JP6369839B2 - 植物における組換えタンパク質の過剰発現のための5’(5’−utr)に最適化されたリーダー機能を持つ人工dna配列と植物における組換えタンパク質の産生方法 - Google Patents
植物における組換えタンパク質の過剰発現のための5’(5’−utr)に最適化されたリーダー機能を持つ人工dna配列と植物における組換えタンパク質の産生方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6369839B2 JP6369839B2 JP2015552194A JP2015552194A JP6369839B2 JP 6369839 B2 JP6369839 B2 JP 6369839B2 JP 2015552194 A JP2015552194 A JP 2015552194A JP 2015552194 A JP2015552194 A JP 2015552194A JP 6369839 B2 JP6369839 B2 JP 6369839B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- poly
- region
- artificial dna
- caa
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/30—Vector systems having a special element relevant for transcription being an enhancer not forming part of the promoter region
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
Description
−m7Gppp(5’−cap)5’末端に存在する構造mRNAの末端は、リボソーム40Sサブユニット(Franks and Likke-Andersen, 2008)に結合することができるeIF4F複合体を局在化するために不可欠である;
−そのeIF4G成分を介して、eIF4F複合体は、mRNAの3’末端に存在するポリ(A)テールと、後半部分の循環構造を想定して相互作用する(Franks and Likke-Andersen, 2008);
−ポリ(A)テールとeIF4Fの複合体は、5’−cap構造の酵素加水分解を減少させ、そのためモノ−リン酸5’末端において細胞質エキソヌクレアーゼによるmRNAの急速な分解を防止する(Franks and Likke-Andersen, 2008);
−5’−UTR配列は、5’−cap構造、後半部分とeIF4Eの結合、リボソーム40Sサブユニットの局在化、ポリソームの構成、43S複合体の自発的解離速度、真正翻訳開始AUGコドンの認識に影響を与える要素を含む;
−5’ −UTR配列はまた、特定の転写因子のためのDNAへの結合部位を表す配列を含むため、上流のプロモーターの転写活性を変更することができる;
ことを証明する。
1.効率的なmRNAキャッピングのためのCaMV35S遺伝子のInr部位;
2.TMVΩリーダーの「翻訳エンハンサー」に類似するポリ(CAA)領域(Gallie and Walbot, 1992);
3.いくつかの植物リーダーと類似のCT要素が豊富な配列(Bolle et al., 1996);
4.TMVΩリーダーの八量体。
1.イニシエータ部位(TATTTTTA)のすぐ下流;
2.ポリ(CAA)(AATA)トラクトの内側;
3.八量体(ATTA)を含む部位で、このトラクトの末端;
4.八量体(TATTT)のすぐ下流;
に位置していると強調されている。
1.5’−UTR配列からA/Tリッチモチーフを除くことを教示していない、
2.オメガ由来またはAMV由来の5’−UTR配列からATTトリプレットを除くことを教示していない、むしろ逆である、
3.ATTトリプレットを有するか否かという、A/Tリッチモチーフの非存在下での遺伝子発現に有利なコンテキストを作成する方法を教示していない、
4.WO2008/080954の実施例で使用しているLLTCKリーダーに、より効率的な変異体を構築する方法を教示していない、
と結論付けることができる。
Y=C、T;
N=A、C、G、T;
W=A、T
である。
i)天然または人工由来の胚乳特異的プロモーター、すなわち、5’位では、タンパク質の成熟型をコードする天然または人工由来のヌクレオチド配列;
ii)ここで説明する、植物における組換えタンパク質の発現を増加させるのに有効な5’−UTリーダー領域の人工DNA;
iii)胚乳の組織を構成するため、その組織の蓄積に有利に働く細胞の、小胞体のルーメン内部の組換えタンパク質を標的とするシグナルペプチドをコードする、天然または人工由来のヌクレオチド配列;
iv)目的のタンパク質の成熟型をコードする天然または人工由来のヌクレオチド配列;
v)天然または人工由来の3’−UTR領域
を含む。
−分子の生物工学的生産のための使用
−例えば、ウイルス、細菌または真菌病原体に対する耐性を誘導することを意図した、除草剤への耐性を誘導することを意図した、原料および派生製品の脂肪酸で改変された組成物を得るための、原料および派生製品の改変された栄養価を得るための、または燃料、ゴムおよび/またはバイオプラスチックを製造するための組換えタンパク質の合成のための使用
−産業用酵素と商業用タンパク質の合成のための使用
−医薬品用タンパク質の合成のための使用
−ヒトまたは動物用経口投与ワクチン、ヒトまたは動物用の注射可能なワクチン、リンパ管の腫瘍の治療に使用される、好ましくはイディオタイプ特異的な、患者に特異的な注射可能なワクチンからなる群から選択されるワクチンの合成のための使用
−二次代謝産物の生産に関与するタンパク質の合成のための使用
−形質転換された細胞の同定および/または選択における因子として、直接または間接的に使用可能なタンパク質の合成のための使用
からなる群から選択される使用のための、本明細書に記載の実施形態による人工DNA配列に関する。
1.A/Tリッチモチーフ、すなわち、いかなるコンビネーションにおいても、3つ以上、必要に応じて4つ以上のアデニン(A)及び/又はチミン(T)ヌクレオチドから構成される配列が存在しない。
2.ATTトリヌクレオチド要素が存在しない。
3.CTGトリヌクレオチド要素が存在しない。
4.ホモポリマー領域、すなわち3より多い、または必要に応じて4より多い同一のヌクレオチドの配列が存在しない。
(1)5’−ACACGAAGTTTCCAACAACAACAACAACAACAACTCTCTCTCTCAACAACAACAACAACAACAAAGCTCTCTAGA−3’である。
(2)5’−TCACATCAAGTTTCCAACAACAACAACAACAACAACTCTCTCTCTCAACAACAACAACAACAACAAAGCTCTCTAGA−3’である。
表1:コンストラクト35S−LLTCK:::uidA::NOSter及び35S−STE::uidA::NOSterで形質転換された植物で得られた平均データについて実施したANOVA
pCAMBIA1300/PMI/GluB4−LLTCK::GCasi::GluB4ter;
pCAMBIA1300/PMI/GluB4−STE::GCasi::GluB4ter。
表2:コンストラクトpCAMBIA1300/PMI/GluB4−LLTCK::GCasi::GluB4ter及びpCAMBIA1300/PMI/GluB4−STE::GCasi::GluB4terで形質転換された植物で得られたデータについて実行したANOVA
ベクターpSTART−STEを作製産生するための出発点は、以前の研究(De Amics et al., 2007)で得られた発現ベクターpSTARTであった。この最後のベクターは、オリジナルのベクターpBI121(Clontech社)の改変から得られた順に、LLTCKリーダー、GUSタンパク質をコードするレポーター遺伝子とNOSターミネーターを有するCaMV35Sプロモーターから構成されるなる発現カセットを有する。pSTART−STE(図3A)を取得するために、pSTARTでLLTCKリーダーはSTEリーダーに置き換えられた。この目的のために、STEリーダーの配列が追加された35Sプロモーター(ScaI部位から)の一部に対応する配列を、この場合配列番号1の例の形で人工的に合成した、合成された領域(702bp、図3(b))は、制限酵素ScaIおよびXbaIによる分解、ベクターの回復、及び新しい合成配列のDNAリガーゼによるライゲーションによりpSTARTに置き換えられた。
リーダー配列LLTCKおよびSTEは、人工的に合成した。特に、両方の場合において、合成領域は、イネのグルテリン4プロモータ(GluB4)の末端部分に存在するBfrI部位と、リーダー自身の3’末端(図4Bおよび4C)に存在するXbaI部位との間に含まれる配列に対応した。より正確には、この領域は、LLTCKの328塩基対(図1B)とSTE(図4C)の315塩基対と同等の結果となった。
pCAMBIA1300/PMI/GluB4−LLTCK:GCasi::GluB4ter、及び
pCAMBIAl300/PMI/GluB4−STE:GCasi::GluB4terを構成するように(図4A)、最終的な発現ベクターpCAMBIA1300/PMIでクローン化された。
ニコチアナ・タバカム栽培品種Xanthi(Nicotiana tabacum,cv.Xanthi)の遺伝的形質転換のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens Horschら(1985)のプロトコルを使用した。私たちは、簡単に全体の手順の主なステップを記述する。
種子の消毒
A.ツメファシエンス(A.tumefaciens)を用いたN.タバカム(N.tabacum)の葉材料の形質転換は、以下の手順で行った。
・フードの下で、4−5×2mLの試験管に1.8mLの滅菌LBブロスを満たす。滅菌した爪楊枝で、プレート上で増殖させた小さいが可視量の細菌コロニーを拾って、A.ツメファシエンス(A.tumefaciens)を接種する、続いて、試験管内でそれを希釈し、激しく撹拌する。
・無菌のパンチを使用してタバコの葉(約1ヶ月齢の植物から)を取り、葉身から直径7mmのディスクを作成する。ペンチを使って葉のディスクをMS10基質プレートに、プレート一枚当たり30ディスクのせる。各細菌株あたり、少なくとも合計200ディスクとする。決して感染させないディスク、及び常にMS10培地上にあるディスクをのせるための2つの対照プレートを準備する。
・ディスクを含むプレート上に、直前に細菌を植菌した試験管の内容物を注ぎ、A.ツメファシエンス(A.tumefaciens)のディスクを感染させる。全てのディスクが濡れるように回転運動で軽くかき混ぜ、その後ピペットで余分な液体を除去する。ペンチを使用して、定期的にディスクを配置する。
・成長室で、28℃の温度で、プレートを一晩、一定の光の中でインキュベートする。
・MS10セフォタキシム500mg/Lの基質の上に葉のディスクを移す。
・一定の光の中で、24℃の温度で6日間インキュベートする。
・形質転換開始8日後、形質転換されたカルスの選択のためにMS10セフォタキシム500mg/L−カナマイシン200mgの/Lの基質上に葉のディスクを移す。上記と同じ条件下で14日間インキュベートする。
・キメラでない正常な外観の、少なくとも2枚の葉からなるシュートを切り取る。それらを、定着のための基質(MS0、セフォタキシム500mg/L−カナマイシン200mg/L−IBA2mg/L)上に移す。
・水で根についた基質を優しく洗い流し、根付いた植物を成長させるため、鉢植え泥炭や水耕栽培システムに移植する。植物を、16時間の採光と8時間の闇の光周期で26〜30℃の温度を維持した気候室に配置する。
CR W3種のイネの形質転換のために、形質転換カルスが得られるまで、Hoge(イネ研究グループ、植物科学研究所、ライデン大学)とGuiderdoni(Biotropプログラム、CIRAD、モンペリエ、フランス)によって修正されつつHieiら(1994)のプロトコルが使用された。その後の選択工程のためにDattaとDatta(2006)のプロトコルが使用された。私たちは今、簡単に全体の手順の主なステップを記述する。
イネの胚盤からの胚形成カルスの調製と開発
・イネの種子を剥いた(包頴の排除)
・潜在的な汚染物質病原体及びカルスの生成を妨げる腐生菌除去を除去するため、包頴無しの穀果を消毒した
a.最初の消毒処理において、剥いた種子を70%エタノール溶液中で2分間放置した
b.エタノール処理後、種子を、Tween20洗浄剤を2滴加えた5%ナトリウム塩酸塩の溶液に移し、30分間ゆっくり攪拌しながら保持した
c.胚盤中のカルスの誘導を阻害し得るナトリウム塩酸塩の全ての痕跡を除去するために、それぞれ15分間滅菌水で一連の洗浄が行われた
・最後の洗浄の後、種子を滅菌吸収紙の上で乾燥させた
・プレート当たり12個の種子を、カルス(CIM、カルス誘導培地)を誘導するために使用される基質の表面上に配置し、ペトリ皿(直径90mm)中に25mLの容量で希釈した
・得られたプレートを暗所で、21日間温度28℃でインキュベートし、1週間インキュベーションした後、胚乳および細根が胚盤からカルスの発展を促進するために除去された(胚盤は少量で、一部が胚乳に含まれ、黄色であった)
・3週間インキュベーションした後、カルスは新鮮なCIMの基質上に転写した、続いてカルス塊はメスを使わずに砕かれ、カルス上に自然なヒビができた
・継代培養をさらに10日間続け胚形成カルスを成長させ、形質転換に適するようにした
カルスとA.ツメファシエンス(A.tumefaciens)EHA105の共培養
1.形質転換に十分な量のA.ツメファシエンス(A.tumefaciens)を得るために、上記のプラスミドベクター(実施例2)を有する株をLB寒天培地で30℃で3日間インキュベートした。
2.アグロバクテリウムが成長したときに、細菌細胞層をこすり落として、3−5・109細胞/mLに対応する約1.0のOD600が得られるまで、共培養培地液(CCML)に懸濁した
3.最高のカルス、すなわち、直径が約2mmで、小さく白っぽい色のものを、35mLの細菌懸濁液を含むペトリ皿に移して、15分間液に浸し、攪拌した
4.その後、カルスを、滅菌吸収紙を使用して乾燥した
5.最大20カルスを、共培養のための半固体基質(CCMS:co-cultivation medium solidified)を含有するハイエッジペトリ皿(Sarstedt社)に移した
6.カルスは、次いで、3日間25℃の温度で、暗い環境でインキュベートした
アグロバクテリウムとの胚形成イネカルスの共培養後、選択マーカーとしてPMI(ホスホイソメラーゼ)に基づく選択システムを用い、選択剤としてマンノースを使用して、形質転換された組織を選択した。この方法は、マンノースの濃度が増加しスクロースの濃度が減少することを含む培養基質を使用することを提供する。
・A.ツメファシエンス(A.tumefaciens)との共培養から、マンノースを含まず3%のスクロースとを含むPSM(事前選択培地)基質上にカルスを移動し、28℃の温度で暗所で1週間インキュベーションする。
・2%スクロースおよび1.5%のマンノースを含むSMI(選択培地I)基質上へカルスを移動し、28℃の温度で暗所で2週間インキュベーションする。
・1%スクロースおよび2%マンノースを含むSMII(選択培地II)基質上へカルスを移動し、28℃の温度で暗所で2週間インキュベーションする。
・再生が続く。
想定される形質転換された植物の再生は、ここで報告された手順に従って、形質転換カルスの適切なホルモン刺激により起きた。
1.選択した胚発生イネカルスを、0.5%スクロースおよび2.5%のマンノースを含むPRM基質(プレ再生培地)の入った高エッジペトリ皿上に移し、暗所で28℃で2週間インキュベーションした。
2.PRM基質上を通過した後、カルスはマンノースを含まないRM基質(再生培地)上に移した、高エッジペトリ皿当たり最大で8−10単位とした。植物は、3〜4週間、28℃で、光で増殖させた。
3.植物がカルスから分離されるのに十分に増殖させ(高さ3cm以上)、それらを発根培地25ml(rm)を含む培養チューブに移した。
4.チューブ内側の二次培養は、約3週間常に約28℃で光の中で続けた。
5.再生処理の終了時に、植物は、泥炭に移し温室条件下で成長させた。
(実施例5):4−MUGアッセイにより形質転換されたタバコの葉組織からの全タンパク質の抽出
・1.5mLの試験管に、15mgPVP(ポリビニルピロリドン、MW>40000g/mol)を秤量し、抽出緩衝液(表3を参照)200μLを加えてボルテックス撹拌し、4℃で少なくとも30分間インキュベーションした
・Meku Pollahneプレスを用いて葉汁を抽出
・葉汁100μLを除去し、氷中ですべてを維持しながら、バッファーPVPの混合物に加えた
・4℃で11500回転で15分間遠心分離
・上清(〜200μL)を除去し、新しい試験管に即座に移動する
・すぐに液体窒素を用いて凍結し、−80℃で保存する
(実施例6):蛍光4−MUGアッセイ
・96ウェルプレート(低結合、Sarstedt社)で、MUG溶液(表4)130μLに葉抽出物10μLを加えた
・37℃で1時間インキュベーション
・反応液20μLを除去し、96ウェル(サンプル当たりに少なくとも2回繰り返し)の不透明なプレートのNa2C030.2M(停止液)230μLに迅速に加える
・不透明なプレートで4-MUで検量線を引く(1mM、と連続する希釈液1:2、計4〜5点に対して)
・プレート蛍光光度計を使用して値を読む
・カーブフィッティングデータ解析(Promega社)ソフトウェアを使用して結果を処理する。
(実施例7):形質転換イネの種子からの総タンパク質の抽出
・稲穂を各個体から採取する
・種の相対湿度が14%になるまで、稲穂を約3日間乾燥した風通しのよい場所で乾燥した
・各ラインの種子40個をランダムにサンプリング
・種子は、手動の脱穀機で剥いた
・サンプルを、MM2(Retsch社)振動マイクロミルで、20ヘルツの速度で2分間粉砕し、得られた小麦粉70mgを除去した
・小麦粉を抽出緩衝液(トリス塩酸50mM、塩化ナトリウム0.5M、pH7.0)1mLで乳鉢でホモジナイズした
・続いて、別途7mLの同じ緩衝液で希釈
・連続して攪拌しながら4℃で1時間インキュベーション
・1mLを除去し、4℃で、20000回転で40分間遠心分離した
・タンパク質を含む液相を回収し、−20℃で保存した
(実施例8):DAS−ELISAアッセイ
・各ウェルに、2ng/μLに希釈した抗GCasi非結合ポリクローナル抗体(PBSをアジ化ナトリウム(0.01%)で1:5に希釈)100μLを分配する
・プレートを4℃で一晩インキュベートする
・抗体を除去する
・各ウェルに、250〜300μLのブロッキング溶液(PBS+BSA 2.5%+アジ化ナトリウム0.01%)を分配する
・プレートを25℃で20分間インキュベートする
・ブロッキング溶液を除去する
・50μL/ウェルの標準の希釈液(200、100、50、25pg/μL 市販のイミグルセラーゼ;サノフィ−ジェンザイム社製)、分析用サンプル、及び希釈液(PBS+Tween20 0.1%+1%BSA)からなるコントロールサンプルを分配する
・プレートを攪拌しながら37℃で30分間インキュベートする
・300μL/ウェル(PBS+0.1% Tween20)でウェルを3回洗浄する;
・配布50μL/ウェル ポリクローナル抗体抗GCasiの0.4ngの/μL希釈液で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート;
・攪拌しながら37℃で30分間、プレートをインキュベートし;
・300μL/ウェル(PBS+0.1%のTween20)の洗浄液でウェルを3回洗浄する
・TMB溶液100μL/ウェルを分配する
・プレートを25℃で約10分間インキュベートする
・100μL/ウェルの停止液(塩酸1M)で反応を停止する
・プレートリーダーモジュラスII(Promega社)を用いて450nmでプレートを読む
・標準の公知の濃度値を割り当てるカーブフィッティングデータ解析ソフトウェア(Promega社)を用いてデータを処理する。試料の濃度値は、抽出物の実際の濃度を得るために採用した希釈係数を考慮しながら、4つのパラメータで線形曲線を用いて得た。
Beerman RW, Jongens TA (2011) A non-canonical start codon in the Drosophila fragile X gene yields two functional isoforms. Neuroscience 181: 48-66
Bradford M.M. (1976) Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254
Franks TM, Lykke-Andersen J (2008) The control of mRNA decapping and P- body formation. Mol Cell. 32(5): 605-615
Gallie DR, Walbot V (1992) Identification of the motifs within the tobacco mosaic virus 5'-leader responsible for enhancing translation. Nucleic Acids Res 20: 4631-4638
Gerashchenko MV et al. (2010) CUG start codon generates thioredoxin/glutathione reductase isoforms in mouse testes. The Journal of Biological Chemistry, 285: 4595-4602
Guilley H et al. (1982) Transcription of Cauliflower Mosaic Virus DNA:
detection of promoter sequences, and characterization of transcripts. Cell 30: 763-773
Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plants: the GUS fusion gene system. Plant Molecular Biology Reporter 4: 387-405
Schmitz J et al. (1996) Non canonical translation mechanisms in plants: efficient in vitro and in planta initiation at AUU codons of the tobacco mosaic virus enhancer sequence. Nucleic Acids Res 24: 257-263
Simpson GG et al. (2010) Non-canonical translation initiation of the Arabidopsis flowering time and alternative polyadenylation regulator FCA. The Plant Cell 22: 3764-3777
Tyc K et al. (1984) Multiple ribosome binding to the 5'-terminal leader sequence of tobacco mosaic virus RNA. Assembly of an 80S ribosome X mRNA complex at the AUU codon. Eur J Biochem. 140(3): 503-511
Claims (12)
- 5’−UTRのリーダー領域の人工DNAであって、
前記人工DNAは、植物における組換えタンパク質の発現を増加させるのに有効であり、
前記人工DNAは、5’→3’方向に沿って、Inrイニシエータ部位とコザックまたはコザック様コンセンサス配列を含み、
前記人工DNAは、さらにInrイニシエータ部位と、コザックまたはコザック様コンセンサス配列との間に、それぞれ、互いに隣接するCAA要素の2つ以上のコピーから構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される、複数のポリ(CAA)または(CAA)n領域、及び前記ポリ(CAA)領域と同じ数であり、互いに隣接するCT要素の2つ以上のコピーから構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される、複数のポリ(CT)または(CT)m領域を含み、ここで
少なくとも一つ、任意にそれぞれ1つのポリ(CAA)領域は、5’→3’方向でポリ(CT)領域と少なくとも一つのポリ(CAA)領域の上流にあり、5’→3’方向でポリ(CT)領域と隣接しており、
ただし、前記人工DNAは、A/Tリッチモチーフ、ATTトリヌクレオチド要素、CTGトリヌクレオチド要素、及びホモポリマー領域、すなわち3より多く、または4より多くの同一のヌクレオチドから構成される配列、を含まないことを特徴とする人工DNA。 - nが整数であり、同一の又は異なるポリ(CAA)領域から選ばれ、2以上、3から9の間、4から8の間、または5から7の間である請求項1に記載の人工DNA。
- mが整数であり、同一の又は異なるポリ(CT)領域から選ばれ、2以上、または3から5の間である請求項1または2に記載の人工DNA。
- 2つのポリ(CAA)領域と2つのポリ(CT)領域を含み、第1のポリ(CAA)領域が第1のポリ(CT)領域の上流にあり、第2のポリ(CAA)領域が前記第1のポリ(CT)領域の下流、かつ第2のポリ(CT)領域の上流にある請求項1〜3のいずれか一項に記載の人工DNA。
- Inrイニシエータ部位がCaMV35Sの転写開始部位5’−ACACG−3’であるか、または、コンセンサス配列5’−YYANWYY−3’をもつInrイニシエータ部位であり、ここで
Y=C、T;
N=A、C、G、T;
W=A、T
である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の人工DNA。 - 配列番号1に示される配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の人工DNA。
- 配列番号2に示される配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の人工DNA。
- コザックまたはコザック様コンセンサス配列が、翻訳開始コドンから3つ上流に位置する要素Rの存在を必要とする配列である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の人工DNA。
- A/Tリッチモチーフが、3より多く、または4より多くの、アデニン(A)および/またはチミン(T)の任意の組合せのヌクレオチドから構成される領域または配列として定義づけられる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の人工DNA。
- 前記人工DNAが、ACAATTAC八量体を含まない、請求項1〜9のいずれか一項に記載の人工DNA。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の植物における組換えタンパク質の発現を増加させるのに有効な5’−UTRリーダー領域の人工DNAを含む発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターを用いて植物を形質転換することを含む、植物における組換えタンパク質の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT000002A ITUD20130002A1 (it) | 2013-01-16 | 2013-01-16 | Sequenza artificiale di dna avente funzione di leader in 5' (5'-utr) ottimizzata per la sovraespressione di proteine ricombinanti in pianta e metodo per la produzione di proteine ricombinanti in pianta |
ITUD2013A000002 | 2013-01-16 | ||
PCT/IB2014/058289 WO2014111858A1 (en) | 2013-01-16 | 2014-01-15 | Artificial dna sequence with optimized leader function in 5' (5'-utr) for the over-expression of recombinant proteins in plants and method for the production of recombinant proteins in plants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016502864A JP2016502864A (ja) | 2016-02-01 |
JP6369839B2 true JP6369839B2 (ja) | 2018-08-15 |
Family
ID=47749983
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015552194A Expired - Fee Related JP6369839B2 (ja) | 2013-01-16 | 2014-01-15 | 植物における組換えタンパク質の過剰発現のための5’(5’−utr)に最適化されたリーダー機能を持つ人工dna配列と植物における組換えタンパク質の産生方法 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9976151B2 (ja) |
EP (1) | EP2946017B1 (ja) |
JP (1) | JP6369839B2 (ja) |
KR (1) | KR20150113013A (ja) |
CN (1) | CN105247057B (ja) |
BR (1) | BR112015016973A2 (ja) |
CA (1) | CA2898388A1 (ja) |
ES (1) | ES2627490T3 (ja) |
HK (1) | HK1219979A1 (ja) |
HU (1) | HUE033589T2 (ja) |
IL (1) | IL239956B (ja) |
IT (1) | ITUD20130002A1 (ja) |
PL (1) | PL2946017T3 (ja) |
SA (1) | SA515360791B1 (ja) |
WO (1) | WO2014111858A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT201700042052A1 (it) | 2017-04-14 | 2018-10-14 | Transactiva S R L | Vettore di espressione e metodo per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un anticorpo ricombinante in endosperma di cereale |
ES2952779T3 (es) | 2017-05-18 | 2023-11-06 | Modernatx Inc | ARN mensajero modificado que comprende elementos de ARN funcionales |
IT202100022157A1 (it) | 2021-08-20 | 2023-02-20 | Transactiva S R L | Promotore sintetico per l’espressione di proteine eterologhe in pianta |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9206016D0 (en) * | 1992-03-19 | 1992-04-29 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
CN1164755C (zh) * | 2001-09-05 | 2004-09-01 | 南京大学 | 一种改善外源基因在大肠杆菌中可溶性表达的方法 |
ITUD20060280A1 (it) * | 2006-12-29 | 2008-06-30 | Univ Degli Studi Udine | Sequenza artificiale di dna evente funzione di leader in 5' (5'-utr) ottimizzata per la sovraespressione di proteine eterologhe in pianta |
ITUD20080055A1 (it) * | 2008-03-13 | 2009-09-14 | Transactiva S R L | Procedimento per la produzione di una proteina umana in pianta, in particolare un enzima lisosomiale umano ricombinante in endosperma di cereali |
-
2013
- 2013-01-16 IT IT000002A patent/ITUD20130002A1/it unknown
-
2014
- 2014-01-15 BR BR112015016973-2A patent/BR112015016973A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-01-15 US US14/761,431 patent/US9976151B2/en active Active
- 2014-01-15 ES ES14707214.4T patent/ES2627490T3/es active Active
- 2014-01-15 EP EP14707214.4A patent/EP2946017B1/en active Active
- 2014-01-15 HU HUE14707214A patent/HUE033589T2/hu unknown
- 2014-01-15 WO PCT/IB2014/058289 patent/WO2014111858A1/en active Application Filing
- 2014-01-15 CN CN201480014433.0A patent/CN105247057B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2014-01-15 CA CA2898388A patent/CA2898388A1/en not_active Abandoned
- 2014-01-15 JP JP2015552194A patent/JP6369839B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-01-15 KR KR1020157021867A patent/KR20150113013A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-01-15 PL PL14707214T patent/PL2946017T3/pl unknown
-
2015
- 2015-07-15 IL IL239956A patent/IL239956B/en not_active IP Right Cessation
- 2015-07-22 SA SA515360791A patent/SA515360791B1/ar unknown
-
2016
- 2016-07-11 HK HK16108044.1A patent/HK1219979A1/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2946017B1 (en) | 2017-03-01 |
IL239956B (en) | 2018-08-30 |
US9976151B2 (en) | 2018-05-22 |
CN105247057A (zh) | 2016-01-13 |
HK1219979A1 (zh) | 2017-04-21 |
KR20150113013A (ko) | 2015-10-07 |
WO2014111858A1 (en) | 2014-07-24 |
JP2016502864A (ja) | 2016-02-01 |
PL2946017T3 (pl) | 2017-09-29 |
CN105247057B (zh) | 2018-11-02 |
SA515360791B1 (ar) | 2017-11-07 |
EP2946017A1 (en) | 2015-11-25 |
HUE033589T2 (hu) | 2017-12-28 |
ES2627490T3 (es) | 2017-07-28 |
US20160130593A1 (en) | 2016-05-12 |
ITUD20130002A1 (it) | 2014-07-17 |
BR112015016973A2 (pt) | 2021-08-03 |
CA2898388A1 (en) | 2014-07-24 |
IL239956A0 (en) | 2015-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2559534C2 (ru) | Регуляторные молекулы нуклеиновых кислот для усиления семя-специфичной и/или семя-предпочтительной генной экспрессии в растениях | |
WO2011060552A9 (en) | Variegation in plants | |
Buyel et al. | Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5′ UTR combination | |
CA3036968A1 (en) | Trichome specific promoters for the manipulation of cannabinoids and other compounds in glandular trichomes | |
KR20080083145A (ko) | 구성적 식물 프로모터 | |
JP6369839B2 (ja) | 植物における組換えタンパク質の過剰発現のための5’(5’−utr)に最適化されたリーダー機能を持つ人工dna配列と植物における組換えタンパク質の産生方法 | |
JP5913434B2 (ja) | 植物における異種タンパク質の改善された発現のための、5’(5’−utr)における最適化されたリーダー機能を有する人工dna配列 | |
EP3112465A2 (en) | Method for identification and isolation of terminator sequences causing enhanced transcription | |
US20050262596A1 (en) | Embryo preferred promoter and method of using same | |
JP3571639B2 (ja) | さつまいも由来の新規ぺルオキシダーゼ遺伝子及びそのプロモーター | |
TW201014909A (en) | Plant techonology | |
EP3052633B1 (en) | Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof | |
AU2014329590A1 (en) | Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof | |
CN110317826B (zh) | 调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用 | |
TW201231659A (en) | Glycosyltransferase promoter from a medicinal herb on gene regulation and application | |
IL128111A (en) | A method of silencing expression of a target sequence in a plant genome | |
WO2009113603A1 (ja) | 転写抑制ペプチド及びその遺伝子 | |
WO2011154611A2 (en) | A method for enhanced protein synthesis | |
CN112159465B (zh) | Drn蛋白质及相关生物材料与其在提高植物体细胞再生效率上的应用 | |
JP4439844B2 (ja) | 植物の鉄欠乏応答性及び/又は根特異的発現を付与するシスエレメント | |
CN116836249A (zh) | 与小麦产量相关的三个同源基因及相关蛋白质 | |
Gray | Effects Of The Downstream Box Region On High-Level Expression Of Foreign Proteins In Plastid-Transformed Tobacco |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151117 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170106 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20171129 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171205 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180302 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20180404 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180605 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180703 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6369839 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |