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
cttgcagtct agatcacaca gactgagcat tggtag                                36
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
gtgtggaatt taaagcggat aacaatttca cacagg                                36
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gggcgaattg gagctccacc gcgg                                             24

Claims (20)

1.生产透明质酸的方法，该方法包括(1)用表达重组载体转化植物细胞的步骤，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA，(2)培养通过转化获得的转化子的步骤，(3)分离由转化子生产的透明质酸的步骤。
2.生产透明质酸的方法，该方法包括(1)用表达重组载体转化植物的步骤，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA，(2)培养通过转化获得的转化子的步骤，(3)分离由转化子生产的透明质酸的步骤。
3.制备具有透明质酸生产能力的转化植物细胞的方法，该方法包括用表达重组载体转化植物细胞的步骤，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
4.制备具有透明质酸生产能力的转化植物的方法，该方法包括用表达重组载体转化植物的步骤，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其中的表达重组载体是包含：(1)(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA，和(2)器官特异或组织特异的启动子的表达重组载体，并且最终得到的转化植物是能够生产器官特异或组织特异的透明质酸的转化植物。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述透明质酸合成酶是源自脊椎动物或微生物的透明质酸合成酶。
7.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述透明质酸合成酶是源自小球藻病毒的透明质酸合成酶。
8.用表达重组载体转化植物细胞获得的具有透明质酸生产能力的转化植物细胞，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
9.用表达重组载体转化植物获得的具有透明质酸生产能力的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
10.根据权利要求9所述的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述植物是选自被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物的植物。
11.根据权利要求9所述的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述器官是选自根、茎、块茎、叶、花、块根、种子和茎尖的一种、两种或多种器官。
12.根据权利要求9所述的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述组织是选自表皮部、韧皮部、薄壁组织、木质部及维管束的一种、两种或多种组织。
13.根据权利要求9所述的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述表达重组载体是包含：(1)(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA，和(2)器官特异或组织特异的启动子的表达重组载体，并且最终得到的转化植物是能够生产器官特异或组织特异的透明质酸的转化植物。
14.用表达重组载体转化植物细胞获得的生产透明质酸合成酶的转化植物细胞，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
15.用表达重组载体转化植物获得的生产透明质酸合成酶的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，所述表达重组载体包含(i)编码透明质酸合成酶的DNA或(ii)编码具有该透明质酸合成酶的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、置换、添加或插入的氨基酸序列的，并具有透明质酸合成活性的多肽的DNA。
16.根据权利要求8或14所述的转化植物细胞，其中所述透明质酸合成酶源自脊椎动物或微生物。
17.根据权利要求9至13任一项所述的转化植物、或与该植物有相同性质的其后代、其器官或其组织，其中所述透明质酸合成酶源自脊椎动物或微生物。
18.根据权利要求8或14所述的转化植物细胞，其中所述透明质酸合成酶源自小球藻病毒。
19.根据权利要求9至13任一项所述的转化植物、或与该植物有同样性质的其后代、其器官或其组织，其中所述透明质酸合成酶源自小球藻病毒。
20.由权利要求8或14所述的转化植物细胞或由权利要求9至13任一项所述的转化植物、或与该植物有同样性质的其后代、其器官或其组织生产的透明质酸。
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