CN111837689A

CN111837689A - 调控百合萜类化合物含量的方法

Info

Publication number: CN111837689A
Application number: CN202010530599.5A
Authority: CN
Inventors: 孙明; 石雪珺; 李萍; 郭彦宏; 张腾旬; 钟剑; 张启翔; 程堂仁
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111837689B

Abstract

本发明提供一种调控百合萜类化合物含量的方法。所述调控为下调。该方法包括：使百合与BTH接触。本发明通过不同浓度的外源BTH瓶插液处理百合，显著抑制了百合单萜类物质的释放，且BTH处理后的百合花被片的单萜类物质代谢路径中的主要三个关键酶基因LiDXS、LiDXR和LiTPS的表达量在BTH的处理下均有下降。通过下调相关基因和减少萜类物质的释放，最终达到调节百合花香浓度的需求。

Description

调控百合萜类化合物含量的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种调控百合萜类化合物含量的方法。

背景技术

花香是植物花器官产生的具有芳香气味的挥发性有机化合物(Volatile OrganicCompounds,VOCs)，一般多是低分子量的亲脂性混合物，能刺激人类的嗅觉细胞产生愉悦感，是很多花卉的重要观赏性状，但有时香气过浓会导致人体产生不适，引起某些自主性神经反应，如呼吸频率发生变化，血压波动，心跳紊乱或出汗异常等现象(Ilmberger et al.,2001；Bensafi et al.,2002；Li et al.,2012)。

百合(Lilium spp.)是世界著名的切花和盆花花卉，品种丰富，有不同花香浓度和香型，如东方百合花香浓郁，亚洲百合几乎没有香味。东方百合杂种系(Oriental hybrids)是切花市场上最为常见的系列之一，花大香浓是其突出特点，但在室内小空间应用时其浓郁的香气常给人带来一定程度的不适。研究表明，处于盛花期的百合‘西伯利亚’(L.‘Siberia’)的挥发物在5min内可使被试者的皮肤电反应值(Galvanic Skin ResponseValue,GSR Value)出现显著上升现象，这表明百合浓郁的气味使人体交感神经系统和生理兴奋值增加，易引发一定程度的焦虑(Jin et al.,2009)。在20m²的房间内放入10枝麝香百合(L.longiflorum)会使测试者血压与心率出现较大幅度的波动，影响人体舒适感(陈华等,2016)。

研究表明百合的挥发物类型主要集中在萜类、苯丙素类和脂肪酸类衍生物，其中以萜类挥发物最为突出和典型。王婷等通过测定12种百合杂交系(41个百合品种) 的挥发物发现，单萜类化合物是这些品种的主要挥发物类群，其中相对含量最高的3 种单萜成分为桉树脑、芳樟醇和β-罗勒烯。麝香百合杂种系(Longiflorum hybrids)、麝东百合杂种系(Longiflorm×Oriental hybrids,LO百合)、麝亚百合杂种系 (Longiflorm×Asiatichybrids,LA百合)和东方百合杂种系(Oriental hybrids)较其他杂种系释放出更高比例的芳樟醇和罗勒烯。在芳香型的百合中,芳樟醇在东方百合‘西伯利亚’、东喇百合(Oriental×Trumpet hybrids,OT百合)‘木门’(L.‘Conca D Or’)和‘黄色风暴’(L.‘Yelloween’)中分别占到总挥发量的53.70％、19.18％和23.62％；β-罗勒烯在东方百合‘索邦’(L.‘Sorbonne’)、‘马可波罗’(L.‘Marco Polo’)，麝香百合‘白天堂’(L.‘White Heaven’)中的含量能占到一半以上，在‘木门’和‘西伯利亚’中也有很高的含量，分别可达到37.03％和29.02％(孔滢，2012)。可见，萜类尤其是以芳樟醇和罗勒烯等单萜类物质为主的挥发物是百合香气最主要的来源，如果能对这些单萜类物质进行控制，则可有效调控多数以萜类为主的百合香气。

目前，已有利用外源物质调控植物萜类的相关研究，但调节剂大多诱导植物萜类的生成，例如北美云杉(Picea sitchensis)茎中TPS转录本在MeJA处理后显著增加并伴随着萜类物质积累的显著变化(Miller et al,2005)；ET可以增加柑橘(Citrus sinensis)中萜类物质如罗勒烯、石竹烯、β-榄香烯、朱栾倍半萜等挥发物的含量 (Herrera et al,2007)；ABA处理诱导毛果杨(Populus trichocarpa)PtDXS表达式的最高水平升高至对照组的2.3倍，而PtDXR可升高约20倍(Xu et al,2019)；Ca²⁺的施用可以增加风轮菜(Saturejahortensis)中萜品烯和β-红没药烯的含量(Mumivand et al,2011)以及北野菊(Chrysanthemum boreale)叶片中大根香叶烯含量(Lee et al, 2005)；当水稻(Oryzasativa)经受外源H₂O₂处理时，OsTPS20的转录水平被显著诱导，相应的萜类挥发物释放量增加(Lee et al,2015)。

迄今为止，鲜有关于降低植物萜类释放水平方面的研究报道，苯并噻二唑(Benzothiadiazole,BTH)是常见的植物激活剂，其可对植物次生代谢产生一定的调节作用，但尚未见用BTH调控百合花香单萜类次生代谢产物释放的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供BTH在植物领域的新用途，特别是在调控百合萜类化合物含量中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供BTH的以下任一应用：

1)用于调控百合萜类化合物的含量；

2)用于调控百合萜类化合物合成相关基因的表达；

3)用于调控百合花香；

4)用于创制百合新品种以及百合品种改良；

其中，所述调控为下调。

百合品种改良包括：利用外源BTH降低百合挥发物的释放量，改良浓香型百合花香性状，满足室内应用需求。

本发明中，所述萜类化合物为单萜和/或单萜衍生物；

优选地，所述单萜及单萜衍生物选自β-月桂烯、D-柠檬烯、(E)-β-罗勒烯、(Z) -β-罗勒烯、芳樟醇等中的至少一种。

所述百合萜类化合物合成相关基因选自LiDXS、LiDXR、LiTPS等中的至少一种。

第二方面，本发明提供一种调控百合萜类化合物含量的方法，或调控百合萜类化合物合成相关基因表达的方法，或调控百合花香的方法，所述方法包括：使百合与BTH接触。

其中，所述调控为下调。

前述的方法，使切花百合与BTH溶液接触。

进一步地，所述切花百合为从花枝上剪下的百合。

优选地，所述百合处于半开期。

更优选地，所述百合处于半开期，且1d后达到盛开期。

本发明中，所述半开期(S3)是指百合花瓣处于半开状态，花瓣基部开张成锐角。盛开期(S4)是指百合花瓣处于完全开放状态，花瓣基部开张近乎平角，花瓣先端反卷(图1)。S3～S4期是百合花香释放量最大的时期。

前述的方法，BTH溶液的浓度为50-500mg/L。

优选地，BTH溶液的浓度为50mg/L、350mg/L或500mg/L，更优选350mg/L。

可采用如下方法制备BTH溶液：将0.5g BTH溶解于10mL无水乙醇，蒸馏水定容至100mL，得到5g/L的BTH母液。避光，4℃保存。使用时用蒸馏水将母液稀释成相应的浓度，并调节乙醇浓度至2％。

优选地，使切花百合与BTH溶液接触的方式为瓶插处理。

瓶插条件：温度25±1℃，相对湿度55％，光周期16L/8D，光照强度为150±5 mol·m^-2·s^-1。

优选地，百合品种为东方百合杂种系‘西伯利亚’(Lilium‘Siberia’)。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

本发明提供一种通过外源BTH降低百合萜类挥发物(萜类化合物)释放量的方法，包括以下步骤：

(1)取待处理的百合，从花枝上剪下。

(2)将步骤(1)中的百合通过外源BTH溶液进行处理。

(3)将步骤(2)中经处理的百合进行挥发物的采集与测定。

(4)将步骤(2)中的百合花被片进行qRT-PCR分析。

优选地，步骤(1)中所述百合品种为东方百合杂种系‘西伯利亚’。

优选地，步骤(1)中的百合需处于S3半开期，且保证1d后达到S4盛开期(图1)。

优选地，步骤(2)中外源BTH溶液的处理方式为瓶插处理。

优选地，步骤(2)中外源BTH溶液的处理的浓度为50mg/L，350mg/L或500mg/L，优选350mg/L。

优选地，步骤(3)中百合挥发物采集与测定方法为固相微萃取(SPME)结合 GCMS。

优选地，步骤(4)中所选花被片为百合内轮花被片。

优选地，步骤(4)中qRT-PCR检测百合萜类合成关键酶基因LiDXS，LiDXR和 LiTPS。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过不同浓度的外源BTH瓶插液处理百合，显著抑制了百合萜类物质的释放，其中以芳樟醇、罗勒烯为主的单萜类物质下降最为显著，350mg/L的BTH对单萜释放量抑制率均值可达59.89％(其中对β-月桂烯释放量抑制率可达58％、(Z)-β- 罗勒烯释放量抑制率可达55.56％，芳樟醇释放量抑制率可达61.53％)；且BTH处理后的百合花被片的单萜类物质代谢路径中的主要三个关键酶基因LiDXS、LiDXR和 LiTPS的表达量在BTH的处理下均有下降，LiDXS表达量在350mg/L的BTH溶液处理下仅为对照组的20.4％。BTH瓶插液通过下调相关基因和减少萜类物质的释放，最终达到调节百合花香浓度的需求。

附图说明

图1为百合‘西伯利亚’花期分级。其中，S0：绿蕾期；S1：显色蕾期；S2：初开期；S3：半开期；S4：盛开期；S5：末花期。

图2为本发明较佳实施例中BTH对百合主要单萜类挥发物的抑制率。

图3为本发明较佳实施例中50mg/L BTH对百合主要单萜类挥发物的影响

图4为本发明较佳实施例中350mg/L BTH对百合主要单萜类挥发物的影响

图5为本发明较佳实施例中500mg/L BTH对百合主要单萜类挥发物的影响

图6为本发明较佳实施例中百合萜类合成关键酶基因相对表达量。

图7为本发明较佳实施例中不同外源调节剂对百合单萜类挥发物的抑制率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的BTH溶液制备如下：

BTH母液配制：将0.5g BTH粉末(购自上海源叶生物科技有限公司)溶解于10mL 无水乙醇，蒸馏水定容至100mL，得到5g/L的BTH母液。避光，4℃保存。处理时将母液用蒸馏水分别稀释成50、350和500mg/L的浓度，并保证处理液以及对照组乙醇浓度为2％。

实施例1外源BTH对百合萜类物质释放量的抑制作用

本发明提供一种简单、高效地通过外源调节剂调控百合萜类挥发物释放量的方法。利用外源BTH降低百合挥发物的释放量，改良浓香型百合花香性状，满足室内应用需求。

(一)本实施例提供外源BTH抑制百合萜类物质释放量的方法，所述方法包括以下步骤：

1、选择处于S3半开期的花朵从花枝上剪下，并保证1d后，花朵达到S4盛花期，花朵要求健康无损伤且大小一致、轮数相近。

2、将剪下的花朵分别置于不同浓度的BTH瓶插液中培养。鲜切花瓶插条件：温度25±1℃，相对湿度55％，光周期16L/8D，白天为06:00-22:00，黑暗为22:00-06:00，光照强度150±5mol·m^-2·s^-1。

3、处理1d过后，将处于盛花期的花朵于每日13：00～15：00进行挥发物的采集与测定。

4、固相微萃取(SPME)(所用仪器由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供)：

①萃取头：采用50/30μm DVB/CAR/PDMS (Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane，二乙烯苯/分子筛/聚二甲基硅氧烷) 型号的萃取头。

②活化：将萃取头插入GC进样口，在250℃下活化10min(新的萃取头第一次使用时活化2h)。

③萃取：于每天13：00～15：00进行花香采样。将处理1d后达到S4盛花期的花朵称重，将称重后的花朵放置在2.4L的玻璃器皿中，加入5μL癸酸乙酯甲醇溶液 (1:100，v/v)内标后，立即加盖密封，在室温下密封平衡10min，然后插入SPME 萃取针，推出萃取头部分，采样时间为30min。采样结束后，推回萃取头。

④GC-MS：插入GC进样口，于250℃解析5min后，进样分析。

5、GC-MS检测(所用仪器由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供)：

①色谱条件：程度升温条件是起始温度50℃，保持4min，升温到270℃(10℃ /min)，保持5min。GC进样口温度为250℃；

②色谱柱：采用DB-5(30m×0.25mm×0.25mm)柱进行化合物的分离。

③质谱条件：质谱中离子源为70eV，记录的质荷比m/z为30-500。

6、花香含量定量计算

m_i(μg/g·h)＝f_i×(A_i/A_s)×m_s/mt

m_i：挥发物质量；f_i：待测挥发物校正因子(默认为1)；A_i：待测挥发物峰面积； A_s：内标物峰面积；m_s：内标物质量；m：被测花朵质量；t：固相微萃取时间。

(二)BTH浓度对百合萜类物质释放量的影响

本实施例中使用的百合材料为百合杂种系‘西伯利亚’(Lilium‘Siberia’)。

本发明设置三个不同的BTH浓度梯度：50、350、500mg/L。将经过不同浓度BTH 瓶插液处理的百合材料按照上述方法进行挥发物采集与分析。结果表明，最佳处理浓度为350mg/L(表1)。

表1不同浓度BTH对百合萜类挥发物影响

如表1所示，外源BTH可显著抑制百合单萜类物质的释放，抑制效率350mg/L＞500mg/L＞50mg/L BTH(图2)。其中，50mg/L的BTH对单萜的抑制率可达39.97％，其对β-月桂烯和(Z)-β-罗勒烯有着显著的抑制效果，抑制率分别可达30.53％和 31.69％，对芳樟醇抑制极显著(图3)，可达43.57％；350mg/L单萜抑制率为59.89％，其对β-月桂烯抑制率58％、(Z)-β-罗勒烯抑制率55.56％，芳樟醇抑制率61.53％，均有极显著的抑制(图4)；500mg/L的处理单萜抑制率为47.53％，其对β-月桂烯抑制率 41％，(Z)-β-罗勒烯抑制率40.27％，芳樟醇抑制率50.77％，也均有极显著的抑制(图 5)。

实施例2外源BTH对百合萜类合成关键酶表达量的影响

针对实施例1中经350mg/L BTH处理后的百合，进行关键酶基因定量分析，所述方法包括以下步骤：

1、挥发物测定过后，取百合内轮花被片，迅速置于液氮中，于-80℃超低温冰箱保存，用于后续基因定量等测定。

2、总RNA提取

百合内轮花被片总RNA提取方法根据OMEGA总RNA提取试剂盒进行，试剂盒购买于北京拜尔迪生物技术有限公司，具体操作步骤如下：

(1)二硫苏糖醇(DTT)母液配制：称取0.3g DTT粉末，溶解于2mL超纯水，用0.22μm的滤头过滤灭菌，得到1M的DTT母液，分装保存至-20℃。使用前将母液用无核酸酶水稀释至10μM使用。

(2)将保存于-80℃的样品用液氮进行研磨，研磨后迅速将样品放入离心管中，每2mL无核酸酶离心管分装约100mg样品粉末。

(3)每个离心管加入500mL RTL裂解液以及10μM DTT 20μL，充分漩涡振荡，直至样品全部混匀，裂解液需迅速加入，以防止样品冻融。

(4)将样品放入55℃水浴锅或金属浴中，充分裂解10min。

(5)将样品放入离心机，室温10,000g离心5min。取上清液至gDNA Filter Column，室温14,000g离心2min。

(6)将离心管中溶液加入等体积的Buffer RCB，迅速漩涡振荡20s，充分混匀。

(7)将液体移至

RNA Mini Column中，室温10,000g离心1min，弃废液。注意每次吸附柱中最多加600mL液体，剩余液体分次加入，如果有残留液体，可加大转速或离心时间，确保吸附膜上没有液体残留。

(8)将吸附柱放在一个新的2mL收集管中，加入400μL RWC Wash Buffer，室温10,000g离心1min，弃滤液。

(9)将吸附柱放回收集管，加入500uL RNA Wash Buffer II,室温10,000x g，离心30s，弃滤液。该步骤重复进行一次。

(10)将吸附柱放在一个新的2mL收集管中，室温下最大转速开盖离心5min，确保无水乙醇已除尽，且吸附膜完全甩干。

(11)取出

RNA Mini Column，放入新的1.5mL无RNA酶的离心管中，在吸附膜中央加入50μL DEPC水，室温放置2min，10,000g离心2min，收集滤液。将滤液再次加入到吸附柱中，同样，室温放置2min，离心收集滤液，可以提高产量。 DEPC水在65℃金属浴预热可以提高产量。

(12)用紫外光分光光度计测定总RNA浓度，并用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳分析。

3、cDNA第一链合成

反应参考takara反转录试剂盒说明书进行。所有样品均取1μg RNA用于cDNA第一链的合成。操作步骤如下：

①去基因组DNA反应：

首先在冰上配制如下反应液(表2)，为了保证加样准确性，应多配制Master Mix I1-2个反应数，然后分装，最后加入RNA样品，在PCR仪中42℃反应2min，降温至 4℃，置于冰上。

表2去基因组DNA反应体系

②反转录反应：

在上述反应进行时，配置反转录用Master Mix II(表3)，配制方法同上；将MasterMix II在冰上加入步骤①的反应液中，轻柔混匀，立即进行反转录反应，在PCR仪上 37℃，15min，升温至85℃，5s终止反应。

表3反转录反应体系(SYBR Green qPCR法)

4、qRT-PCR

实时荧光定量PCR引物设计序列见表4。

在qRT-PCR专用的96孔板内加入各反应组分，每个样品重复3次，贴上高透光率封口膜，离心，放入仪器中进行测定。反应体系见表5。

反应程序：95℃预变性，30sec；95℃变性，5sec；55℃退火，30sec；72℃延伸，30sec，40个循环；60℃，30sec；最后于60℃～95℃进行熔解曲线分析；反应终止。

表4相对定量用引物

表5相对定量PCR反应体系

对经过350mg/L的BTH处理后的百合花被片进行qRT-PCR，结果表明，百合单萜类物质代谢路径中的主要三个关键酶基因LiDXS，LiDXR和LiTPS的表达量在BTH 的处理下均有下降，其中LiDXS表达量下降极显著，表达量仅为对照组的20.4％。其余两个下降不明显(图6)。

因此，为了调节切花百合香气释放的浓度，消除在室内小空间应用时浓烈香气引起的不适感，利用BTH调控花香释放是一种高效便捷的方法。

实施例3不同外源抑制剂对百合萜类挥发物的影响

外源调节剂种类繁多，本实施例通过外施四种不同的常见外源调节剂对百合萜类挥发物的影响来综合比较各调节剂之间的差异。本实施例使用的四种外源调节剂及其浓度分别是：350mg/L BTH(上海源叶生物科技有限公司)；300mg/L水杨酸 (Salicylic acid,SA)(北京拜尔迪生物技术有限公司)；0.2mM洛伐他汀(Mevinolin, MEV)(上海源叶生物科技有限公司)；0.1mM膦胺霉素(Fosmidomycin,FSM)(百灵威科技有限公司)。

按照实施例1中的瓶插处理及挥发物测定方法，对不同外源抑制剂处理过后的百合‘西伯利亚’内轮花被片的挥发物进行分析。结果如图7所示，对单萜的抑制效率BTH＞FSM＞SA＞MEV。BTH抑制效率最高，可达66％，与FSM无显著性差异，且显著高于SA(35.81％)和MEV(25.11％)处理。但由于FSM价格昂贵，不利于节约成本，而与之效果类似的BTH性价比高，易获得且无污染，是一种高效实用的调节剂。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.BTH的以下任一应用：

1)用于调控百合萜类化合物的含量；

2)用于调控百合萜类化合物合成相关基因的表达；

3)用于调控百合花香；

4)用于创制百合新品种以及百合品种改良；

其中，所述调控为下调。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述萜类化合物为单萜和/或单萜衍生物；

优选地，所述单萜及单萜衍生物选自β-月桂烯、D-柠檬烯、(E)-β-罗勒烯、(Z)-β-罗勒烯、芳樟醇中的至少一种；和/或

所述百合萜类化合物合成相关基因选自LiDXS、LiDXR、LiTPS中的至少一种。

3.调控百合萜类化合物含量的方法，或调控百合萜类化合物合成相关基因表达的方法，或调控百合花香的方法，其特征在于，包括：使百合与BTH接触；

其中，所述调控为下调；

所述萜类化合物、百合萜类化合物合成相关基因同权利要求2中所述。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使切花百合与BTH溶液接触。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述百合处于半开期。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述百合处于半开期，且1d后达到盛开期。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，BTH溶液的浓度为50-500mg/L；

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使切花百合与BTH溶液接触的方式为瓶插处理。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，瓶插条件：温度25±1℃，相对湿度55％，光周期16L/8D，光照强度为150±5mol·m^-2·s^-1。

10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于，百合品种为‘西伯利亚’(Lilium‘Siberia’)。