BR112015016973A2 - sequência de adn artificial com função de líder otimizada em 5' (5'-utr) para a superexpressão de proteínas recombinantes em plantas e método para a produção de proteínas recombinantes em plantas - Google Patents

Abstract

SEQUÊNCIA DE ADN ARTIFICIAL COM FUNÇÃO DE LÍDER OTIMIZADA EM 5' (5'-UTR) PARA A SUPEREXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM PLANTAS E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM PLANTAS. A presente de uma região sendo efetivo invenção de líder trata de um de 5'-UTR, o ADN ADN no aumento da expressão de proteínas recombinantes em plantas, e compreende, ao longo da direção 5'3', um sítio de iniciador Inr e uma sequência de consenso de Kozak ou similar a Kozak, e também compreende, entre o sítio de iniciador Inr e a sequência de consenso de Kozak ou similar a Kozak, uma pluralidade de poli(CAA) e uma pluralidade de regiões de poli(CT), no mesmo número que as regiões de poli(CAA), sendo que pelo menos uma, opcionalmente cada uma, região de poli(CAA), na direção 5' 3', está à montante de uma região de poli(CT), e pelo menos uma região de poli(CAA), na direção 5'3', é contígua à uma região de poli(CT), sendo que o ADN artificial fornece a ausência de motivos ricos em A/T, a ausência de elementos de trinucleotídeo ATT, de trinucleotídeo CTG e a ausência de elementos ausência de tratos homopoliméricos, isto é, do que 3, opcionalmente mais do que 4, nucleotídeos idênticos.

Description

"SEQUÊNCIA DE ADN ARTIFICIAL COM FUNÇÃO DE LIDER OTIMIZADA EM 5' (5'-UTR) PARA A SUPEREXPRESSÃO DE

PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM PLANTAS E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM PLANTAS"

CAMPO DA INVENÇÃO [ 0001] A presente invenção se refere a uma sequência de ADN artificial com função de líder otimizada em 5' (5'-UTR) para a superexpressão de proteínas recombinantes em plantas e a um método para a produção de proteínas recombinantes em plantas.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[0002] Existem muitas abordagens que podem ser adotadas, a fim de aperfeiçoar a expressão de genes heterólogos em plantas. De fato, todos os elementos que constituem um gene exercem, ou podem exercer, uma função de controle sobre a expressão de gene, modulando o processo de transcrição e/ou de tradução. As sequências não traduzidas, presentes nas extremidades 5'- e 3'- do mARN (chamadas de 5'-UTR e 3'-UTR, em que as fitas UTR representam "região não traduzida"), não são exceção a isso e, de fato, têm que ser consideradas alvos preferenciais para modificações adequadas, uma vez que, em uma grande extensão, elas determinam a eficiência de tradução e a rotatividade do próprio mARN. De fato, evidências copiosas provam que: - a estrutura m7Gppp (5'-cap) presente no terminal 5' do mARN é essencial para o recrutamento do complexo eIF4F capaz de se ligar à subunidade 40S ribossomial (Franks e Likke-Andersen, 2008);

através do componente eIF4G, o complexo eIF4F interage com a cauda de poli(A) presente no terminal 3' do mARN, permitindo que o último assuma uma estrutura circular (Franks e Likke-Andersen, 2008); - a cauda de poli (A) e o complexo eIF4F reduzem a hidrólise enzimática da estrutura 5' -cap e, portanto, previnem a degradação rápida do mARN por exonucleases citoplásmicas ativas nos terminas 5' de monofosfato (Franks e Likke-Andersen, 2008); a sequência de 5'-UTR pode conter elementos capazes de influenciar a formação da estrutura 5'-cap, a ligação da última com o fator eIF4E, o recrutamento da subunidade 40S ribossomial, a constituição de polissomas, a taxa de dissociação espontânea do complexo 43S, o reconhecimento do códon de início de tradução autêntico AUG; a sequência de 5 '-UTR também pode conter sequências que representam sítios de ligação ao ADN para fatores de transcrição específicos, e, portanto, podem modificar a atividade de transcrição dos promotores à montante. [0003) Portanto, é evidente que a 5'-UTR, também chamada de região de líder, necessita ser particularmente considerada em programas de engenharia de plantas, a fim de aumentar o nível de expressão de proteínas recombinantes. [0004) No entanto, por várias razões, não é absolutamente fácil projetar sequências de líder de elevada eficiência, mesmo para uma pessoa especializada no assunto.

Em primeiro lugar, a grande variabilidade na sequência, observável entre regiões de líder de diferentes genes pertencentes ao mesmo genoma ou a genomas relacionados, tem que ser considerada. Essa variabilidade torna muito difícil identificar tratos potenciais capazes de conferir uma característica aperfeiçoada no líder, e praticamente impossível de predizer interações possíveis com outros elementos ou sequências, que constituem a região de 5'-UTR. Em segundo lugar, o comprimento global da região de líder tem que, possivelmente, estar contido dentro de 100-120 pb, de preferência 80 pb, de modo a não aumentar a frequência de dissociação espontânea do complexo 43S a partir da própria região. Isso impõe uma escolha estrita dos componentes que serão realmente usados na construção do trato de líder, em detrimento de outros. Em terceiro lugar, a região de líder não deve conter sequências palindrômicas ou uma composição em nucleotídeos rica em G/C, de modo a prevenir a formação de estruturas secundárias no transcrito, que não possam ser resolvidas através da intervenção de eIF4A. Finalmente, uma porção minoritária, mas, em qualquer caso, significativa, da sequência (cerca de 10%) não pode variar livremente, mas tem que conter elementos funcionais essenciais, tais como, especificamente, o sítio de iniciador Inr e o motivo de Kozak ou motivo similar a Kozak equivalente.

[0005] O pedido WO 2008/080954 descreve a combinação de elementos CAA repetidos com elementos CT repetidos do lado de dentro de sequências de 5'-UTR úteis para aumentar a expressão de proteínas recombinantes em plantas. Além disso, ele também descreve a presença conjunta de poli(CAA) e de poli(CT) com o sítio iniciador de transcrição ( Inr) do promotor CaMV 3 5S, isto é, o vírus do mosaico da couve-flor (Guilley et al., 1982) e/ou com o octâmero ACAATTAC a partir do líder de TMV Q (Gallie e Walbot, 1992) De fato, WO 2008/080954 descreve urna sequência de líder chamada LLTCK, contendo, por exemplo, todos os elementos citados acima:

1. Sítio de Inr de gene CaMV 35S para urn capeamento de mARN eficiente;

2. Região de poli (CAA) similar ao "intensificador traducional" presente no líder de TMV Q (Gallie e Walbot, 1992);

3. Sequência rica em elementos CT, similares a alguns líderes de plantas (Bolle et al., 1996);

4. Octâmero de líder de TMV Q.

[0006] O efeito do líder LLTCK em WO 2008/080954 foi avaliado em tabaco, usando o líder do gene CaMV 35S para comparação, o qual está presente em urn grande número de vetores comerciais, por determinação dos níveis de expressão do gene de repórter uidA (que codifica a enzima ~-glicuronidase, GUS) sob o controle do promotor CaMV 35S constitutivo. O líder LLTCK determinou urn aumento de concentração da enzima GUS igual a 8-12 vezes aquele do líder de controle.

[0007] Entretanto, existe uma necessidade em se aumentar adicionalmente a eficiência do trato de 5'-UTR para a expressão de transgenes, e, portanto, de proteínas recombinantes em plantas.

[0008] Em particular, a fim de aumentar adicionalmente a eficiência do trato de 5' -UTR para a expressão de transgenes em plantas, comparada corn o estado da técnica, considerando que LLTCK é o único líder de elevada eficiência sintético, cujos efeitos sobre os processos de transcrição e de tradução de inf orrnações genéticas são conhecidos, pode ser útil considerar este líder corno urn modelo ou ponto de partida para intervenções para aperfeiçoá-los.

[0009] Conforme dito, WO 2008/080954 propicia combinar elementos CAA repetidos corn elementos CT repetidos e identifica urna série de fatores capazes de fazer a vantagem da mencionada combinação mais evidente. [ 0010 J Urna aplicação preferencial está associada corn cada fator. É dada particular importância à presença do motivo octarnéricoACAATTAC abrigado pelo líder TMV Q; de fato, de acordo corn WO 2008/080954, urn líder eficiente pode se derivar a partir da união de tratos do líder TMV Q corn urna região portando motivos CT repetidos.

[0011] Do lado de dentro do líder Q conhecido a partir de WO 2008/080954, sequências repetidas de diferentes tipos podem ser vistas: urna tal sequência é representada pelo trinucleotídeo CAA repetido 11 vezes, embora nem sempre de maneira contígua; a outra sequência é representada pelo motivo octarnérico ACAATTAC repetido 3 vezes.

[0012] Foi demonstrado experimentalmente que ambas as sequências podem causar urn grande aumento na expressão de gene, atuando em urn nível pós-transcricional.

[ 0013 J Embora o octârnero contenha urn trinucleotídeo CAA, a intensificação da expressão de gene está conectada à presença da sequência inteira, e não do CAA isoladamente.

[0014] É importante destacar que o octârnero contém urn trato rico em A/T, isto é, AATTA, que, por sua vez, inclui o triplete ATT.

[0015] Corno urna solução técnica preferencial possível, os inventores de WO 2008/080954 indicam a sequência octarnérica ACAATTAC, mesmo se esta contiver a sequência AATTA, e, portanto, urn sítio de início de tradução não canônico ATT.

[0016] Obviamente, eles acreditam que a inclusão do rnoti vo octamérico mencionado acima é mais importante, mesmo se este acarretar na introdução de urna sequência rica em A/Te, corn ela, urn códon de início de tradução putativo. Tern que ser destacado que, na sequência ID n2 1 (LLTCK) de WO 2008/080954, outras sequências ricas em A/T são observadas de maneira específica, posicionadas respectivamente:

1. imediatamente à jusante do sítio iniciador ( TATTTTTA) ;

2. do lado de dentro do trato poli(CAA) (AATA);

3. na extremidade desse trato, em urn sítio novamente envolvendo o octârnero (ATTA);

4. logo à jusante do octârnero (TATTT) Três sequências de quatro carregam o triplete ATT, corno o octârnero.

[0017] Serão dadas, agora, para comparação, o líder LLTCK de sequência conhecido, destacando as regiões ricas em A/T (sublinhadas) e os tripletes ATT (caracteres maiores); o trato ACAATTAC em negrito corresponde ao motivo octarnérico:

ACACGTATTTTTACAACAATACCAACAACAACAACAACAAACAACATTACAAT TACGTATTTCTCTCTCTAGA

[0018] Destaca-se também que essa sequência LLTCK conhecida não fornece qualquer região de poli(CAA) contígua a urna região de poli(CT).

[0019] Também nesse caso, embora eles estejam cientes da presença de sítios de início de tradução não canônicos do lado de dentro das regiões ricas em A/T, os inventores de WO 2008/080954 proporcionaram o uso das mencionadas regiões na construção de urn líder eficiente corno LLTCK.

[0020] De fato, as sequências ricas em A/T, especificamente do tipo 1 e 4, conforme descrito acima, são encontradas não somente no líder TMV Q, mas, também, no núcleo do líder AMV cornurnente usado corno urn intensificador de tradução, corno urna alternativa a Q. [ O 021 J Depois disso, para comparação, foram dadas as sequências do líder TMV Q (a) e do líder AMV (b), destacadas, as regiões ricas em A/T (sublinhadas) e os tripletes ATT (caracteres maiores) {a)

ACCTCGAGTATTTTTACAACAA TTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATT ACAATTACTATTTACAA TTACACC

(b)

ACCTCGAGTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCATCCC

[0022] Corn respeito ao significado real dos tripletes ATT na indução do início do processo de tradução em urn ponto indesejado do rnARN dentro do líder, tern que ser observado que o códon de início de tradução autêntico (ATG) necessita de urna sequência de contexto adequada para ser reconhecida corno tal pelo complexo de tradução; é muito provável, para urn técnico especializado no assunto, que urn contexto adequado tenha que existir igualmente para o reconhecimento de tripletes de início de tradução não canônicos, tais corno ATT e CTG.

[0023] No entanto, os contextos de reconhecimento dos tripletes não são conhecidos no momento, e, portanto, o técnico especializado no assunto não é capaz de estabelecer, por avaliação do estado da técnica, se e quanto urn certo triplete ATT (ou CTG) realmente representa urn sítio de início de tradução não canônico.

[0024] Confrontado por essa evidência, na determinação da escolha de se usar Q, AMV ou líderes que sejam derivados deles, é o efeito positivo, provado experimentalmente, da inclusão do líder Q ou do líder AMV sobre o nível de expressão de gene que é importante.

[0025] O técnico especializado sabe, contudo, que, se urn triplete ATT ou CGT, dentro do líder, fosse realmente interpretado corno urn códon de início de tradução, urna proteína diferente seria produzida, não aquela programada, e isto poderia causar problemas de bioequivalência funcional e estrutural, particularmente críticos no caso de proteínas, para as quais seJa pretendida uma aplicação terapêutica.

[0026] Os inventores de WO 2008/080954, trabalhando principalmente no campo farmacêutico, estão cientes dos potenciais riscos, e, de maneira prudente, constroem sua sequência de 5'-UTR pela colocação de todos os tripletes ATT em uma distância recíproca, que seja sempre um múltiplo de 3, e um códon de parada (TAG) no quadro com respeito a eles, em direção à extremidade da sequência de líder. Ainda mais engenhosamente, a extremidade da sequência LLTCK é representada pelo sítio de restrição para Xba I (TCTAGA), que apresenta a função tripla de portar o códon de parada (TAG), de contribuir para a formação de uma região poli (CT), de fazer um contexto possível favorável ao reconhecimento de um códon de início autêntico localizado imediatamente à jusante, assim como de constituir um sítio de clonagem extremamente útil em 5' da sequência de codificação desejada. [ 0027 J Outras pessoas especializadas se comportam de maneira diferente e simplesmente deixam os tripletes ATT do lado de dentro das sequências ricas em A/T. [ O 02 8 J De fato, é comum encontrar 1 íderes sintéticos com uma sequência programada portando tripletes ATT, mesmo em uma posição divergente do quadro de leitura autêntico.

[0029] A partir do acima exposto, pode-se concluir que, como outras patentes e publicações precedentes a esta descrição, WO 2008/080954:

1. Não ensina a remover motivos ricos em A/T de sequências de 5'-UTR, mas, ao invés, ensinam exatamente o oposto;

2. Não ensina a remover tripletes ATT de sequências de 5' -UTR derivadas de ômega ou derivadas de AMV, mas, ao invés, ensinam exatamente o oposto;

3. Não ensina como fazer contextos favoráveis à expressão de gene na ausência de motivos ricos em A/T, se ou não eles portarem tripletes ATT;

4. Não ensina como construir variantes mais eficientes em relação ao líder LLTCK usado nos exemplos de WO 2008/080954.

[0030] Tudo isso considerado, a necessidade de remover sequências ricas em A/T e tripletes ATT não é, de maneira alguma sugerida ou promovida, seja explicitamente, seja implicitamente, pelo estado da técnica, e, portanto, não é algo óbvio para um técnico especializado no assunto.

[0031] Além disso, uma vez que cada substituição, eliminação ou adição de nucleotídeo é potencialmente capaz de gerar líderes com um comportamento inesperado, também o efeito de uma tal remoção, como quaisquer outras manipulações da sequência de 5'-UTR, é algo não óbvio para um técnico especializado no assunto.

[0032] Portanto, a presente invenção propõe, de uma maneira nova e inventiva, a síntese de variantes de 5'- UTR dotadas com novos elementos ou novas combinações de elementos, que constituam uma solução técnica vantajosa, capaz de modificar e de aperfeiçoar, de maneira significativa, o estado da técnica. A requerente vislumbrou, testou e concretizou a presente invenção para obter essas e outras finalidades e vantagens.

[0033] A menos se definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui e nas partes que se seguem apresentam o mesmo significado como comumente entendido por um técnico com experiência comum no campo da técnica, ao qual a presente invenção pertence. Mesmo se métodos e materiais, similares ou equivalentes àqueles descritos aqui, puderem ser usados na prática e nos ensaios da presente invenção, os métodos e materiais serão descri tos nas partes que se seguem como um exemplo. No caso de conflito, o presente pedido prevalecerá, incluindo suas definições. Os materiais, métodos e exemplos têm uma finalidade puramente ilustrativa e não devem ser entendidos de maneira restritiva.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0034] A presente invenção é mostrada e caracterizada nas reivindicações independentes, enquanto que as reivindicações dependentes descrevem outras características da invenção ou variantes em relação à ideia inventiva principal.

[0035] De acordo com a finalidade acima, a presente descrição se refere ao campo da biotecnologia vegetal e, em particular, lida com a elevação do nível produtivo de proteínas recombinantes em plantas geneticamente modificadas por aplicação de líderes artificiais adequadamente construídos de acordo com a presente descrição, obtidos através de síntese artificial e do produto do intelecto, uma vez que eles não são encontrados na natureza.

[0036] Algumas formas de modalidade aqui descrita se referem a um ADN artificial de uma região de líder de 5'-UTR para a expressão de transgenes em plantas. O ADN artificial, de acordo com características da presente descrição, é efetivo no aumento da expressão de transgenes em plantas e compreende, ao longo da direção 5' _. 3', um sítio iniciador Inr e uma sequência de consenso de Kozak ou similar a Kozak, respectivamente nos terminais 5' - e 3'- correspondentes. O ADN artificial, de acordo com características da presente descrição, também compreende, entre o sítio iniciador Inr e a sequência de consenso de Kozak ou similar a Kozak, uma pluralidade de regiões de poli(CAA) ou (CAA) n, cada uma formada por um .oligonucleotídeo que consiste em duas ou mais cópias de um elemento CAA contíguas umas às outras, e uma pluralidade de regiões de poli(CT) ou (CT)m no mesmo número que as regiões de poli(CAA) e cada uma formada por um oligonucleotídeo que consiste em duas ou mais cópias de um elemento CT contíguas umas às outras, sendo que pelo menos uma, opcionalmente cada uma, região de poli(CAA), na direção 5' _. 3', está à montante de uma região de poli(CT), isto é, em posição 5', e pelo menos uma região de poli(CAA), na direção 5' _. 3', é contígua à uma região de poli(CT).

[0037] Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial proporciona a presença de sequências que não podem estar associadas com motivos ricos em A/T, isto é, ela fornece uma ausência de motivos ricos em A/T.

[0038] Em algumas formas de modalidade, motivos ricos em A/T, não presentes no ADN artificial de acordo com a presente descrição, podem ser definidos como tratos ou sequências consistindo em mais do que 3, opcionalmente mais do que 4, nucleotídeos adenina (A) e/ou timina (T), em qualquer combinação uns com os outros.

[0039] Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial proporciona a presença de sequências que não podem estar associadas com elementos de trinucleotídeo ATT, isto é, ela proporciona a ausência de elementos de trinucleotídeo ATT.

[0040] Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial proporciona a presença de sequências que não podem estar associadas com elementos de trinucleotídeo CTG, isto.é, ela proporciona a ausência de elementos de trinucleotídeo CTG. [ 0041 J Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial proporciona uma ausência de tratos homopoliméricos, isto é, sequências consistindo em mais do que 3, opcionalmente mais do que 4, nucleotídeos idênticos.

[0042] Em algumas formas de modalidade, o valor den pode ser escolhido o mesmo para as regiões de poli(CAA) ou pode ser escolhido autonomamente para as várias regiões de poli (CAA), isto é, um valor de n diferente pode ser selecionado para pelo menos uma das regiões de poli(CAA) com respeito a uma ou mais outras regiões de poli(CAA)

[0043] Em algumas formas de modalidade, né um número inteiro maior do que ou igual a 2, opcionalmente compreendido entre 3 e 9, opcionalmente entre 4 e 8, opcionalmente entre 5 e 7. [0044) Em algumas formas de modalidade, para pelo menos uma região de poli (CAA), n é igual a 7, por exemplo, para pelo menos duas regiões de poli(CAA), né igual a 7. [ 0045 J Em algumas formas de modalidade, o valor de m pode ser escolhido o mesmo para as regiões de poli(CT) ou pode ser escolhido autonomamente para as várias regiões de poli (CT), isto é, um valor de m diferente pode ser selecionado para pelo menos uma das regiões de poli (CT) com respeito a uma ou mais outras regiões de poli(CT) [0046) Em algumas formas de modalidade, m pode ser um número inteiro maior do que ou igual a 2, opcionalmente compreendido entre 3 e 5. De acordo com alguns aspectos, para pelo menos uma região de poli(CT), m é igual a 5. De acordo com outros aspectos, para pelo menos uma região de poli(CT), m é igual a 3. Em possíveis implementações, para uma região de poli(CT), m é igual a 5, e, para outra região de poli(CT), me é igual a 3. [ 004 7 J Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial contém duas regiões de poli(CAA) e duas regiões de poli(CT), das quais uma região de poli(CAA) pode ser contígua a uma região de poli(CT) e, possivelmente, outra região de poli (CAA) pode não ser contígua a outra região de poli(CT). [0048) Em algumas formas de modalidade, uma primeira região de poli(CAA) está à montante, isto é, na posição 5', de uma primeira região de poli (CT) , e uma segunda região de poli(CAA) está à jusante da primeira região de poli (CT) e à montante, isto é, na posição 5', de urna segunda região de poli(CT).

[0049] Em algumas formas de modalidade, a primeira região de poli(CAA) é contígua à primeira região de poli (CT) .

[0050] Em outras formas de modalidade, a primeira região de poli(CAA) não é contígua à primeira região de poli (CT) .

[0051] Em algumas formas de modalidade, a segunda região de poli (CAA) é contígua à primeira região de poli (CT) .

[0052] Em outras formas de modalidade, a segunda região de poli(CAA) não é contígua à primeira região de poli (CT) .

[0053] Em algumas formas de modalidade, a segunda região de poli(CAA) é contígua à segunda região de poli(CT).

[0054] Em outras formas de modalidade, a segunda região de poli(CAA) não é contígua à segunda região de poli(CT).

[0055] Em algumas formas de modalidade, para a primeira região de poli(CAA), o valor den é igual a 7, isto é, ela compreende 7 cópias do triplete CAA.

[0056] Em algumas formas de modalidade, para a segunda região de poli(CAA), o valor den é igual a 7, isto é, ela compreende 7 cópias do triplete CAA.

[0057] Em algumas formas de modalidade, para a primeira região de poli(CT), o valor de rn é igual a 5, isto é, ela compreende 5 cópias do dinucleotídeo CT.

[0058] Em algumas formas de modalidade, para a segunda região de poli(CT), o valor de m é igual a 3, isto é, ela compreende 3 cópias do dinucleotídeo CT.

[0059] Em algumas formas de modalidade, entre a segunda região de poli(CAA) e a segunda região de poli(CT), existe uma sequência AG. Em algumas formas de modalidade, entre a segunda região de poli ( CAA) e a segunda região de poli (CT), existe exclusivamente uma sequência AG.

[0060] Em algumas formas de modalidade, o sítio iniciador Inr é o sítio de iniciação de transcrição CaMV 35S ou é um sítio iniciador Inr com uma sequência de consenso 5'-YYANWYY-3', na qual: Y = C, T; N = A, C, G, T; W = A, T.

[0061] Em formas exemplares de modalidades possíveis, o sítio iniciador Inr é 5'-TCACATC-3'.

[0062] Em algumas formas de modalidade, entre o sítio iniciador Inr e a primeira região de poli(CAA), ao longo da direção 5' __, 3', existe uma sequência AAGTTTC. Em algumas formas de modalidade, entre o sítio iniciador Inr e a primeira região de poli(CAA), ao longo da direção 5' __, 3', existe exclusivamente uma sequência AAGTTTC.

[0063] Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial apresenta um comprimento compreendido entre 40 e 150 pb.

[0064] Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial apresenta um teor em GC de menos do que 50%.

[0065] Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, ou a sequência mostrada em SEQ ID NO: 2, ambas incluídas na listagem se sequências anexa.

[0066] Em algumas formas de modalidade, a sequência de consenso de Kozak ou similar a Kozak é uma sequência que exige a presença de um elemento R, que é uma purina na posição -3, isto é, localizada na terceira posição à montante do códon de início de tradução.

[0067] Em algumas formas de modalidade, o ADN artificial de acordo com a presente invenção não contém o octâmero ACAATTAC.

[0068] Algumas formas de modalidade descritas aqui se referem a um vetor de expressão compreendendo ADN artificial de uma região de líder de 5'-UTR efetiva no aumento da expressão de proteínas recombinantes em plantas, em particular, por exemplo, proteínas humanas, de acordo com formas de modalidade aqui descritas.

[0069] Em algumas formas de modalidade, o vetor de expressão compreende: i) um promotor específico para endosperma, de origem natural ou artificial, à montante, isto é, na posição 5', de uma sequência de nucleotídeos, de origem natural ou artificial, que codifica a forma madura de uma proteína; ii) o ADN artificial da região de líder de 5 '-UTR efetiva no aumento da expressão de proteínas recombinantes em plantas conforme aqui descrito;

iii) uma sequência de nucleotídeos, de origem natural ou artificial, que codifica um peptídeo de sinal tendo por alvo a proteína recombinante do lado de dentro do lúmen do retículo endoplasmático das células, que constituem o tecido do endosperma e, portanto, para favorecer sua acumulação nos tecidos; iv) a sequência de nucleotídeos, de origem natural ou artificial, que codifica a forma madura da proteína de interesse; v) uma região de 3'-UTR de origem natural ou artificial.

[0070] Em algumas formas de modalidade, o promotor i) é o promotor do gene para glutelina a4 de arroz (GluB4).

[0071] Em algumas formas de modalidade, a sequência de nucleotídeos do elemento iii) é a sequência PSGluB4, que codifica o peptídeo de sinal usado em arroz para transportar o precursor de glutelina 4 do lado de dentro do retículo endoplasmático.

[0072] Em algumas formas de modalidade, a sequência de nucleotídeos do elemento iv) é a sequência que codifica a forma humana madura da enzima beta-glicosidase de ácido. [ 0073] Em algumas formas de modalidade, a região de 3'-UTR do elemento v) é o terminador NOS ou o terminador do gene GluB4.

[0074] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem a uma cepa bacteriana, portando um plasmídeo contendo uma sequência de ADN artificial conforme aqui descrito, em particular, por exemplo, escolhida a partir de um grupo compreendendo as espécies Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.

[0075] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem a uma cepa bacteriana engenheirada, contendo uma sequência de ADN artificial de acordo com formas de modalidade conforme aqui descritas, independentemente do tipo de organismo hospedeiro.

[0076] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem a células vegetais transformadas com vetores de expressão, contendo a sequência de ADN artificial conforme aqui descri to, sob o controle de um promotor escolhido a partir de um grupo compreendendo um promotor constitutivo, um promotor específico quanto ao tecido e, em particular, por exemplo, específico quanto à semente, um promotor induzível, um promotor com atividade transcricional dependente de fase, um promotor ativo em cloroplasto e um promotor ativo em mitocôndria.

[0077] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem a plantas caracterizadas pela expressão transitória de qualquer proteína que seja, cujo ARN mensageiro contém a sequência de ADN artificial aqui descrita; por expressão transitória entenda-se a produção da mencionada proteína por vetores virais, agro infiltração, bombardeamento com micropartículas, eletroporação.

[0078] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem a plantas dicotiledôneas transformadas, de maneira estável, com vetores de expressão, contendo a sequência de ADN artificial de acordo com formas de modalidade conforme aqui descritas.

[0079] Em algumas formas de modalidade, as plantas dicotiledóneas compreendem uma ou mais espécies pertencentes às famílias Solanaceae, Papilonaceae e/ou Cruciferae.

[0080] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem à progenia das plantas dicotiledóneas conforme acima.

[0081] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem a plantas monocotiledóneas transformadas com vetores de expressão, contendo a sequência de ADN artificial de acordo com formas de modalidade aqui descritas.

[0082] Em algumas formas de modalidade, as plantas monocotiledóneas compreendem uma ou mais espécies pertencentes à família Graminaceae (Poaceae), tais como, por exemplo, os cultivos de arroz (Oryza sativa L.), milho (Zea mays L.), cevada (Hordeum vulgare L.) e/ou trigo (Triticum spp.).

[0083] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem à progenia das plantas monocotiledóneas conforme acima.

[0084] Algumas formas de modalidade se referem à sequência de ADN artificial de acordo com formas de modalidade aqui descritas, para uma aplicação escolhida a partir de um grupo compreendendo: - aplicação para produção biotecnológica de moléculas; - aplicação para a síntese de proteínas recombinantes, em particular, por exemplo, pretendidas para induzir resistência a patógenos virais, bacterianos ou fúngicos, ou pretendidas para induzir resistência a herbicidas ou para obtenção de uma composição alterada em ácidos graxos na matéria-prima e nos produtos dela derivados, ou para obtenção de um valor nutricional alterado da matéria-prima e dos produtos dela derivados, ou para a produção de combustíveis, borrachas e/ou bioplásticos; - aplicação para a síntese de enzimas industriais e proteínas comerciais; - aplicação para a síntese de proteínas farmacêuticas; aplicação para a síntese de vacinas escolhidas a partir de urn grupo compreendendo: vacinas administradas oralmente pretendidas para seres humanos ou animais, vacinas injetáveis pretendidas para seres humanos ou animais, vacinas injetáveis específicas quanto ao paciente, de preferência, específicas quanto ao idiotipo, a serem usadas no tratamento de tumores do sistema linfático; - aplicação para a síntese de proteínas envolvidas na produção de rnetabólitos secundários; aplicação para a síntese de proteínas úteis, diretamente ou indiretamente, corno fatores na identificação e/ou seleção de células transformadas.

[0085] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem à semente de uma planta transformada para a expressão de uma proteína humana, em particular, por exemplo, uma enzima lisossornial humana, contendo urn vetor de expressão de acordo corn formas de modalidade aqui descritas.

[0086] Algumas formas de modalidade aqui descritas se referem a urna semente conforme acima, para aplicação em tratamento terapêutico, em particular, por exemplo, para aplicação em terapia de reposição de enzima, ainda mais em particular, por exemplo, nas seguintes doenças: Doença de Gaucher, glicogenose do tipo II ou Doença de Pornpe, Doença de Fabry, Doença de Niemann-Pick do tipo B, rnucopolissacaridose I, II, IV.

[0087] Algumas formas de modalidade se referem a urn método para a produção de proteínas recombinantes em plantas, compreendendo a transformação das plantas usando urn vetor de expressão conforme aqui descrito.

[0088] Em algumas formas de modalidade, a transformação das plantas é efetiva em se conseguir o confinamento da proteína em urn endosperrna não absorvido pelo embrião e para permitir que a presença de elevadas quantidades da proteína no endosperrna das sementes não cause efeitos negativos sobre a viabilidade da semente e a velocidade de germinação.

[0089] Em algumas formas de modalidade, o método proporciona acumular a proteína no lado de dentro do endosperrna da semente de planta, em particular, por exemplo, a proteína é acumulada no endosperrna no lado de dentro dos vacúolos de armazenamento de proteína ( PSV) ou dos corpos de proteína (PB).

[0090] Em algumas formas de modalidade, o vetor de expressão é introduzido em cepas bacterianas, que são usadas, diretamente ou indiretamente, para transformação de plantas, sendo que a cepa bacteriana pode ser escolhida a partir de urn grupo compreendendo as espécies

Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes.

[0091] Em algumas formas de modalidade, as plantas transformadas são cereais.

[0092] Em algumas formas de modalidade, a cepa bacteriana é usada para a transformação de calos de arroz embriogênicos (Oryza sativa ssp. japonica)

[0093] Em algumas formas de modalidade, a proteína recombinante é uma enzima lisossomial, em particular, por exemplo, beta-glicosidase de ácido humana, ou, por exemplo, alfa-glicosidase de ácido humana.

[0094] Em algumas formas de modalidade, o método compreende o processamento industrial da semente de planta.

[0095] Em algumas formas de modalidade, o processamento industrial da semente de planta proporciona descascar e polir as sementes maduras coletadas a partir de plantas de cereal transformadas, a fim de remover o componente fibroso, o germe e a camada aleurônica contendo contaminantes de proteína.

[0096] Em algumas formas de modalidade, o método compreende a purificação da proteína obtida.

[0097] Em algumas formas de modalidade, a purificação proporciona, em ordem, uma cromatografia com interações hidrofóbicas, uma cromatografia com troca iônica e uma filtração em gel.

[0098] Em algumas formas de modalidade, a purificação proporciona aplicar resinas cromatográficas similares em composição química e/ou estrutura e/ou função, para modificar parcialmente os parâmetros de eluição, e para duplicar uma passagem para recarregar a fração eluída na coluna.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0099] Essas e outras características da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição de algumas formas de modalidade, dada como um exemplo não restritivo com referência aos desenhos anexos, nos quais:

[00100] A Figura 1 mostra a distribuição dos valores obtidos usando um ensaio de 4-MUG em plantas de tabaco transformadas com pSTART e pSTART-STE;

[00101] A Figura 2 mostra a distribuição do teor em proteína GCasi, avaliado usando um ensaio DAS-ELISA e expresso em µg de GCasi por grama de farinha de arroz, em plantas portando o líder LLTCK e o líder de STE;

[00102] A Figura 3A mostra o diagrama do vetor de expressão em pSTART-STE de tabaco, em que: RBR: repetição de fronteira direita LBR: repetição de fronteira esquerda 35S CaMV: promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor GUS: proteína de repórter NOS ter: terminador da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens

[00103] A Figura 3B mostra o trato sintetizado artificialmente contendo uma parte do promotor CaMV 35S (a partir do sítio de Sea I) e o líder de STE;

[00104] A Figura 4A mostra o diagrama dos vetores de expressão em pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK/STE: :GCasi:: GluB4 ter de arroz; em que:

RBR: repetição de fronteira direita LBR: repetição de fronteira esquerda GluB4-LLTCK: promotor de glutelina 4 de arroz com líder de LLTCK GluB4-STE: promotor de glutelina 4 de arroz com líder de STE GCasi: gene que codifica a enzima humana beta- glicosidase de ácido (hGCasi) GluB4 ter: terminador de glutelina 4 de arroz 35S pro: promotor de CaMV 35S PMI: gene que codifica a fosfomanose isomerase (marcador de seleção das plantas transformadas) 35S ter: terminador de CaMV 35S

[00105] As Figuras 4B e 4C representam, respectivamente, o trato sintetizado artificialmente contendo a parte final do promotor de GluB4 (a partir do sítio de Bfr I) e os líderes de LLTCK e de STE.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE ALGUMAS FORMAS DE MODALIDADE

[00106] Referir-se-á, em detalhes, a várias formas de modalidade da presente invenção, das quais um ou mais exemplos são descri tos nas partes que se seguem. Cada exemplo é fornecido por meio de ilustração da invenção e não será entendido como uma limitação da mesma. Por exemplo, as características mostradas ou descritas de maneira que elas sejam parte de uma forma de modalidade podem ser adotadas em, ou em associação com, outras formas de modalidade, para produzir outra forma de modalidade. É entendido que a presente invenção incluirá todas tais modificações e variantes.

[00107] Na tentativa de aumentar adicionalmente a eficiência do trato de 5'-UTR para a expressão de transgenes em plantas, comparada com o estado da técnica, uma sequência de ADN artificial foi vislumbrada, nas partes que se seguem chamada de STE, sequência de STE ou líder de STE, contendo elementos de trinucleotídeo CAA repetidos e elementos de dinucleotídeo CT repetidos, conforme descrito por WO 2008/080954, cuja sequência de STE está otimizada para a superexpressão de proteínas recombinantes em plantas.

[00108] Deve ser observado que essa sequência de STE nova e inventiva deu um aumento na expressão de gene em duas espécies de plantas não relacionadas e em associação com diferentes promotores, terminadores e sequências de codificação.

[00109] Partindo do estado da técnica conforme discutido acima, a requerente realizou outros experimentos que pretenderam desenvolver um novo tipo de líder, de acordo com a presente descrição.

[00110] Em particular, a requerente considerou que muitos vírus que atacam plantas produzem mensageiros sem 5'-cap e, em muitos casos, também sem a cauda de poli(A) Essa evidência permitiu que a requerente supusesse que, nesses vírus, as regiões não traduzidas em 5' ( 5' -UTR) e 3' ( 3 '-UTR) abrigam sequências capazes de substituir funcionalmente a estrutura de 5' -cap e a cauda de poli(A), respectivamente. Essas sequências, indispensáveis no mensageiro viral, poderiam, no entanto, ser menos importantes do lado de dentro de líderes de genes eucarióticos, e, especificamente, genes de plantas, porque os mensageiros que elas produzem sempre apresentam a 5' -cap e, exceto para raras exceções, também a cauda de poli(A)

[00111] Em particular, a requerente formulou a hipótese de que as sequências essenciais aos líderes virais, mas não aos líderes de genes eucarióticos, correspondem a uma ou mais sequências ricas em A/T, tais como, por exemplo, aquelas previamente indicadas pelos números 1-4 do lado de dentro de LLTCK ou porções do mesmo. Portanto, uma atividade de projeto foi iniciada com a intenção de obtenção de uma sequência de líder sintética, totalmente desprovida de sequências ricas em A/T e, portanto, sem regiões octaméricas de Q e tripletes ATT; na formação do novo líder, também foi decidido excluir tratos de trinucleotídeo CTG e de homopolímero formados pela repetição de qualquer nucleotídeo que seja. Para manter o comprimento do líder substancialmente inalterado com respeito a WO 2008/080954, as regiões ricas em A/T foram substituídas por motivos de CAA e de CT repetidos. A sequência resultante, chamada de STE, foi comparada com a seq. ID no. 1 de WO 2008/080954, em diferentes contextos.

[00112] Os resultados obtidos permitiram estabelecer que, de acordo com a hipótese da requerente, mas de maneira diferente daquilo que era esperado com base no estado da técnica disponível para o técnico especializado no assunto, eliminando-se os elementos ricos em A/Te substituindo-os por elementos de CAA e de CT repetidos, sempre causa um aumento significativo na expressão dos genes de repórter usados nos experimentos comparativos entre líderes, mesmo se os elementos ricos em A/T forem preservados do lado de dentro de líderes virais comurnente usados como intensificadores de tradução. Comparado com LLTCK em WO 2008/080954, o novo tipo de 5' -UTR, de acordo com a presente descrição, representa uma melhor solução técnica útil para solucionar, no campo industrial, os problemas ligados à produção, extração e purificação eficientes de proteínas heterólogas.

[00113] Portanto, formas de modalidade aqui descritas fornecem ADN artificial de uma região de líder de 5'-UTR efetiva no aumento da expressão de proteínas recombinarttes em plantas, compreendendo, ao longo da direção 5' - 3', urna pluralidade de regiões de poli(CAA) ou (CAA)n, e uma pluralidade de regiões de poli(CT) ou (CT)m no mesmo número que as regiões de poli(CAA).

[00114] Em algumas formas de modalidade, cada região de poli(CAA) é formada por um oligonucleotídeo que consiste em duas ou mais cópias de um elemento CAA contíguas umas às outras.

[00115] Em algumas formas de modalidade, cada região de poli(CT) é formada por um oligonucleotídeo que consiste em duas ou mais cópias de urn elemento CT contíguas umas às outras.

[00116] Em algumas formas de modalidade, pelo menos uma, opcionalmente cada urna, região de poli (CAA), na direção 5' - 3', está à montante de urna região de poli(CT), isto é, na posição 5'.

[00117] Em algumas formas de modalidade, pelo menos uma região de poli (CAA), na direção 5' ----, 3', é contígua a uma região de poli(CT).

[00118] Em algumas formas de modalidade, né um número inteiro, que pode ser selecionado. igual ou diferente dentre as regiões de poli(CAA), maior do que ou igual a 2, opcionalmente compreendido entre 3 e 9, opcionalmente entre 4 e 8, opcionalmente entre 5 e 7. Por exemplo, o valor den pode ser o mesmo para as regiões de poli(CAA) e pode ser, por exemplo, igual a 7.

[00119] Em algumas formas de modalidade, m é um número inteiro, que pode ser selecionado igual ou diferente dentre as regiões de poli(CT), maior do que ou igual a 2, opcionalmente compreendido entre 3 e 5. Por exemplo, o valor de m pode ser diferente para as regiões de poli(CT) e pode ser, por exemplo, igual a 3 ou 5.

[00120] Embora, em geral, os valores den e de m possam ser selecionados diferentes uns dos outros, algumas formas de modalidade também podem ser fornecidas, nas quais os valores de n e de m são selecionados iguais entre si.

[00121] Em possíveis implementações, podem ser fornecidas duas regiões de poli (CAA) e duas regiões de poli(CT). Ao longo da direção 5' - 3', pode ser fornecida uma primeira região de poli(CAA), uma primeira região de poli(CT) subsequente, contígua à primeira região de poli (CAA) precedente, uma segunda região de poli(CAA) sucessiva, contígua à primeira região de poli (CT) precedente e uma segunda região de poli (CT) sucessiva, não contígua à segunda região do poli(CAA).

[00122] Em algumas formas de modalidade, a sequência de STE pode ser caracterizada por aspectos que são um aperfeiçoamento, comparada ao WO 2008/080954, e a que se referem uma ou mais das seguintes características, que se pretende tornem a sequência de STE mais compatível com um sistema de expressão eucariótico:

1. Ausência de motivos ricos em A/T, isto é, sequências consistindo em mais do que 3, opcionalmente mais do que 4, nucleotídeos adenina (A) e/ou timina (T), em qualquer combinação dos mesmos;

2. Ausência de elementos de trinucleotídeo ATT;

3. Ausência de elementos de trinucleotídeo CTG;

4. Ausência de tratos homopoliméricos, isto é, sequências consistindo em mais do que 3, opcionalmente mais do que 4, nucleotídeos idênticos.

[00123] Em outras palavras, o ADN artificial, de acordo com a presente descrição, não contém qualquer um dos seguintes componentes: elementos ricos em A/T, elementos de trinucleotídeo ATT, elementos de trinucleotídeo CTG e tratos homopoliméricos, isto é, sequências consistindo em mais do que 3, opcionalmente mais do que 4, nucleotídeos idênticos.

[00124] Em algumas formas de modalidade, uma sequência de ADN artificial aqui descrita pode conter um sítio de Inr. O sítio de Inr pode apresentar uma sequência 5 ' - YYANWYY-3', com as limitações conforme acima nos pontos 1 (ausência de motivos ricos em A/T) e 2 (ausência de elementos de trinucleotídeo ATT), sendo que Y = C, T; N = A, C, G, T; W = A, T; alternativamente, o sítio de Inr pode apresentar urna sequência 5'-ACACG-3' (sítio de início de transcrição para 35S de CaMV).

[00125] Em algumas formas de modalidade, na extremidade 3', a região de líder também pode conter urn contexto de nucleotídeos favorável ao reconhecimento do códon de início de tradução ATG autêntico (motivo Kozak ou similar a Kozak ou sequência de consenso) Urn motivo Kozak ou similar a Kozak ou urna sequência de consenso exigem a presença de urn elemento R, que seja urna purina (adenina "A" ou guanina "G") na posição 3 à montante do códon de início de tradução, para identificar o contexto apropriado para reconhecimento do códon de início de tradução autêntico. Por posição 3 à montante do códon de início (ou posição -3), entenda-se urn nucleotídeo na posição 3 à montante do elemento "A" do códon ATG, ao qual a posição +1 é convencionalrnente designada. A sequência de Kozak ou similar a Kozak pode ser sucessiva e contígua, por exemplo, à segunda região de poli (CT) , conforme discutido acima.

[00126] Além disso, em algumas formas de modalidade, a sequência de líder de STE aqui descrita pode apresentar urn comprimento compreendido entre 40 e 150 pb e pode, opcionalmente, apresentar urn teor em GC de menos do que 50%.

[00127] Urn exemplo de urna sequência de líder, chamada de SEQ ID No: 1, de acordo corn algumas formas de modalidade, é: ( 1) 5' -ACACGAAGTITCCAACAACAACAACAACAACAACTCTCTCTCT CAACAACAACAACAACAACAAAGCTCTCTAGA-3'

[00128] Outro exemplo de urna sequência de líder, chamada de SEQ ID No: 2, de acordo corn algumas formas de modalidade, é: (2) 5'-CACATCAAGffiCCAACAACAACAACAACAACAACTCTCTCTCT CAACAACAACAACAACAACAAAGCTCTCTAGA-3'

[00129] Em algumas formas de modalidade, a sequência de líder aqui descrita, tal corno, por exemplo, SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 2, pode apresentar urn sítio iniciador Inr em 5', tal corno o sítio de início de transcrição de CaMV 35S (SEQ ID No: 1, variante 1) ou urn sítio de Inr com urna sequência de consenso típica de genes eucarióticos, 5' -YYA+1NWYY-3', em que A+1 representa o primeiro nucleotídeo transcrito, Y = C, T; N = A, C, G, T; W = A, T (TCACATC em SEQ ID No: 2, variante 2). À jusante do sítio de iniciador, blocos estendidos e alternados de poli(CAA) e de poli(CT) se seguem, repetidos, por exemplo, duas vezes. Conforme dito, além disso, a fim de promover o reconhecimento do códon de início ATG, urna sequência de Kozak ou similar a Kozak pode apresentar, no terminal 3' (por exemplo, em ambas as variantes, ela pode estar incluída em TCTAGA, correspondendo ao sítio de restrição para Xba I).

[00130] Comparada corn o tipo de líder descrito em WO 2008/080954, a sequência de ADN artificial aqui descrita pode, portanto, fornecer novas especificações para preparação de 5'-UTRs artificiais. Tais especificações, não fornecidas em WO 2008/080954, podem se refletir rnodif icações de composição e de estrutura precisas da região de líder e em novas aplicações preferenciais.

[00131) A entidade de variações pode ser inferida, por meio de exemplo, por comparação da sequência de LLTCK, descrita em WO 2008/080954, com as variantes de exemplo do líder de STE, descritas acima. As últimas não apresentam quaisquer sequências definíveis como elementos ricos em A/T ( elementos ricos em AU, AREs) , nem tripletes ATT, que, ao invés, estão presentes em LLTCK à jusante do sítio de Inr, internamente e nos lados do octâmero do líder de TMV Q. [00132) Para demonstrar a maior eficiência do novo líder de STE, foi feita uma comparação entre ele e a sequência de LLTCK descrita em WO 2008/080954, analisando-se os níveis de expressão de dois genes de repórter em espécies de plantas não relacionadas, tais como tabaco (Nicotiana tabacum L.) e arroz (Oryza sativa L.).

[00133) Em tabaco, o gene considerado foi uidA (GUS) e os construtos usados para transformação genética, isto é, 35S-LLTCK: :uidA::NOS ter (pSTART) e 35S- STE: :uidA: :NOS ter (pSTART-STE), foram obtidos por substituição da sequência de líder presente em pBI121 (Clontech) por LLTCK e STE, respectivamente (Exemplo 1). Mais precisamente, foi a sequência de pBI121 que foi substituída e manipulada, compreendida entre a região de Inr 35S de CaMV (ACACG), mantida comum para ambos os construtos, e o sítio de restrição de Xba I (TCTAGA). Os níveis de expressão do gene de repórter foram avaliados usando-se um ensaio de 4-MUG fluorométrico (Jefferson et al., 1987), caracterizado por considerável sensibilidade, precisão, velocidade e facilidade de execução.

Em particular, para avaliar quantitativamente a expressão do gene GUS em plantas transformadas, foram realizados ensaios fluorométricos em extratos de proteína brutos derivados de prensagem de três folhas jovens completamente distendidas.

Os valores de atividade específica para e-glicuronidase (GUS), expressos em milimoles de 4-MU produzido por mg de proteína, foram normalizados em relação à concentração de proteína total calculada usando-se um ensaio de Bradford.

A Figura 1 mostra os dados obtidos nas plantas transformadas com os dois construtos (média dos valores registrados para os extratos de três folhas) em ordem decrescente. [00134) Uma análise estatística foi realizada sobre os dados mostrados na Figura 1, neste caso, uma análise unimodal da variância (ANOVA), os resultados da qual são mostrados na seguinte Tabela 1.

Tabela 1: ANOVA realizada sobre os dados médios obtidos em plantas transformadas com os construtos 35S- LLTCK:::uidA::NOS ter e 35S-STE::uidA::NOS ter.

RESUMO Grupos Cont. Soma Média Variância pSTART 20 3,985 0,199 0,151 STE 23 12,973 0,564 0,514

ANÁLISE DE VARIÂNCIA Origem de SQ gdl MQ F Valor de variância significância Entre grupos 1,424 1,424 4, 119* P < 0,05 Dentro de grupos 14, 169 41 0,346 Total 15,593 42

[00135] A análise mostrou a existência de diferenças estatisticamente significativas (P < 0,05) entre as duas populações analisadas (pSTART e pSTART-STE). A partir do exame conjunto da Tabela 1 e da Figura 1, é possível asseverar que o líder de STE provoca aumentos não marginais nos níveis de expressão de uidA. Em particular, se os valores médios obtidos forem considerados nas duas populações de plantas transformadas, o líder de STE conduzirá a um aumento nos níveis de expressão do gene de repórter GUS de cerca de 2,8 vezes, comparado a LLTCK.

[00136] Em confirmação do que foi visto em tabaco (espécie modelo para a classe de dicotiledôneas), também foram realizados experimentos em arroz, um cereal amplamente usado no campo da biotecnologia. Como com a primeira espécie, a comparação foi realizada com dois construtos de expressão, exatamente como outros elementos. Em particular, foram comparados os seguintes vetores: pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter; pCAMBIA1300/PMI/G1uB4-STE::GCasi::GluB4ter.

[00137] No entanto, deve-se destacar que, em arroz, foi avaliado o efeito de um tipo diferente de líder em um contexto de expressão específica quanto à semente, usando-se elementos de controle diferentes. Mais precisamente, foi usado o promotor de glutelina 4 de arroz (GluB4), e o terminador correspondente (GluB4ter). Foi escolhido um gene de repórter, hGCasi, isto é, a sequência que codifica a enzima humana beta-glicosidase de ácido; a detecção da proteína recombinante pode ser realizada com considerável sensibilidade e precisão através de um ensaio imunológico (DAS-ELISA). Com respeito à sequência de líder, em ambos os vetores, foi usado o sítio de Inr de GluB4, uma vez que ele vem dentro da sequência de consenso eucariótica YYANWYY. Além disso, o sítio de início de transcrição do promotor de CaMV 35S pareceu menos adequado porque este vírus ataca somente plantas dicotiledôneas.

[00138] Cada vetor foi inserido em Agrobacterium tumefaciens usando-se eletroporação para a transformação de Oryza sativa, var. CR W3 (Hiei et al., 1994). Foram obtidas duas populações de plantas transgênicas, cada uma consistindo em 50 plantas individuais. As sementes maduras de cada planta foram coletadas e usadas para extração de proteína total. Os extratos de proteína obtidos foram analisados em DAS-ELISA para avaliar o teor em GCasi. A Figura 2 mostra a distribuição dos dados obtidos.

[00139] A análise unimodal de variância permitiu estabelecer que as diferenças em expressão do gene de repórter, encontrado entre duas populações de arroz consideradas, são estatisticamente significativas (Tabela 2) .

Tabela 2: ANOVA realizada sobre os dados obtidos em plantas transformadas com os construtos pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK::GCasi::GluB4ter e pCAMBIA1300/PMI/GluB4-STE::GCasi::GluB4ter.

RESUMO Grupos Cont. Soma Média Variância Líder de STE 50 5.052,015 101,040 1.714,609 Líder de 50 1.468,772 29,375 643,617

LLTCK

ANÁLISE DE VARIÂNCIA Origem de SQ gdl MQ F Valor de variância significância Entre grupos 128.396,3296 1 128.396,330 108,892* P < 0,05 Dentro de 115.553,0807 98 1.179, 113 grupos Total 243.949,4102 99

[00140] A partir da Tabela 2 e do gráfico na Figura 2, mostrados acima, está claro que o líder de STE fornece níveis de expressão certamente maiores do que o líder de LLTCK. Em particular, o líder de STE causa um aumento nos níveis de expressão do gene GCasi de repórter cerca de 3,5 vezes daquele de LLTCK.

EXEMPLOS Exemplo 1: Produção do vetor de expressão em pSTART-STE de tabaco [ 00141] O ponto de partida para a produção do vetor pSTART-STE foi o vetor de expressão pSTART, obtido em um trabalho prévio (De Amie is et al., 2 007) . Esse último vetor, por sua vez obtido a partir de uma modificação do vetor original pBI121 (Clontech), apresenta um cassete de expressão consistindo no promotor de CaMV 35S com líder de LLTCK, o gene de repórter que codifica a proteína GUS e o terminador NOS. Para se obter pSTART- STE (Figura 3A), o líder de LLTCK, em pSTART, foi substituído pelo líder de STE. Para essa finalidade, a sequência correspondendo a uma parte do promotor 35S (a partir do sítio de Sea I) foi artificialmente sintetizada, à qual a sequência do líder de STE foi adicionada, nesse caso, na forma de exemplo SEQ ID No:

1. O trato sintetizado (702 pb, Figura 3B) foi substituído em pSTART por digestão com enzimas de restrição Sea I e Xba I, recuperado do vetor e por ligação com ADN ligase da nova sequência sintetizada.

Exemplo 2: Produção de vetores de expressão com promotor GluB4 e líderes de LLTCK e de STE

[00142] As sequências de líder de LLTCK e de STE foram artificialmente sintetizadas. Em particular, em ambos os casos, o trato sintetizado correspondeu à sequência compreendida entre o si te de Bfr I, presente na parte terminal do promotor de glutelina 4 de arroz (GluB4), e o sítio de Xba I, presente no terminal 3' dos próprios líderes (Figuras 4B e 4C). Mais precisamente, esse trato resultou igual a 328 pb para LLTCK (Figura lB) e a 315 pb para STE (Figura 4C).

[00143] A fim de produzir os vetores de expressão finais, urna série de etapas de subclonagern intermediárias foi realizada em paralelo para os dois líderes, que permitiu a montagem final dos cassetes de expressão. Na etapa inicial, o líder nati varnente presente à jusante do promotor GluB4 foi substituído pelos líderes sintéticos de LLTCK e de STE. O ponto de partida era o vetor pGEM-T/GluB4-NAT, contendo o promotor de glutelina 4 em fusão· corn o líder nativo (Conta no GenBank nº AY427571). O trato terminal do promotor GluB4 (a partir do site de Bfr I) e o líder nativo foram eliminados por digestão corn as enzimas Bfr I e Xba I e substituídos pelas novas sequências sintetizadas. Dessa maneira, dois vetores intermediários foram produzidos, pGEM-T/GluB4-LLTCK e pGEM-T/GluB4-STE, subsequentemente verificados por análise de PCR, digestão enzimática e sequenciamento.

[00144] Os cassetes de expressão finais foram montados partindo-se do vetor pUC18/GluB4ter. Esse vetor foi submetido a duas etapas de subclonagern sucessivas para inserção do complexo GluB4-LLTCK (ou GluB4-STE) e o gene de repórter, respectivamente. Em particular, na primeira subclonagern, pUC18/GluB4ter foi digerido corn as enzimas de restrição Sph I e Xba I, a fim de ligar os tratos GluB4-LLTCK e GluB4-STE, extraídos dos vetores pGEM- T/GluB4-LLTCK e pGEM-T/GluB4-STE, respectivamente. Na segunda subclonagem, os vetores intermediários pUC18/GluB4-LLTCK: :GluB4ter e pUC18/GluB4-STE: :GLUB4ter foram abertos por digestão com Xba I e Sac I, a fim de neles inserir o gene de repórter (hGCasi), por sua vez extraído a partir do vetor pMS/hGCasi usando-se as mesmas enzimas. Dessa maneira, os dois vetores pUC18 foram obtidos, contendo os cassetes de expressão inteiramente montados, isto é, pUC18/GluB4- LLTCK: :GCasi: :GluB4ter e pUC18/GluB4-STE: :GCasi: :GluB4 ter.

[00145] A fim de produzir os vetores finais, os dois cassetes de expressão GluB4-LLTCK: :GCasi: :GluB4ter e GluB4-STE: :GCasi: :GluB4ter foram extraídos individualmente, por exemplo, por uma dupla digestão com Eco RI, a partir do pUC18 respectivo, e clonados no vetor de expressão final pCAMBIA1300/PMI, de modo a constituir (Figura 4A): pCAMBIA1300/PMI/GluB4-LLTCK: :GCasi: :GluB4ter e pCAMBIA1300/PMI/GluB4-STE: :GCasi: :GluB4ter.

Exemplo 3: Transformação genética de Nicotiana tabacwn mediada por Agrobacteriwn twnefaciens

[00146] Para a transformação genética de tabaco (Nicotiana tabacum, cv. Xanthi) mediada por A.

tumefaciens, foi usado o protocolo de Horsch et al. (1985). Serão agora descritas, de maneira breve, as etapas principais do procedimento inteiro.

Desinfecção das sementes

[00147] Para a preparação de sementes de tabaco, a serem usadas na transformação, foi primeiramente realizada urna desinfecção de acordo corn o seguinte protocolo:

[00148] Colocar urna pequena quantidade de sementes em urn tubo de ensaio de 2 rnL estéril. Adicionar cerca de 1 rnL de etanol à 95%. Manter durante 2 minutos e agitar vigorosamente. Eliminar o etanol, usando urna pipeta. Adicional 1 rnL de cloridrato à 2 9.co. Deixar incubar durante 20 minutos, agitar, eliminar e adicionar 1 rnL de água estéril; enxaguar as sementes dessa maneira 5 vezes. Deixar a água a partir do último enxágue no tubo de ensaio. Remover urna certa quantidade de sementes e água, usando urna haste, a partir da qual a ponta tenha sido removida sob condições estéreis, e colocá-la em urn substrato MS10 em urna placa ou pequeno jarro.

[00149] Usando-se urna alça bacteriológica ou urna pipeta de Pasteur dobrada em urn formato de "L", distribuir as sementes delicadamente.

[00150] Colocar as placas para germinar na luz do lado de dentro de urna câmara climática à 282C.

Transformação com A. twnefaciens

[00151] A transformação de material de folha de N.

tabacum usando A. tumefaciens foi feita nas seguintes etapas: • sob urna capela, encher 4-5 tubos de ensaio de 2 rnL corn 1,8 rnL de caldo LB estéril. Inocular o A. turnefaciens, coletando, corn urn palito de dentes estéril,

uma pequena, porém visível, quantidade de colônia bacteriana cultivada sobre a placa, e diluí-la em um tubo de ensaio; agitar vigorosamente;

• tomar uma folha de tabaco (a partir de plantas com cerca· de 1 mês de idade) e, usando uma punção estéril, fazer discos com um diâmetro de 7 mm a partir da lâmina de folha; usando uma pinça, colocar os discos de folha em uma placa de substrato MSlO; colocar 30 discos por placa.

Para cada cepa bacteriana, obter um total de pelo menos 200 discos.

Preparar duas placas de controle, nas quais colocar discos que não serão infectados e que sempre permanecerão no meio de MSlO;

• infectar os discos com A. tumefaciens; verter o teor de um tubo de ensaio, inoculado logo antes com a bactéria, por sobre a placa contendo os discos.

Agitar suavemente com um movimento rotacional, de modo umedecer todos os discos, então, remover o excesso de líquido com uma pipeta.

Dispor os discos regularmente, usando as pinças; • incubar as placas durante uma noite em luz constante, em uma temperatura de 28ºC, em uma câmara de cultivo; • transferir os discos de folha por sobre um substrato com 500 mg/L de MSlO Cefotaxima;

• incubar as placas durante 6 dias em luz constante em uma temperatura de 24ºC; • 8 dias depois do início da transformação, transferir os discos de folha por sobre um substrato com 500 mg/L de MSlO Cefotaxima I 200 mg/L de L-Kanamicina para a seleção dos calos transformados. Incubar durante 14 dias sob as mesmas condições; • cortar os brotos consistindo em pelo menos duas folhas, não quiméricos e com uma aparência normal. Transferi-los por sobre um substrato para enraizamento (MS O com Cefotaxima 500 mg/L - Kanamicina 200 mg/L - IBA 2 mg/L); • transferir as plantas enraizadas para turfa em pote ou sistema de cultura hidropônica para crescimento, limpando-se delicadamente o substrato das raízes com água. Dispor as plantas em uma câmara climática mantendo-se uma temperatura de 26-302C com um período de iluminação de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão.

Exemplo 4: Transformação genética de Oryza sativa mediada por Agrobacteriwn twnefaciens

[00152] Para a transformação de arroz, variedade CR W3, foi usado o protocolo de Hiei et al. (1994), conforme modificado por Hoge (Rice Research Group, Institute of Plant Science, Universidade de Leiden) e Guiderdoni (Biotrop program, Cirad, Montpellier, França), até que fossem obtidos os calos transformados. Para a etapa de seleção subsequente, foi aplicado o protocolo de Datta e Datta (2006). Serão agora descritas, de maneira breve, as etapas principais do procedimento inteiro.

Preparação e desenvolvimento de calos embriogênicos a partir de scutellwn de arroz [ 00153 J A transformação de arroz foi feita usando-se calos embriogênicos que se derivam do scutellum.

[00154] A fim de induzir a proliferação de calos a partir de tecido de scutellum, foi usado o seguinte protocolo operacional:

• as sementes de arroz foram descascadas (eliminação dos glumas); • para eliminar patógenos e saprófitas contaminantes potenciais, capazes de interferir com a produção dos calos, os cariopses, sem as glumas, foram desinfetados; a. no primeiro tratamento de desinfecção, as sementes descascadas permaneceram durante 2 minutos em uma solução de etanol à 70 %; b. depois do tratamento com etanol, as sementes foram transferidas para uma solução de cloridrato de sódio à 5 % com 2 gotas de.detergente Tween20 e mantidas ali em agitação lenta durante 30 minutos; c. para eliminar todos os trações de cloridrato de sódio, que poderiam inibir a indução de calos nas scutella, foi realizada uma série de lavagens, em água estéril, cada uma durando 15 minutos; • depois da última lavagem, as sementes foram secadas em papel absorvente estéril; • 12 sementes por placa foram posicionadas sobre a superfície do substrato usado para induzir calos (CIM, meio de indução de calos), distribuído em um volume de mL do lado de dentro das placas de Petri (0 90 mm); • as placas assim obtidas foram incubadas no escuro, em uma temperatura de 28ºC, durante 21 dias; depois de 1 semana de incubação, o endosperma e as radículas foram eliminados para promover o desenvolvimento do calo a partir do scutellum (o scutellum é reconhecido por sua massa compacta, parcialmente incluído no endosperma, de cor amarela); • depois de 3 semanas de indução, o calo foi transferido por sobre substrato CIM fresco, e, então, as massas de calo foram rompidas, sem se usar escalpos, seguindo as linhas de fratura naturalmente presentes no calo; • a subcultura foi continuada durante outros 10 dias, de modo a desenvolver o calo embriogênico e torná- lo adequado para transformação.

Cultivo conjunto dos calos com A. tumefaciens EHA 105

1. Para de obter quantidades suficientes de A.

tumefaciens para a transformação, as cepas portando os vetores de plasmídeo mencionados acima (Exemplo 2) foram incubadas durante 3 dias, à 302C, em LB-agar;

2. Quando a agrobactéria foi cultivada, as camadas de células bacterianas foram removidas por raspagem e suspensas no líquido de meio de cultivo conjunto (CCML), até que fosse obtida uma D06oo de cerca de 1, O, correspondendo a 3-5 x 109 células/mL;

3. Os melhores calos, isto é, aqueles com um diâmetro de cerca de 2 mm, compactos e com uma cor esbranquiçada, foram transferidos para uma placa de Petri contendo 35 mL de suspensão bacteriana e deixados em imersão durante 15 minutos, agitados;

4. Então, o calo foi secado, usando-se papel absorvente estéril;

5. Um número máximo de 20 calos foi transferido por placa de Petri com borda elevada (Sarstedt) contendo o substrato semi-sólido para cultivo conjunto (CCMS, meio para cultivo conjunto solidificado);

6. Os calos foram, então, incubados em um ambiente escuro, em uma temperatura de 25ºC durante 3 dias.

Seleção dos calos com base no sistema de marcador de PMI

[00155] Depois do cultivo conjunto dos calos de arroz embriogênicos com a agrobactéria, os tecidos transformados foram selecionados, usando-se o sistema de seleção com base em PMI ( fosfomanose isomerase), como marcador selecionável, e manose, como o agente seletivo. Esse método propicia o uso de substratos de cultivo contendo · concentrações crescentes de manose e concentrações decrescentes de sacarose.

[00156] O procedimento usado foi como se segue: • transferência dos calos a partir do cultivo conjunto com A. tumefaciens por sobre um substrato de PSM (meio de pré-seleção) sem manose e contendo 3 % de sacarose; incubação durante 1 semana, no escuro, em uma temperatura de 28ºC; • transferência dos calos por sobre um substrato SMI (meio de seleção I) contendo 2 % de sacarose e 1,5 % de manose e incubação durante 2 semanas, no escuro, em uma temperatura de 28ºC; • transferência dos calos por sobre um substrato SMII (meio de seleção II) contendo 1 % de sacarose e 2 % de manose e incubação durante 2 semanas, no escuro, em uma temperatura de 28ºC;

• segue a regeneração.

Regeneração de plantas de arroz a partir de calos transformados

[00157] A regeneração das plantas transformadas de maneira putativa ocorreu graças a urna estimulação hormonal adequada do calo transformado, seguindo o procedimento aqui relatado:

1. Os calos de arroz ernbriogênicos selecionados foram transferidos por sobre placas de Petri corn bordas elevadas contendo o substrato PRM (meio de pré- regeneração) contendo 0,5 % de sacarose e 2,5 % de rnanose, e incubação no escuro durante 2 semanas, em urna temperatura de 282C;

2. Depois da passagem no substrato PRM, os calos foram transferidos por sobre o substrato RM (meio de regeneração), sem rnanose, para urn número máximo de 8-10 unidades por placa de Petri corn borda elevada. As plantas foram cultivadas em luz, à 282C, durante 3-4 semanas;

3. Quando as plantas estavam crescidas o bastante para serem separadas do calo (altura~ 3 cm), elas foram transferidas para tubos de cultivo contendo 25 rnL do meio para enraizamento (rm);

4. A subcultura do lado de dentro dos tubos continuou durante cerca de 3 semanas, sempre em torno de 282C, em luz;

5. No final do processo de regeneração, as plantas foram transferidas para turfa e cultivadas sob condições de estufa.

Exemplo 5: Extração de proteínas totais a partir de tecido de folha de tabaco transformado por ensaio 4-MUG

[00158] O procedimento agora descrito permite produzir e preservar extratos de folhas de tabaco, retendo a atividade de enzima da proteína GUS durante urn longo tempo. • Para urn tubo de ensaio de 1, 5 rnL, pesar 15 mg de PVP (poli (vinil-pirrolidona), PM > 40. 000 g/rnol) e adicionar 200 µL de tampão de extração (ver a Tabela 3), agitar em vórtice e deixar em incubação à 4ºC, durante pelo menos 30 minutos; • Extrair o suco de folha usando urna prensa Meku Pollahne; • Remover 100 µL de suco e adicioná-lo à mistura de tarnpão-PVP, mantendo todos eles em gelo; • Centrifugar durante 15 minutos à 4ºC, à 11.500 X g; • Remover o sobrenadante (-200 µL) e transferi-lo muito rapidamente para urn novo tubo de ensaio; • Congelar imediatamente usando nitrogênio líquido e preservar à -80ºC.

Tabela 3: Composição do tampão de extração Componentes Quantidades por 100 ml NaHP04 pH 7,0 5 ml do estoque 1 M DTI5mM 0,5 ml do estoque 1 M Na2EDTA 1 mM 0,2 ml do estoque 0,5 M lauril-Sarcosina de Sódio O, 1 % 1 ml do estoque à 10% Triton X-100 à 0,1% 1 ml do estoque à 10% Em volume com H20 100 mL [00159) O procedimento foi aplicado sem distinção a todas as amostras submetidas à análise fluorométrica. Cada plantas transformada foi analisada em triplicata, usando extratos retirados de 3 folhas (estágio de expansão avançado) presentes na parte apical da planta.

Exemplo 6: Ensaio 4-MUG fluorométrico [00160) Para avaliar o teor da enzima GUS nos extratos de folha proteicos, obtidos a partir das plantas transformadas, foi feito um ensaio fluorométrico específico. O substrato usado foi 4-metil-umbeliferil-~- D-glicuronida (MUG), que gera o composto fluorescente 4- metil-umbeliferona (4-MU), em presença da enzima GUS. O seguinte protocolo foi derivado do procedimento padrão indicado por Jefferson (1987), e foi adaptado para realizar o ensaio em placas. • Para uma placa com 96 cavidades (baixa ligação, Sarstedt), adicionar 10 µL de extrato de folha a 130 µL de solução de MUG (Tabela 4); • Deixar em incubação durante 1 hora, à 372C;

• Remover 20 µL de meio de reação e adicioná-lo rapidamente a 230 µL de Na2C03 0,2 M (solução de parada) em uma placa opaca com 96 cavidades (repetir pelo menos duas vezes por amostra); • Na placa opaca, realizar uma curva de calibração com 4-UM (1 mM e diluições sucessivas de 1:2 para um total de 4-5 pontos); • Ler os valores usando um fluorômetro de placa; • Processar os resultados usando um programa de computador de Análise de Dados por Ajuste de Curva ( Promega) .

Tabela 4: Composição da solução de 4-MUG Componentes Quantidades por 100 ml MUG (PM 352,3) 1,2 mM 0,042 g Tampão de extração GUS (Tabela 3) 100 ml Exemplo 7: Extração de proteínas totais de sementes de arroz transformadas

[00161] Para se obter extratos de proteínas totais a serem ensaiadas usando DAS-ELISA, foi desenvolvido um protocolo de extração, que incluiu as seguintes etapas: • Espigas maduras foram retiradas de cada indivíduo; • As espigas foram secadas em um local seco e arejado durante cerca de 3 dias, até que fosse obtida uma umidade relativa da semente de 14%; • Amostragem aleatória de 40 sementes para cada linhagem;

• As sementes foram descascadas corn urn descascador de arroz manual; • A amostra foi moída corn urn rnicrornoinho por vibração MM2 (Retsch), em uma velocidade de 20 Hz durante 2 minutos e 70 mg da farinha obtida foram removidos; • A farinha foi homogeneizada em urn almofariz corn 1 rnL de tampão de extração (HCl 50 rnM, NaCl 0,5 M, pH= 7 o) I i • Diluição subsequente corn outros 7 rnL do mesmo tampão; • Incubação enquanto se agitava continuamente à 42C, durante 1 hora; • 1 rnL removido e centrifugado à 20.000 x g, durante 40 minutos à 42C; • A fase líquida contendo as proteínas foi recuperada e preservada à -202C.

Exemplo 8: Análise por DAS-ELISA

[00162] O ensaio por DAS-ELISA, corn base em urn reconhecimento imunológico duplo, foi usado para avaliar o teor em GCasi dos extratos de proteína individuais. Para a análise, as amostras foram diluídas em 1:30. Serão agora relatadas as etapas principais do ensaio: • Distribuir, em cada cavidade, 1OO µL do anticorpo policlonal não conjugado anti-GCasi diluído em 2 ng/µL em urna solução de revestimento (PBS diluído 1:5, azida de sódio (0,01 %)) ; • Incubar a placa durante urna noite à 42C;

• Remover o anticorpo;

• Distribuir 250-300 µL de solução de bloqueio (PBS+ BSA à 2,5 % + azida de sódio 0,01 %) em cada cavidade; • Incubar a placa à 25ºC durante 20 minutos; • Remover a solução de bloqueio; • Distribuir 50 µL/cavidade de cada diluição do padrão (200, 100, 50 e 25 pg/ µL de irniglicerase comercial; Sanofi-Genzyme), de cada amostra a ser analisada e da amostra de controle, consistindo na solução de diluição (PBS+ Tween20 à 0,1 % + BSA à 1 %) ; • Incubar a placa durante 30 minutos à 37ºC enquanto se agita; • Lavar as cavidades 3 vezes corn 300 µL/cavidade de solução de lavagem (PBS+ Tween20 à 0,1 %) ; • Distribuir 50 µL/cavidade de anticorpo policlonal anti-GCasi conjugado corn peroxidase de rábano, diluída à 0,4 ng/µL de solução de diluição; • Incubar a placa durante 30 minutos à 37ºC enquanto se agita; • Lavar as cavidades 3 vezes corn 300 µL/cavidade de solução de lavagem (PBS+ Tween20 à 0,1 %) ; • Distribuir 100 µL/cavidade de solução de TMB; • Incubar a placa durante cerca de 10 minutos à

• Parar a reação corn solução de parada (ácido clorídrico 1 M), 100 µL/cavidade;

• Ler a placa em 45O run com leitora de placas Modulus II (Promega); • Processar os dados usando programa de computador de Análise de Dados por Ajuste de Curva (Promega), designando os valores de concentração conhecidos dos padrões. Os valores de concentração das amostras foram obtidos usando-se uma curva linear com quatro parâmetros, considerando o fator de diluição adotado, a fim de se obter as concentração reais dos extratos.

BIBLIOGRAFIA

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Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. ADN artificial de uma região de líder de 5'-UTR, caracterizado por: o ADN artificial sendo efetivo no aumento da expressão de proteínas recombinantes em plantas, o ADN artificial compreendendo, ao longo da direção 5' ----> 3', urn sítio de iniciador Inr e urna sequência de consenso de Kozak ou similar a Kozak, o ADN artificial compreendendo adicionalmente, entre o sítio de iniciador Inr e a sequência de consenso de Kozak ou similar a Kozak: uma pluralidade de regiões de poli(CAA) ou (CAA)n, cada urna formada por um oligonucleotídeo que consiste em duas ou mais cópias de urn elemento CAA contíguo um ao outro, e urna pluralidade de regiões de poli(CT) ou (CT)m no mesmo número que as regiões de poli(CAA) e cada um formado por urn oligonucleotídeo que consiste em duas ou mais cópias de urn elemento CT contíguo um ao outro, sendo que pelo menos uma, opcionalmente cada uma, região de poli(CAA), na direção 5' ----+ 3', está à montante de uma região de poli(CT), e pelo menos urna região de· poli (CAA), na direção 5' ----+ 3', é contígua à urna região de poli(CT), corn a condição de que o ADN artificial não contenha quaisquer dos seguintes componentes: rnoti vos ricos em A/T, elementos de trinucleotídeo ATT, elementos de trinucleotídeo CTG e tratos hornopolirnéricos, isto é, sequências consistindo em mais do que 3, opcionalmente mais do que 4, nucleotídeos idênticos.

2. ADN artificial, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que né um número inteiro, o qual pode ser selecionado igual ou diferente dentre regiões de poli (CAA), maior do que ou igual a 2, opcionalmente compreendido entre 3 e 9, opcionalmente entre 4 e 8, opcionalmente entre 5 e 7.

3. ADN artificial, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de quem é um número inteiro, o qual pode ser selecionado igual ou diferente dentre as regiões de poli(CT), maior do que ou igual a 2, opcionalmente compreendido entre 3 e 5.

4. ADN artificial, de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de conter duas regiões de poli (CAA) e duas regiões de poli (CT), sendo que uma primeira região de poli (CAA) está à montante de uma primeira região de poli (CT), e uma segunda região de poli(CAA) está à jusante da primeira região de poli(CT) e à montante de uma segunda região de poli(CT).

5. ADN artificial, de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sítio de iniciador Inr é o sítio de início de transcrição 5' -ACACG-3' de CaMV 35S ou é um sítio de iniciador Inr com sequência de consenso 5 '-YYANíilYY-3', sendo que: Y = C, T; N = A, C, G, T; W = A, T.

6. ADN artificial, de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1.

7. ADN artificial, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender a sequência mostrada em.SEQ ID NO: 2.

8. ADN artificial, de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência de consenso de Kozak ou similar a Kozak é uma sequência que exige a presença de um elemento R, que é uma purina em posição 3 à montante do códon de início de tradução.

9. ADN artificial, de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os motivos ricos em A/T são definidos como tratos ou sequências consistindo em mais do que 3, opcionalmente mais do que 4, nucleotídeos adenina (A) e/ou timina (T), em qualquer combinação dos mesmos.

10. ADN artificial, de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que não contém o octârnero ACAATTAC.

11. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender ADN artificial de uma região de líder 5 '-UTR efetiva no aumento da expressão de proteínas recombinantes em plantas, conforme definido na reivindicação 1.

12. Método para a produção de proteínas recombinantes em plantas, caracterizado por compreender a transformação das plantas usando um vetor de expressão conforme definido na reivindicação 11.