CN1196090A - 糖酵解速率增加的转基因植物细胞和植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及糖酵解速率增加的转基因植物细胞和植物。糖酵解速率的增加是编码转化酶(优选的是反常或者无规转化酶)的DNA序列在植物细胞中引入和表达的结果,也是编码己糖激酶(优选的是反常或者无规己糖激酶)的DNA序列在植物细胞中引入和表达的结果。此外,本发明描述了用于产生糖酵解速率增加的植物细胞和植物的方法和重组DNA分子。

Description

糖酵解速率增加的转基因植物细胞和植物
本发明涉及与非转化的植物相比，显示出增加的糖酵解速率的转基因植物细胞和植物。糖酵解速率的增加是由于编码细胞溶质转化酶(优选的是反常或者无规转化酶)的DNA序列在植物细胞中的引入和表达，也是编码细胞溶质己糖激酶(优选的是反常或者无规己糖激酶)的DNA序列在植物细胞中的引入和表达的结果。本发明也涉及用于产生糖酵解速率增加的转基因植物细胞和植物的方法和重组DNA分子；以及编码具有转化酶酶促活性的蛋白质或具有己糖激酶酶促活性的蛋白质的DNA序列的用途，目的是产生具有增加的糖酵解速率的植物。
由于过度增加的世界人口导致对食物需求日益增长，努力增加可利用植物的产量是生物技术研究的目的。达到这个目的的可能性是借助于重组DNA技术专门改变植物的新陈代谢，这样改变的目标例如主要是光合作用(CO2固定)的过程、参加光同化物在植物体内分配的运输过程或者使贮存物质(如淀粉、蛋白质或含油物质)合成的代谢途径。例如，有人描述了在植物细胞中的原核天冬酰胺合成的表达导致转基因植物在其它的方面生物量产生的增加(EP-B 0 511 979)。有人也提出了表达转基因植物的细胞溶质中的原核多磷酸激酶，在这种情况下产生马铃薯植物球根的重量增产达至30％。此外，EP-A2 0 442 592描述了在马铃著植物中质外体转化酶的表达也使以这种方式转化的转基因植物的产量增加。另外还进行了改变参与在大多数植物中的最重要的运输代谢物之一的蔗糖合成的酶的活性的实验(参见例如Sonnewald等，植物细胞与环境17(1995)，649-658)。
WO 91/19896也描述了通过过量表达ADP葡萄糖焦磷酸化酶的反常酶使分配到马铃著块茎(其以淀粉的形式贮存蔗糖)的蔗糖增加，从而使淀粉生物合成增加。
而许多这些用途都是指导致叶片中光同化物的形成(也参见EP 466 995)或者导致聚合物如淀粉或者果聚糖在转基因植物的贮存器官中形成(例如WO 94/04692)，到目前为止，还没有任何有希望的方法描述了为了增加糖酵解速率而必须在主要代谢途径中进行的改良。例如，糖酵解速率的增加对于植物中需要大量ATP的所有那些过程都是重要的。例如，这一点对经膜的许多运输过程是正确的，所说的运输过程是由膜势或者由经H+-ATP酶活性产生的质子梯度驱动的。并且糖酵解速率的增加对分生组织的生长、营养生长到生殖生长的变化、以及对各种贮存物质(特别是油)的合成是重要的。
因此本发明的目的是提供糖酵解速率增加的植物细胞和植物以及用于它们的生产的方法和DNA分子。
通过提供权利要求中描述的实施方案解决此问题。
因此，本发明涉及与非转化植物细胞相比，具有增加的糖酵解速率的转基因植物细胞，这是因为编码细胞溶质转化酶的DNA序列和编码细胞溶质己糖激酶的DNA序列的引入和表达以及转化酶和己糖激酶活性都有所增加。每个转基因细胞可能包含一个或多个编码转化酶或者己糖激酶的DNA序列。
令人惊奇地发现通过在植物细胞的细胞溶质中引入和表达编码具有己糖激酶酶促活性的蛋白质的DNA序列、同时引入和表达编码具有转化酶酶促活性之蛋白质的DNA序列，当和非转化的植物细胞相比，通过这种方式转化的植物细胞的糖酵解速率急剧增加。对于真菌起源的转化酶在细细胞溶质中的表达已有描述(参见EP-A2 442 592)。然而，只公开了真菌转化酶在植物细胞的细胞溶质中的表达。目前为止未见使用细胞溶质转化酶增加糖酵解速率，特别是与己糖激酶的表达结合使用来增加糖酵解速率的描述。
增加的糖酵解速率意味着由DNA序列(导致所说细胞的细细胞溶质中有转化酶和己糖激酶的额外合成)转化的转基因植物细胞与非转化的植物细胞相比显示出糖酵解速率增加，优选的是糖酵解速率增加至少30％，更优选的是其增加至少50％-100％，特别是增加超过100％-200％，更优选的是增加超过300％。在实施例中详细描述了通过确定相应代谢中间物来确定糖酵解速率。例如，可以通过葡萄糖-6-磷酸酯、果糖-6-磷酸酯、3-磷酸甘油酸酯、丙酮酸酯或ATP浓度的增加来确定糖酵解速率的增加。在本发明中，优选的是通过评价丙酮酸酯的增加来确定糖酵解速率的增加。在本文中，通过和非转化的植物细胞相比来确定糖酵解速率的增加。这就意味着现在将用作引入上述DNA序列的起始材料的植物材料用于测定糖酵解速率。然后将以这种方法确定的糖酵解速率与用上述的DNA序列转化的相应种或植物系的植物材料的糖酵解速率相比。
例如，由增加的糖酵解速率提供的增加的ATP量能够增加各种依靠能量的运输和生长过程。由于增加的糖酵解速率而增加的丙酮酸酯浓度使乙酰CoA的量增加，所说的乙酰CoA例如可以用于强化油、脂肪或者类异戊二烯衍生物的合成。如果能够使多羟链烷酸的合成的DNA序列同时在这些细胞中表达，乙酰CoA也可以用于这些链烷酸的形成。
在本发明优选的实施方案中，编码转化酶或也可以是己糖激酶的DNA序列是编码这样的转化酶或也可以是己糖激酶的DNA序列，所说的转化酶或己糖激酶与植物中通常存在的转化酶和己糖激酶相比是反常的或者无规的。反常的意思是这些酶不能以与非改良植物细胞中通常形成的转化酶和己糖激酶相同的方式进行调节。尤其是这些酶受不同的调节机制支配，即这些酶在某种程度上不能由存在于植物细胞中的抑制剂抑制或者由代谢物进行变构调节。在这一点上，反常的优选的意思是这些酶与植物细胞内源表达的转化酶或者己糖激酶相比具有更高的活性。在本发明中，无规的意思是在植物细胞中这些酶不受任何调节作用支配。
编码具有转化酶酶促活性的蛋白质的DNA序列可以是编码原核转化酶，特别是细菌转化酶的DNA序列。它们也可以是编码真核转化酶(即植物、藻类、真菌或动物有机体的转化酶)的DNA序列。在本发明中，术语真菌也可以指各种酵母、特别是酵母属(Saccharomyces)的酵母(如酿酒酵母)。由这些序列编码的酶是已知的和天然产生的酶，其表现出受各种物质(特别是植物转化酶抑制剂)的调节作用的偏差。它们也可以是通过编码细菌、藻类、真菌、动物或植物的已知酶的DNA序列的诱变而产生的酶。
在本发明优选的实施方案中所说的DNA序列编码具有真菌转化酶酶促活性的蛋白质。这些酶的优点是与植物的转化酶相比，它们不受植物转化酶抑制因子的调节。优选的是使用编码酵母属的转化酶的DNA序列。这些序列是已知的并已经描述过(参见Taussig等，核酸研究11(1983)，1943-1954；EP A2 0 442 592)。为了确保转化酶在植物细胞细胞溶质中的定位，必须使可能存在的编码信号肽的DNA序列缺失，而提供编码区，如果必要，所说的编码区带有新的起始密码子(参见EP-A2 0 442 592)。除了上述的酿酒酵母的DNA序列外，其它编码具有转化酶酶促活性的蛋白质的DNA序列是已知的(参见EMBL登记号X67744 S.xylosus、M26511V.alginolyticus、L08094运动发酵单胞菌、L33403运动发酵单胞菌、U16123玉蜀黍(Zea mays)、U17695玉蜀黍、X17604 S.occidentalis、222645 S.tuberosum、Z21486 S.tuberosum、M81081西红柿、Z35162V.faba、Z35163 V.faba、D10265 V.radiata、Z12025 L.esculentum、Z12028 L.pimpinellifolium、Z12026 L.pimpinellifolium、X73601 A.sativa、S70040酸性转化酶、V01311酵母基因、U11033 Arabidopsisthaliana、X81795 B.vulgaris BIN35、X81796 B.vulgaris、X81797 B.vulgaris、X81792 C.rubrum、X81793 C.rubrum、X77264 L.esculentum、Z12027 L.esculentum、D10465运动发酵单胞菌、D17524运动发酵单胞菌)，并且由于它们的特性这些DNA序列也可用于产生本发明的植物细胞。必须注意到这些蛋白质是在这些植物细胞的细胞溶质中形成的。修饰这些DNA序列以便确保合成的酶定位在这些植物细胞的细胞溶质中的方法对技术人员是已知的。如果所说的转化酶包含对于分泌或对于特定亚细胞定位(例如定位在胞外或液泡内)必需的序列，所说的各个DNA序列都必须进行缺失处理。
编码具有己糖激酶酶促活性蛋白质的DNA序列可以是编码原核转化酶，特别是细菌转化酶的DNA序列，也可以是编码真核转化酶(即植物、藻类、真菌或动物有机体的转化酶)的DNA序列。
己糖激酶(EC 2.7.1.1)是催化下列反应的酶：
己糖+ATP<->己糖-磷酸酯+ADP
由这些DNA序列编码的己糖激酶可以是天然存在的已知酶，这些酶受各种物质的调节作用发生变化。它们也可以是通过诱变编码细菌、藻类、真菌、动物或者植物的已知酶的DNA序列而产生的酶。已经描述了在广泛的有机体，如酿酒酵母、人类、大鼠以及各种微生物中存在编码具有己糖激酶活性的酶的DNA序列(关于这些DNA序列，参见：EMBL基因库，登记号M92054、L04480、M65140、X61680、M14410、X66957、M75126、J05277、J03228、M68971、M86235、X63658)。
在优选的实施方案中，所说的DNA序列编码葡糖激酶，特别是例如经葡萄糖-6-磷酸酯的变构调节作用降低的葡糖激酶。葡糖激酶(EC 2.7.1.2)是对葡萄糖具有高亲和力的催化下列反应的己糖激酶：
葡萄糖+ATP<->葡萄糖-6-磷酸酯+ADP
在优选的实施方案中，这些DNA序列编码运动发酵单胞菌的葡糖激酶(Barnell等，细菌学杂志172(1990)，7227-7240；EMBL基因库登记号M60615)。也描述了存在于人类和大鼠中的其它葡糖激酶(关于DNA序列，参见：EMBL基因库登记号M69051、M90299、J04218和M25807)。
并且，在上述已知的DNA序列存在下，可以从任何需要的有机体中分离编码转化酶或己糖激酶的DNA序列。分离和鉴定这些DNA序列的方法对本领域的技术人员是已知的，如和已知的序列杂交或者通过使用由已知序列衍生的引物的聚合酶链反应。
接下来检测由确定的DNA序列编码的酶的酶活性和调控。确定转化酶或者己糖激酶活性的方法对技术人员是已知的。
按照技术人员已知的方法引入突变和修饰可以进一步改变由这些DNA序列编码的蛋白质的调节特性，以便获得反常的或者无规的酶。
为了在植物细胞中进行表达，通常可以将编码细胞溶质转化酶或者己糖激酶的DNA序列置于任何在植物细胞中有功能的需要的启动子的控制下。上述DNA序列的表达一般可以在任何时间、在由本发明转化的植物细胞再生的植物的任何组织中发生。然而，这种表达优先发生在糖酵解速率增加的组织，糖酵解速率的增加对植物的生长、离子和代谢物的吸收和运输或植物中代谢物的形成是有利的。因此，能够确保DNA序列在植物发育的某个时间某个组织中或在植物的某个器官中进行特异表达的启动子看起来是最合适的。这样，在形成种子的胚乳或子叶中有特异活性的启动子看来对由于油料植物(如油料种子芸苔、大豆、向日葵和油棕榈)种子中乙酰CoA含量的增加而增加的脂肪酸合成是特别合适的。例如这些启动子是来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的云扁豆蛋白的启动子、Vicia faba的USP启动子或者小麦的HMG启动子。
此外，使用确保种子特异性表达的启动子是有利的。在贮存淀粉的植物(如玉米、小麦、大麦或其它谷物)中，这样种子中糖酵解速率就增加了，并且丙酮酸酯和乙酰CoA的形成以及脂肪酸的生物合成都得到了增强。这就意味着光同化物的流向发生变化，其针对于依赖丙酮酸酯而不是淀粉的生物合成途径(如脂肪酸的生物合成)。
在贮存器官(如块茎或根)中，例如在甜菜的贮存根或者马铃薯的块茎中有活性的启动子也是优选使用的。在这种情况下，编码转化酶或者己糖激酶的DNA序列的表达使生物合成途径的方向发生改变，这样，由于糖酵解速率的增加，形成糖或淀粉较少，而形成丙酮酸酯和乙酰CoA较多。
此外，这些DNA序列的表达可以由在诱导开花时特异激活的启动子控制或者由在诱导开花所需要的组织中有活性的启动子控制。也可以使用在一定时间单独由外部因素(如光、温度、化学物质)控制而激活的启动子(例如参见WO 93/07279)。由于ATP含量增加而使离子自土壤的吸收速率增加的兴趣启动子是，例如在根毛或根表皮中特异表达的启动子。增加光同化物自叶片输出速率的兴趣启动子是，例如在伴胞中特异表达的启动子。这些启动子是已知的(例如Agrobacterium rhizogenes的rolC基因的启动子)。
此外，编码转化酶或者己糖激酶的DNA序列不仅与启动子连接，而且与确保转录进一步增加的DNA序列(如所谓的增强子序列)或者与位于转录区的确保合成的RNA更有效地翻译成各自的蛋白质的DNA序列(所谓的翻译增强子)连接是有利的。这些区域可以来源于病毒基因或者适合的植物基因，或者经合成产生。它们可以与所用的启动子是同源或异源的。编码转化酶或者己糖激酶的DNA序列与确保转录终止和转录物多腺苷酸化的3′-非翻译的DNA序列连接是有利的。这些序列是已知的并且已经描述过，例如，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼氨酸合成酶基因的DNA序列。这些序列可以以任何需要的方式交换。
优选地，将编码转化酶或者己糖激酶的DNA序列稳定地整合到本发明的植物细胞的基因组中。
由于细胞溶质转化酶和细胞溶质己糖激酶的附加表达，具有糖酵解速率增加的的转基因植物细胞一般地可以是任何所需要的植物物种的细胞。单子叶和双子叶植物物种的细胞是有利的，特别是贮存淀粉、油的植物以及农业上有用的植物(如黑麦、燕麦、大麦、小麦、马铃薯、玉米、水稻、油料种子芸苔、豌豆、甜菜、大豆、烟草、棉花、向日葵、油棕榈、wine、番茄等)的细胞或者观赏植物的细胞。
除了糖酵解速率增加之外，本发明的植物细胞与相应的非转化的植物细胞的不同之处在于它们含有稳定整合到基因组中的编码细胞溶质转化酶或者有时是细胞溶质己糖激酶的外源DNA序列。在本文中，术语″外源的DNA序列″有如下意思：它们可以是和转化的植物细胞异源的DNA序列，即在这种植物细胞内它们不能自然地产生。对于在转化的植物细胞内自然地产生的DNA序列来说，″外源″意味着它们整合到转化的植物细胞的基因组中它们不能自然产生的位置，即这种DNA序列具有新的基因环境。这是可以检验的，例如，通过Southern印迹分析进行检验。此外，引入植物细胞的DNA分子通常是重组DNA分子，即是由各种片段组成(在这种组成中不能自然产生)的分子。
本发明另外的主题是含有本发明的转基因植物细胞的转基因植物。可以从本发明的植物细胞例如，通过再生产生这样的植物。
提供具有增加的糖酵解速率的植物细胞能够产生具有改良的有利特性的转基因植物。通过增加糖酵解速率(例如特别是在转基因植物的伴胞中)，可以增加经蔗糖-质子-协同运输器将蔗糖载于筛分子-伴胞复合物上的载荷，这将使光同化物的运输速率增加。以同样的方式，可以增加无机离子(如磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐)经根自土壤的吸收。
由于增加的H+ATP酶活性，根细胞(特别是根毛和表皮细胞)中糖酵解速率的特异增加加强了质子向土壤的分泌。土壤的这种酸化导致活动化，因此使从土壤中吸收各种矿物质(如磷酸盐)更容易。
通过增加植物的油贮存组织(如种子的胚乳或者子叶、或者其它贮存油的器官)的糖酵解速率，可以指导输入到种子或器官中的光同化物形成丙酮酸酯和乙酰CoA。这种可能性是特别令人感兴趣的。用于甘油三酯生物合成的中间产物的量的增加可以增加油的合成，因此使产量增加。提供增加量的乙酰CoA不仅对于许多植物中天然产生的其它过程(如类异戊二烯生物合成)是重要的，而且对聚合物(如多羟基链烷酸)的形成也是重要的(例如参见Poivier等，生物技术13(1995)，142-150)。
通过在贮存淀粉的组织(如在各种谷物的种子或者马铃著块茎)中增加糖酵解速率，就能够指导光同化物从淀粉生物合成流向依赖丙酮酸的生物合成途径(如脂肪酸生物合成)。这将导致在各个组织中淀粉含量的降低并可能导致脂肪酸生物合成的同步增加。
此外，由糖酵解速率的增加而产生的高浓度乙酰CoA也可以使类异戊二烯的合成增强，或者与用于合成多羟基链烷酸相应基因的表达结合导致转基因植物细胞中多羟基链烷酸的合成。
此外，本发明涉及用于产生与非转化植物细胞相比显示出增加的糖酵解速率的转基因植物细胞的方法。在这种方法中，将编码细胞溶质己糖激酶的DNA序列和编码细胞溶质转化酶的DNA序列引入到植物细胞中。然后使这些DNA序列在转化的植物细胞中表达。
这种方法优选地包括下列步骤：
(a)产生重组双链的DNA分子，这种DNA分子包含下列DNA序列：
(i)确保在植物细胞中转录的启动子；
(ii)DNA序列，编码具有转化酶酶促活性的细胞溶质蛋白质并和所说的启动子在有意义的方向上连接的DNA序列；
(b)产生重组双链的DNA分子，这种DNA分子包含下列DNA序列：
(i)确保在植物细胞中转录的启动子；
(ii)DNA序列，编码具有己糖激酶酶促活性的细胞溶质蛋白质并和所说的启动子在有意义的方向上连接的DNA序列；
(c)将按照步骤(a)和(b)产生的DNA分子转移到植物细胞中。
为了选择植物物种、启动子、侧翼DNA序列，以及为了选择编码转化酶或者有时可以是己糖激酶的DNA序列的修饰，上文就本发明的细胞所描述的内容仍然是正确的。
编码转化酶或者己糖激酶的DNA序列可以定位在分离的DNA分子上或者一起定位在一个重组DNA分子上。如果这些序列定位在两个不同的DNA分子上，这些DNA分子的转移可以同时发生或者以这样一种方式，即先用一种DNA分子转化所说的植物细胞，接下来用第二种DNA分子转化选择的植物细胞和植物。并且表达附加的细胞溶质转化酶和附加的细胞溶质己糖激酶的植物可以通过最初产生两种独立的编码转化酶或者有时可能是己糖激酶的转基因植物系，然后将这两种植物系杂交而产生。
优选通过质粒，特别是能够确保所说的DNA分子稳定地整合到转化的植物细胞的基因组中的质粒完成含有编码转化酶或者己糖激酶的DNA序列的DNA分子的转移；这些质粒的例子是根癌土壤杆菌系统的二元质粒或Ti质粒。除了土壤杆菌(Agrobacterium)系统外，其它的系统(如所谓的biolistic方法或原生质体的转化)也可用于将DNA分子引入到植物细胞中(参见Willmitzer L.的综述(1993)，转基因植物，生物技术2，627-659)。总的来说，所有植物种类的细胞都可以用于转化。单子叶和双子叶植物是特别有意义的。对于各种单子叶和双子叶植物，已经描述了转化技术。优选使用农业上有用的植物(如黑麦、燕麦、大麦、小麦、马铃薯、玉米、水稻、油料种子芸苔、豌豆、甜菜、大豆、烟草、棉花、向日葵、油棕榈、wine、番茄等)的细胞或者观赏植物的细胞。由上述方法获得的转基因植物细胞和由其再生的植物(这种植物由于细胞溶质转化酶和细胞溶质己糖激酶的附加表达而显示出糖酵解速率的增加)也是本发明的主题。
此外，本发明涉及本发明植物的繁殖材料，这些材料包含本发明的细胞。所说的繁殖材料可以是能够繁殖的本发明植物的任何种类的组织或器官。例如它们可以是本发明细胞的组织培养物、种子、果实、根茎、切段、籽苗、块茎等。
本发明还涉及重组DNA分子，所说的DNA分子包含与确保在植物细胞中转录与翻译的DNA序列结合在一起的编码具有己糖激酶(优选的是葡糖激酶)酶促活性的蛋白质的DNA序列。所说的己糖激酶优选的是反常或者无规酶。
此外，本发明涉及包含下列DNA序列的重组DNA分子：
(i)与确保在植物细胞中转录与翻译的DNA序列结合在一起的编码细胞溶质转化酶的DNA序列；
(ii)与确保在植物细胞中转录与翻译的DNA序列结合在一起的编码细胞溶质己糖激酶的DNA序列。
为了选择使得可以在植物细胞中转录和翻译的DNA序列和为了选择编码转化酶有时可以是己糖激酶的DNA序列，上文就本发明的细胞和方法所描述的内容同样适用于重组DNA分子。
最后，本发明涉及编码转化酶(优选的是反常或者无规的转化酶)的DNA序列在产生转基因植物细胞中的用途，所说的转基因植物细胞与非转化的植物细胞相比显示出增加的糖酵解速率。编码己糖激酶(优选的是反常或者无规的己糖激酶)的DNA序列在产生转基因植物细胞中的用途(所说的转基因植物细胞与非转化的植物细胞相比显示出增加的糖酵解速率)也是本发明的主题。
图的描述
图1显示出大小为12.68kb的质粒pB33Hyg-Gk。这种质粒包含下列片段：A＝片段A(1498bp)包含patatin基因B33启动子区的DraI-DraI片段(位置-1512到位置+14)(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)。B＝片段B(1025bp)包含带有运动发酵单胞菌的葡糖激酶编码区的DNA片段(Gen EMBL登记号：M60615；核苷酸5128到6153)。C＝片段C(192bp)包含Ti-质粒pTi-ACH5的T-DNA基因3的多腺苷酸化信号，核苷酸11749-11939。
1.克隆方法
为了在大肠杆菌中克隆，使用了pUC18载体。
为了进行植物转化，将基因构建体克隆到二元载体pBinAR(Hfgen和Willmitzer，植物科学66(1990)，221-233)。
2.细菌菌株
为了构建pUC载体和pBinAR，使用了大肠杆菌菌株DH5α(Bethesda研究实验室，Gaithersburgh，美国)。
通过根癌土壤杆菌菌株C58C1 pGV2260(Deblaere等，核酸研究13(1985)，4777-4788)将所说的质粒转化到马铃薯植物中。
3.根癌土壤杆菌的转化
按照Hfgen和Willmitzer的方法(核酸研究16(1988)，9877)经直接转化来转移DNA。按照Birnboim和Doly的方法(核酸研究7(1979)，1513-1523)分离转化的土壤杆菌的质粒DNA，在合适的限制性酶切后经凝胶电泳进行分析。
4.马铃薯的转化
将用解剖刀切割的无菌马铃薯培养物(Solanum tuberosum L.cv.Désirée)的小叶片放置在10ml含有2％蔗糖的MS培养基(Murashige和Skoog，植物生理15(1962)，473)中。所说的培养基含有50μl在选择条件下生长的根癌土壤杆菌过夜培养物。将其振荡3-5分钟后，在黑暗中继续培养2天。接下来将叶片放在用于愈伤组织诱导的含有1.6％葡萄糖、5mg/l萘乙酸、0.2mg/l苯甲基氨基蝶呤、250mg/l claforan、50mg/l卡那霉素和0.80％的细菌培养用琼脂的MS培养基上。25℃和3000 lux下培养一周，然后将叶片放在用于根诱导的含有1.6％葡萄糖、1.4mg/l玉米素核糖、20mg/l萘乙酸、20mg/l赤霉酸、250mg/l claforan、50mg/l卡那霉素和0.80％细菌培养用琼脂的MS培养基中。
5.DNA片段的放射标记
通过Boehringer(德国)的DNA随机引物标记试剂盒，按照厂商的说明对DNA片段进行放射标记。
6.植物的保持
在下列条件下将马铃薯植物保持在温室中：
光周期：25000lux和22℃下16小时
暗周期：15℃下8小时
空气湿度：60％
7.马铃薯块茎中淀粉含量和干物质的确定
按照下列公式通过确定比重(Schéele等，Landw.Vers.Sta.127(1937)，67-96)来确定马铃薯块茎中淀粉含量和干物质：％干物质＝24.182+211.04x(比重-1.0988)％淀粉＝17.546+199.07x(比重-1.0988)
8.马铃薯块茎中磷酸化的代谢中间物的确定
按照Weiner和Stitt(生物化学和生物物理学报893(1987)，13-21)的方法(只有微小的变化)测定马铃薯块茎中磷酸化的代谢中间物。马铃薯块茎提取物的制备：
在研钵中将200mg块茎物质于液氮下均化。用溶解在二乙基醚中的16％三氯乙酸溶液提取磷酸化的代谢中间物。在冰上温育三小时后，通过用二乙基醚提取三次来除去三氯乙酸。之后用5M KOH/1M三乙醇胺中和提取物。分别测定磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)和丙酮酸酯。为了测定其它的中间物，可以把所得的提取物在-70℃保存几天。
用双波长光度计(Sigma ZWS 11)通过Stitt等的偶联酶促反应方法(酶学方法174，518-552)测定磷酸化的中间物。
a)PEP和丙酮酸酯的测定反应缓冲液含有：50mM Hepes-KOH pH7.0；
            5mM MgCl2；
            0.025mM NADH；
            1mM ATP；丙酮酸酯的测定：1U/ml乳酸脱氢酶PEP的测定：+2U/ml丙酮酸激酶此测定是在25℃下使用50-100μl的提取物进行的。
b)UPD葡萄糖(UDPG)的测定：反应缓冲液包含：200mM甘氨酸pH8.7；
            5mM MgCl2；
            1mM NAD；
            0.025U/ml UDP葡糖脱氢酶此测定是在25℃下使用50-100μl的提取物进行的。
c)葡萄糖-6-磷酸酯(G6P)、果糖-6-磷酸酯(F6P)和葡萄糖-1-磷酸酯(G1P)的测定反应缓冲液包含：50mM Hepes-KOH pH7.0；
            5mM MgCl2；
            0.25mM NADP；G6P的测定：2U/ml葡萄糖-6-磷酸酯F1P的测定：+2U/ml磷酸葡糖异构酶G1P的测定：+2U/ml磷酸葡糖变位酶此测定是在25℃下使用50-100μl的提取物进行的。
d)ATP的测定反应缓冲液包含：50mM Hepes-KOH pH7.0；
            5mM MgCl2；
            0.25mM NADP；
            1mM葡萄糖；
            2U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；
            2U/ml磷酸葡糖异构酶；
            1U/ml己糖激酶此测定是在25℃下使用50-100μl的提取物进行的。
e)ADP的测定反应缓冲液包含：50mM Hepes-KOH pH7.0；
            5mM MgCl2；
            0.05mM NADP；
            0.2mM PEP；
            0.2U/ml乳酸脱氢酶；
            1U/ml丙酮酸激酶此测定是在25℃下使用50-100μl的提取物进行的。
f)3-磷酸甘油酸酯(3-PGA)的测定反应缓冲液包含：100mM Tris-HCl pH8.1；
            5mM MgCl2；
            0.05mM NADP；
            1.33mM ATP；
            0.1U/ml磷酸甘油酸激酶；
            2U/ml磷酸甘油醛脱氢酶
此测定是在25℃下使用50-100μl的提取物进行的。
9.马铃薯块茎中碳水化合物新陈代谢酶活性的测定
为了测定在马铃薯块茎中的酶(例如葡糖激酶、果糖激酶、蔗糖合成酶、转化酶、磷酸葡糖变位酶、磷酸果糖激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶或丙酮酸激酶)的活性，将200mg的块茎材料在500μl的提取缓冲液(50mM Hepes-KOH pH7.5；5mM MgCl2；1mM EDTA；1mM EGTA；1mM DTT；2mM苄脒；2mMε-氨基-正己酸；0.5mM PMSF；10％(体积比)甘油；0.1％(体积比)Triton X-100)中均化。离心后，将10至40μl的无细胞的脱盐提取物用于酶活性的测定。除了蔗糖合酶和转化酶活性以外，通过在光谱光度计中的偶联酶促反应测定酶活性。
按照Renz等(Planta 190(1993)，156-165)的方法测定葡糖激酶和果糖激酶的活性，按照Zrenner等(Plant J.7(1995)，97-107)的方法测定蔗糖合酶和转化酶的活性，按照Burell等(Planta 194(1994)，95-101)的方法测定磷酸果糖激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶的活性，并且按照Pressey(食物科学杂志32(1967)，381-385)的方法测定葡糖磷酸异构酶的活性。
10.马铃薯块茎的气体交换的测定
直接从温室的植物中取得块茎(大约30g)并且在30分钟内把它放置在远红外气体分析仪(Binos 100 Rosemound，Düsseldorf，联邦德国)中。在20℃下测量20分钟CO2的产生。使用Waltz软件(Effeltrich，FRG)分析数据。
下列实施例用于说明本发明。
实施例1
二元质粒p33-Cy-Inv的构建
在EP-A2 0 442 592中描述了质粒p33-Cy-Inv的构建和把此质粒引入到马铃薯基因组。把用二元构建体p33-Cy-Inv转化的再生马铃薯植物转移到土壤中，并且选择转化酶的活性。因此鉴定了一些表现出比对照植物转化酶活性高100多倍的遗传型。
实施例2
二元质粒pB33Hyg-GK的构建
为了进行植物转化，通过聚合酶链反应(PCR)从运动发酵单胞菌基因组的DNA开始扩增了运动发酵单胞菌的葡糖激酶基因的编码区。运动发酵单胞菌的葡糖激酶的序列存放在GenEMBL基因库中，登记号为M60615。扩增的片段与此序列的5128-6153核苷酸区域相对应。在5′末端引入Asp718限制性位点，在3′末端引入HindIII限制性位点。把具有1025bp长度的PCR片段克隆到pUCBM20载体的两个附加位点上。使用这种质粒，在用EcoRI和HindIII切割后把葡糖激酶的整个编码区亚克隆到pBluescriptSK载体中。在含有所得的质粒pSK-GK的大肠杆菌细胞的提取物中，葡糖激酶的活性与未转化的大肠杆菌细胞提取物相比，增加了100倍。为此，收获20ml过夜培养的细胞，并悬浮在500μl的提取缓冲液(30mMKH2PO4、2mM MgCl2、10mM 2-巯基乙醇、0.1％(体积比)的乙基苯基聚乙二醇)中。在加入相同体积的酸洗玻璃珠(直径0.1毫米)后，将悬浮液剧烈地混合4次，每次30秒。离心后，如Scopes等的描述(生物化学杂志228(1985)，627-634)测定无细胞提取物中的葡糖激酶活性。在证明了PCR产物的功能后，将插入物重新克隆到来源于pBIN19的二元载体(Bevan，核酸研究12(1984)，8711-8720)中。这样就形成了下面的质粒：质粒pB33Hyg-GK(参见图1)。为了在植物中表达植物转基因，此构建体包含马铃薯的B33启动子(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)。
按照如下过程产生构建体pB33Hyg-GK：
因为此构建体是用来转化已经转基因的表达HPT-II基因的马铃薯植物，所以使用了含有编码潮霉素B磷酸转移酶HPT基因的质粒pBIB(Becker，核酸研究18(1990)，203)。
在粘性末端降解后，经聚合酶II将马铃薯B33基因的启动子作为DraI片段(按照Rocha-Sosa等的位置-1512至+14，EMBO J.8(1989)，23-29)克隆到pUC19质粒的SacI位点。将此启动子区作为EcoRI/SmaI片段克隆到二元载体pBIN19中。pBIN19载体包含根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶基因的终止信号，其直接与M13mp19的多接头相邻。在此过程中形成了pB33。把pB33质粒的启动子-多接头-终止子片段克隆到用EcoRI和HindIII线性化(为EcoRI/HindIII片段)的pBIB质粒中。因此形成了质粒pB33Hyg。
其后在用Asp718/SalI消化后从质粒pSK-GK分离出葡糖激酶的编码区，并将其作为Asp718/SalI片段克隆到质粒pB33Hyg中。这样就形成了用于转化转基因马铃薯系U-Inv-2(系30)的质粒pB33Hyg-GK。
为了转化根癌土壤杆菌，按照Hfgen和Willmitzer的方法(核酸研究16(1988)，9877)通过直接转化将此二元质粒引入到所说的细胞中。按照Birnboim等的方法(核酸研究7(1979)，1513-1523)分离转化的土壤杆菌属的质粒DNA，在合适的限制性酶切后通过凝胶电泳对其进行分析。例如为了转化马铃薯植物，将10块用解剖刀切割的无菌培养物的小叶片放在10ml含有2％(重量/体积)蔗糖的MS培养基中。此培养基含有50μl在选择条件下生长的根癌土壤杆菌的过夜培养物。将其温和振荡3-5分钟后，于25℃在黑暗中将培养皿培养2天。2天后将叶片放在含有1.6％(重量/体积)葡萄糖、2mg/l玉米素核糖、0.02mg/l萘乙酸、0.02mg/l的赤霉酸、500mg/lclaforan、3mg/l潮霉素和0.8％的细菌培养用琼脂的MS培养基中。25℃和3000 lux下培养一周，然后将培养基中的claforan浓度降低50％。按照Rocha-Sosa等的方法(EMBO J.8(1989)，23-29)再进行培养。
实施例3
在块茎中表达酵母的转化酶和运动发酵单胞菌的葡糖激酶的转基因马铃薯植物的分析
将已经用二元构建体pB33Hyg-GK转化的U-Inv-2系(30)的再生马铃薯植物移栽到土壤中，并选择其块茎中的葡糖激酶活性。鉴定了几种基因型，它们与对照植物(例如GK-41，GK-29，GK-38)相比，葡糖激酶活性高出5倍。此外，证明了这些基因型还表达了酵母的转化酶基因(参见表I)。
表I
植物          转化酶活性                葡糖激酶活性
      (nmol-1分钟-1mg-1蛋白质) (nmol-1分钟-1mg-1蛋白质)
对照            9±1                       11±2
U-Inv-2         1027±44                   18±2
GK-41           n.d.                       43±5
GK-29           n.d.                       45±5
GK-38           1132±232                  55±13
上述的酶活性是来自五个独立植物的至少五个测量的平均值。
扩增上述的基因型GK-41，GK-29和GK-38，并将每一种的15个植物移栽到温室中。4个月后收获块茎。令人惊奇地发现转基因植物GK-41，GK-29和GK-38含有的淀粉量只为对照植物的40-60％，而不合淀粉的干物质相同(参见表II)。这表明在GK-植物的块茎中只有淀粉含量减少，这是因为转化酶和葡糖激酶的共同表达。此外，还发现产量降低了25％。在另一方面这和淀粉含量降低有关。
表II
植物     每个植物的产量    比重     淀粉％  干物质％
对照     191g              1.091    16.1    22.5
U-Inv-2  147g              1.074    12.7    18.9
GK-41    139g              1.064    10.7    16.8
GK-29    135g              1.058    9.5     15.5
GK-41    137g              1.046    7.1     13.4
对可溶解的糖(如葡萄糖、果糖和蔗糖)的分析出人意料地表明与野生型相比U-Inv-2植物中葡萄糖浓度7倍的增加由于葡糖激酶的表达而严重地减少。因此，葡萄糖的量仅为WT对照植物块茎中葡萄糖量的30％。与对照植物相比，转基因系中果糖浓度保持不变。U-Inv-2植物中的蔗糖量的严重降低由于葡糖激酶的表达而部分抵消(参见表III)。总之，发现GK-38植物块茎中淀粉含量仅为未转化的对照植物块茎淀粉含量的40％，可溶性糖含量仅为其的50％。表III
植物      葡萄糖        果糖              蔗糖
                 以μmolg-1鲜重表示
对照      3.5±2.2    0.9±0.2          12.0±1.0
U-Inv-2   25.7±3.1   0.6±0.3          0.7±0.4
GK-38     1.0±0.7    0.2±0.1          6.3±1.4
没有证据表明GK-植物中的经韧皮部从成熟叶片运输至块茎中的光同化物量降低。另一方面，测量到淀粉和可溶性糖的百分含量降低。因此，可以推测转化酶和葡糖激酶在植物细胞的细胞溶质中的共同表达可以增加糖酵解和呼吸。
GK植物块茎提取物中代谢物含量的变化和酶活性的变化进一步证明了这一出人意料的结果。已经发现葡萄糖-6-磷酸酯的含量增加多达5倍，果糖-6-磷酸酯的含量增加多达5倍，3-磷酸甘油酸酯的含量增加了大约40％，丙酮酸酯的含量增加了大约6倍，ATP含量增加多达50％(参见表IV)。
表IV
代谢物         对照     U-Inv-2   GK-38葡萄糖-6-磷酸酯    107±15  343±19   51356葡萄糖-l-磷酸酯    13±1    25±2     17±4果糖-6-磷酸酯      29±5    100±6    153±19UDP葡萄糖          126±12  91±11    107±43-磷酸甘油酸酯     92±18   127±22   135±35磷酸烯醇丙酮酸酯   33±4    34±8     37±11丙酮酸酯           15±3    27±5     84±23ATP                32±2    27±7     45±7ADP                24±2    25±4     28±2
上述代谢物的量是来自五个独立植物的至少五个测量的平均值。这些值以nmolg-1鲜重表示。
此外，已表明催化糖酵解反应的酶活性在GK-植物的块茎提取物中有所增加(参见表V)。
例如果糖激酶、磷酸果糖激酶、甘油醛-3-磷酸酯-脱氢酶(GAP-DH)和丙酮酸激酶的比活都有所增加。
转化酶和葡糖激酶在植物细胞细胞溶质中的共同表达构成了导致糖酵解和呼吸增加的方法。表V
   酶         对照       U-Inv-2    GK-38蔗糖合成酶     41±5      15±4      236±85
果糖激酶      52±2      90±7      88±5磷酸葡萄糖变位酶  1635±150  1354±79   1408±24磷酸果糖激酶    54±4      89±7      98±4
GAP-DH        942±56    1791±190  1926±145磷酸甘油酸激酶   883±83    962±78    901±22磷酸甘油酸变位酶  539±68    553±19    615±21丙酮酸激酶     532±42    551±29    688±33
上述酶活性是来自五个独立植物的至少五个测量的平均值。这些值以nmol分钟-1mg-1鲜重表示。
实施例4
块茎的气体交换的测定
对仍在生长的块茎测定CO2的产生(表VI)。
表VI
        对照       U-Inv-2   GK-38
CO2    18±2.0    58±7.0   84±6.0
上述值是来自6个独立植物的6个测量的平均值。这些值以CO2g-1鲜重表示。
表VI的数据表明U-Inv-2植物产生高达3倍的CO2，GK-植物产生高达5倍的CO2。
这些出乎意料的结果表明转化酶和葡糖激酶在细胞溶质中的共同表达构成了导致植物细胞中糖酵解和呼吸增加的方法。
上述实验中的对照是用于转化的植物物种或亚种的非转化植物。

Claims (35)

1.一种转基因植物细胞，和非转化的植物细胞相比，这种细胞显示出增加的糖酵解速率，并且在这种植物细胞中由于编码细胞溶质转化酶的DNA序列的引入和表达以及编码细胞溶质己糖激酶的DNA序列的引入和表达，增加了所说的转化酶和己糖激酶活性。
2.权利要求1的转基因植物细胞，其中所说的转化酶是反常酶。
3.权利要求1的转基因植物细胞，其中所说的转化酶是无规酶。
4.权利要求1至3任一之转基因植物细胞，其中所说的己糖激酶是反常酶。
5.权利要求1至3任一之转基因植物细胞，其中所说的己糖激酶是无规酶。
6.权利要求1至5任一之转基因植物，其中所说的己糖激酶是葡糖激酶。
7.权利要求1至6任一之转基因植物细胞，其中所说的编码转化酶的DNA序列编码真菌的转化酶。
8.权利要求7的转基因植物细胞，其中所说的转化酶是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的转化酶。
9.权利要求8的转基因植物细胞，其中所说的编码转化酶的DNA序列是酿酒酵母的Suc2基因。
10.权利要求1至9任一之转基因植物细胞，其中所说的己糖激酶是原核生物的己糖激酶。
11.权利要求10的转基因植物细胞，其中所说的己糖激酶是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡糖激酶。
12.权利要求1至11任一之转基因植物细胞，其中所说的编码转化酶的DNA序列是在组织特异性启动子、或者是植物发育的一定阶段具有活性的启动子、或者是由外部因素诱导的启动子的控制之下。
13.权利要求1至12任一之转基因植物细胞，其中所说的编码己糖激酶的DNA序列是在组织特异性启动子、或者是植物发育的一定阶段具有活性的启动子、或者是由外部因素诱导的启动子的控制之下。
14.权利要求1至13的任一之转基因植物细胞，其中所说的细胞来自有用的植物。
15.权利要求14的转基因植物细胞，其中所说的细胞来自油料植物。
16.权利要求15的转基因植物细胞，其中所说的细胞来自油料种子芸苔、大豆、向日葵或者油棕榈。
17.权利要求14的转基因植物细胞，其中所说的细胞来自积累淀粉的植物。
18.权利要求17的转基因植物细胞，其中所说的细胞来自玉米、稻米、小麦、大麦、黑麦、燕麦或者土豆。
19.一种转基因植物，这种植物是通过再生权利要求1至18任一之植物细胞而获得的。
20.一种转基因植物，这种转基因植物含有权利要求1至18任一之植物细胞。
21.权利要求19或者20的转基因植物，在这种植物中由于伴胞糖酵解速率的增加而增加了光同化物的运输速率。
22.权利要求19至21任一之转基因植物，在这种植物中由于根表皮或者根毛细胞中的糖酵解速率增加而增加了从土壤吸收的矿物质。
23.权利要求19至22任一之转基因植物，在这种植物中由于在胚乳和/或者种子子叶中的糖酵解速率增加而增加了脂肪酸的生物合成。
24.权利要求19至23任一之转基因植物，在这种植物中由于器官的糖酵解速率增加，因而增加了脂肪酸含量，同时淀粉含量减少。
25.权利要求19至24任一之植物的繁殖材料，这种材料包含权利要求1至18任一之转基因植物细胞。
26.一种生产糖酵解速率增加的转基因植物细胞的方法，在这种方法中将编码细胞溶质转化酶的DNA序列和编码细胞溶质己糖激酶的DNA序列引入到植物细胞中，并且在这种方法中这些DNA序列在转化的植物细胞中表达。
27.权利要求26的方法，其中所说的转化酶是反常或者无规酶。
28.权利要求26或27的方法，其中所说的己糖激酶是反常或者无规酶。
29.权利要求26至28任一之方法，其中所说的己糖激酶是葡糖激酶。
30.一种重组DNA分子，这种DNA分子包含下列DNA序列：(i)与在植物细胞中确保转录和翻译的DNA序列组合在一起的编码细胞溶质转化酶的DNA序列；和(ii)与在植物细胞中确保转录和翻译的DNA序列组合在一起的编码细胞溶质己糖激酶的DNA序列。
31.一种重组DNA分子，这种DNA分子包含与在植物细胞中确保转录和翻译的DNA序列组合在一起的编码具有己糖激酶酶促活性的蛋白质的DNA序列。
32.权利要求30或者31的重组DNA分子，其中所说的己糖激酶是葡糖激酶。
33.编码转化酶的DNA序列在产生转基因植物细胞中的用途，这种细胞与非转化的植物细胞相比，显示出增加的糖酵解速率。
34.编码己糖激酶的DNA序列在产生转基因植物细胞中的用途，这种细胞与非转化的植物细胞相比，显示出增加的糖酵解速率。
35.权利要求33的用途，其中所说的己糖激酶是葡糖激酶。
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