JPH0231721B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ ヘパリンから誘導され、直鎖状かつ交互に配
列している８個以下のＤ−グルコサミンおよびウ
ロン酸（Ｄ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸）
糖残基で構成されるオリゴ糖からなるヘパリン由
来オリゴ糖画分であつて、イン−ウエスラーテス
トによつて決定される血液の活性化Ｘ因子に対す
る活性（抗Xa活性）を有しており、前記抗Xa活
性を有しておりかつ８個未満の糖残基の配列（こ
の配列はATすなわちアンチトロンビンに対
する結合親和力を有しており当該オリゴ糖画分に
特異的な抗Xa活性をもたらす）を含んでいる８
個までの糖残基で構成された断片または鎖から成
る分子量の低下したオリゴ糖画分を含有する混合
物が得られるように調整された条件下で、分子量
が約2000〜約50000の範囲にある多糖鎖からなり
抗凝血活性を有するヘパリンまたはヘパリン画分
を、ヘパリン多糖鎖を解重合または断片化し得る
試薬と接触させる段階と、(a)前記混合物をAT
と接触させて前記抗Xa活性およびAT結合親
和力を有する前記オリゴ糖画分の少なくとも大部
分を保持させ、(b)混合物からATに保持されな
かつた物質を除去し、(c)前記ATから前記オリ
ゴ糖画分を分離することによつて、前記オリゴ糖
画分の少なくとも大部分を分離する段階と、から
なる方法によつて得ることができる前記ヘパリン
由来オリゴ糖画分およびこれらの薬剤上許容し得
る塩。 ２ ATに対する結合親和力、ヘパリンより高
い抗Xa活性および低い全体的抗凝血活性を有し、
８個までの糖残基で構成され、かつ８個未満の糖
残基をもつた配列を含んでおり、この配列が前記
オリゴ糖に特異的な抗Xa活性をもたらししかも
ATを認識してこれに結合するのに必要な特異
的構造を有していることを特徴とする、請求の範
囲１に記載のオリゴ糖画分およびこれらの薬剤上
許容し得る塩。 ３ イン−ウエスラー力価対USP力価の比が少
なくとも30であることを特徴とする、請求の範囲
１または２に記載のオリゴ糖画分およびこれらの
薬剤上許容し得る塩。 ４ イン−ウエスラー力価対USP力価の比が少
なくとも100であることを特徴とする、請求の範
囲３に記載のオリゴ糖画分およびこれらの薬剤上
許容し得る塩。 ５ 少なくとも100u（インウエスラー）／mg、有
利にはヘパリンの10倍である抗Xa活性を有して
いることを特徴とする、請求の範囲１〜４のいず
れかに記載のオリゴ糖画分およびこれらの薬剤上
許容し得る塩。 ６ 抗Xa活性が少なくとも700u／mgであること
を特徴とする、請求の範囲５に記載のオリゴ糖画
分およびこれらの薬剤上許容し得る塩。 ７ 抗Xa活性が少なくとも1000u／mgであること
を特徴とする、請求の範囲６に記載のオリゴ糖画
分およびこれらの薬剤上許容し得る塩。 ８ ３−０−スルフエート化されているＮ−スル
フエート−Ｄ−グルコサミン残基Ｆを含有してい
ることを特徴とする、請求の範囲１〜７のいずれ
かに記載のオリゴ糖画分およびこれらの薬剤上許
容し得る塩。 ９ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基Ｄおよ
び／またはＤ−グルクロン酸残基Ｅおよび／また
は２−０−スルフエート−Ｌ−イズロン酸残基Ｇ
および／またはＮ−スルフエート−Ｄ−グルコサ
ミン残基Ｈを含有していることを特徴とする、請
求の範囲１〜８のいずれかに記載のオリゴ糖画分
およびこれらの薬剤上許容し得る塩。 １０ ２−０−スルフエート−４，５−不飽和ウ
ロン酸残基Ａおよび／またはＮ−スルフエート−
Ｄ−グルコサミン残基Ｂおよび／またはＬ−イズ
ロン酸残基Ｃを含有していることを特徴とする、
請求の範囲１〜９のいずれかに記載のオリゴ糖画
分およびこれらの薬剤上許容し得る塩。 １１ 還元末端にＮ−スルフエート−Ｄ−グルコ
サミン残基を含有しており、この残基は３位およ
び／または６位でスルフエート化されていてもい
なくてもよいことを特徴とする、請求の範囲１〜
１０のいずれかに記載のオリゴ糖画分およびこれ
らの薬剤上許容し得る塩。 １２ 上記で定義した残基Ａ〜Ｈを全て含有して
おり、オリゴ糖鎖１本につき約１分子のＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンが存在し、および／また
はＮ−スルフエート−Ｄ−グルコサミン残基２個
または３個に対して１個のＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミン残基が存在することを特徴とする、請
求の範囲１〜１１のいずれかに記載のオリゴ糖画
分およびこれらの薬剤上許容し得る塩。 １３ 配列ABIDEFGH、ABGHIDEF、
ABIDEF、IDEFGHまたはDEFGH（ここで、Ｉ
は不飽和ウロン酸残基またはイズロン酸残基であ
る）に相当する構造によつて特徴付けられる、請
求の範囲１〜１２のいずれかに記載のオリゴ糖画
分およびこれらの薬剤上許容し得る塩。 １４ イン−ウエスラーテストによつて決定され
る血液の活性化Ｘ因子に対する活性（抗Xa活性）
を有するオリゴ糖画分の製造方法であつて、 前記抗Xa活性を有しておりかつ８個未満の糖
残基の配列（この配列はATすなわちアンチト
ロンビンに対する結合親和力を有しており当該
オリゴ糖画分に特異的な抗Xa活性をもたらす）
を含んでいる８個までの糖残基で構成された断片
または鎖から成る分子量の低下したオリゴ糖画分
を含有する混合物が得られるように調整された条
件下で、分子量が約2000〜約50000の範囲にある
多糖鎖からなり抗凝血活性を有するヘパリンまた
はヘパリン画分を、ヘパリン多糖鎖を解重合また
は断片化し得る試薬と接触させる段階と、(a)前記
混合物をATと接触させて前記抗Xa活性およ
びAT結合親和力を有する前記オリゴ糖画分の
少なくとも大部分を保持させ、(b)混合物からAT
に保持されなかつた物質を除去し、(c)前記AT
から前記オリゴ糖画分を分離することによつ
て、前記オリゴ糖画分の少なくとも大部分を分離
する段階と、からなる方法。 １５ Ｎ−スルフエート−Ｄ−グルコサミン単位
とその次のウロン酸単位との間でヘパリン鎖を切
断する化学的方法によつてヘパリンを解重合する
ことを特徴とする請求の範囲１４に記載の方法。 １６ ヘパリンを亜硝酸によつて解重合すること
を特徴とする請求の範囲１５に記載の方法。 １７ PHが約２〜４でほぼ室温の水性媒質中で亜
硝酸によつてヘパリンを解重合することを特徴と
する請求の範囲１６に記載の方法。 １８ Ｎ−スルフエート−Ｄ−グルコサミン残基
のアノマー炭素とその次のウロン酸単位との間で
ヘパリン鎖を開裂する酵素的プロセスによつてヘ
パリンを解重合することを特徴とする請求の範囲
１４に記載の方法。 １９ 約６〜８のPHかつほぼ室温で細菌のヘパリ
ナーゼによつてヘパリンを解重合することを特徴
とする請求の範囲１８に記載の方法。 ２０ フラボバクテリウム・ヘパリヌム
（Flavobacterium heparinum）に由来する精製
された細菌性ヘパリナーゼによつてヘパリンを解
重合することを特徴とする請求の範囲１９に記載
の方法。 ２１ 分子量の低下したオリゴ糖を含有する前記
混合物から前記オリゴ糖画分の大部分を分離する
際に、固定化されたATを含有するカラムでア
フイニテイ−クロマトグラフイーを実施すること
を特徴とする請求の範囲１４、１５または１８に
記載の方法。 ２２ イオン強度が約0.1M〜約0.2Mである緩衝
液によつてカラムを平衡化し、このカラムでPHを
６〜８として分離を実施し、ATに対する親和
力をほとんどまたは全くもたない混合物の成分は
緩衝溶液で洗浄することによつて除去することを
特徴とする請求の範囲２１に記載の方法。 ２３ さらに、前記ATに保持されたオリゴ糖
画分を、このオリゴ糖画分を前記ATから分離
するのに充分なイオン強度を有する緩衝液で溶出
することによつて前記保持されたオリゴ糖画分を
回収する段階を含んでおり、前記緩衝液は前記画
分が含有しているオリゴ糖のアルコール沈澱を含
めて以後の回収段階で障害とならないものの中か
ら選択されることを特徴とする請求の範囲１４、
１５または１８に記載の方法。 ２４ さらに、前記ATによつて保持されたオ
リゴ糖の混合物を分画する段階を含むことを特徴
とする請求の範囲１４、１５または１８に記載の
方法。 ２５ 前記分画は最初に大きい分子、次に小さい
分子を溶出するゲルパーミエーシヨンによつて実
施し、イン−ウエスラー力価対USP力価の比が
少なくとも30である画分を回収し、この回収は抗
Xa活性を示す画分が全て溶出・回収されてしま
うまで続けることを特徴とする請求の範囲２４に
記載の方法。 ２６ イン−ウエスラー力価対USP力価の比が
少なくとも100である画分を回収することを特徴
とする請求の範囲２５に記載の方法。 ２７ 前記混合物をATに接触させる前に、８
個より多くの糖残基を有するオリゴ糖を混合物か
ら分離することを特徴とする請求の範囲１４、１
５または１８に記載の方法。 ２８ ８個より多くの糖残基を有するオリゴ糖を
ゲル過によつて混合物から分離することを特徴
とする請求の範囲２７に記載の方法。 明細書 本発明は、生物学的性質特に血液凝固過程のあ
る段階を特異的に制御する能力を有するオリゴ糖
画分及びオリゴ糖に係る。 本発明は又、それらの製法及び薬剤の有効成分
としての用途にも係る。 本発明は特に、血液の活性化Ｘ因子即ちXa因
子に対して高度に選択的な活性、即ち、患者を出
血の危険にさらすことなく強力な抗トロンビン
（血栓）活性を呈するオリゴ糖及び該オリゴ糖を
含むオリゴ糖画分に係る。本明細書中で“オリゴ
糖画分”なる用語は、種々の数の糖残基を有する
オリゴ糖断片又はオリゴ糖鎖の比較的均質な混合
物を指称して使用する。 本発明者等はこの領域に於ける研究を続け、例
えばヘパリンから得られる生物学的に活性なオリ
ゴ糖画分及びオリゴ糖自体に注目するに至つた。 本明細書中でヘパリンなる用語は最も広義に使
用されており、医薬グレードの市販ヘパリン及び
生物材料特に哺乳類組織から抽出して得られた粗
製ヘパリンのいずれも含まれる。 ヘパリンは含有するオリゴ糖鎖の組成から考え
ても鎖の分子量から考えても不均質な多糖類であ
ると考えられる。 一般にヘパリンは、主として２−０−スルフエ
ート−Ｌ−イズロン酸残基及びＮ−スルフエート
−Ｄ−グルコサミン残基（６−０−スルフエート
化されたもの又はされていないもの）を含んでお
り、またそれより少ないがＤ−グルクロン酸残
基、Ｌ−イズロン酸残基及びＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミン残基（６−０−スルフエート化され
たもの又はされてないもの）を含むと考えられて
いる。 またヘパリンは、血漿蛋白質たるアンチトロン
ビン（すなわちAT）が有する、血液凝固過
程における連続した酵素反応に対する阻害作用を
高めることによつて抗凝血活性を発揮することも
知られている。同時にヘパリンは種々の形の凝血
能亢進の生起と維持に関与する多数の凝血因子を
抑制し得るので、その活性は特異的でなく全体的
（global）である。 この抗凝血活性は確かに価値が高いが、ヘパリ
ンの作用が全体的であるため治療中の患者の凝血
−線溶系の平衡を回復することは微妙である。そ
の結果、（凝血亢進の危険例えば手術後の血栓形
成を避けるために）過多用量の抗凝血薬が投与さ
れたりその薬剤の選択性が不十分であつたりする
ため出血という重大な事態が生じることがある。 本発明者等は、ヘパリンの種々の解重合条件と
得られた解重合混合物とを十分に研究した結果、
或る種の条件で処理すると重要な抗凝血能を持つ
オリゴ糖を含有する混合物を得ることができると
いうことを確信するに至つた。これらのオリゴ糖
は活性の特異性に関してヘパリンよりすぐれてい
る。より詳細にはこれらのオリゴ糖は、より小数
の凝血因子特にXa因子に対するATの特異的
活性を増強し得る。特に、前記の如き画分とオリ
ゴ糖とはUSP法で測定して低い全体的抗凝血活
性を有すること、従つて、イン−ウエスラー単位
（Yin−Wessler unity）で表わした抗Xa活性と
USP力価との比は大きく、少なくとも30である
ことが判明した。 よく知られているように、イン−ウエスラー活
性は、対応するテストに於いてATによる血液
の活性化因子Xaの阻害を増強する活性画分の作
用をより特定的に表わすものであり、USP力価
は血液即ち血漿の全体的凝固を阻害する活性画分
の能力を表わすものである。 イン−ウエスラー力価は、J.Lab.Clin.Med.，
1976，81，298〜300に収載の方法で測定し、
USP力価は“米国薬局方”XIX、229〜230ペー
ジに記載の方法により測定する。（後者に関して
はU.S.P.−NF第２補遺62ページ“Drug
substances”及びU.S.P.第４補遺90ページ
“Dosage Forms”も参照されたい。） 予想外であつたが、特定の条件で実施したいく
つかの精製処理により得られた解重合混合物から
単離することができる短いオリゴ糖鎖、即ち糖残
基を最大８個まで含有する鎖の中に所望の特異的
抗Xa活性が見出されることが明らかになつた。 本明細書中で使用する“糖残基”なる用語は、
ヘパリンの鎖の中に含まれる単糖類、すなわち任
意に置換されたＤ−グルコサミン単位および任意
に置換されたウロン酸（Ｄ−グルクロン酸または
Ｌ−イズロン酸）単位を示す。 更に、極めて重要な一面に従つて本発明者等
は、前記の画分及びオリゴ糖の例えばイン−ウエ
スラー単位で表わした抗Xa活性が生体内で有意
義な抗トロンビン活性となることを発見した。 そこで本発明の目的は、高い抗Xa活性を有し
ており凝血過程の特徴たる連続的酵素反応におい
て顕著な選択性を有する新規なオリゴ糖及びこれ
らのオリゴ糖を含有する画分を提供することであ
る。 本発明の別の目的はこれらのオリゴ糖の構造上
の特徴を明らかにすることである。 更に、本発明の目的は、これらの画分を製造す
る実施の容易な方法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、特にXa因子を高度
な選択性で阻害し得るが全体的凝血に対する活性
は極めて低レベルに維持し得る薬剤の有効成分及
び薬剤自体を提供することである。これらの薬剤
は、出血の危険を伴なうことなく抗トロンビン処
置をするために有利に使用し得る。 前記のオリゴ糖画分は下記の段階Ａ及びＢを含
む方法によつて得られるようなものである。 Ａ−分子量が約2000乃至約5000の鎖を有し抗凝血
活性を持つヘパリン（又はヘパリン画分）を、
ヘパリン鎖を解重合又は断片化し得る試薬と接
触させる。この段階実施のために使用する条件
は、最高で８個の残基から成るが抗Xa活性
（イン−ウエスラー）を有しており、８個未満
の残基から成り生成物の特異的抗Xa活性の原
因となる配列を含むオリゴ糖断片又は鎖を含ん
でいるような解重合混合物が得られるように調
整する。 Ｂ−上に定義したオリゴ糖鎖の少なくとも大半部
を分離すべく解重合混合物を処理する。この処
理は下記の段階を含むのが有利である。 ａ） ATを認識して結合するのに必要な特
異的構造を持つ配列を有するオリゴ糖の少な
くとも大半部好ましくは実質的に全部を選択
するべく解重合混合物をATと接触させ
る。 ｂ） 不要生成物を除去する。 ｃ） 選択した生成物を回収する。 前記のオリゴ糖の特徴は、ATに結合し得る
特異的構造を有することである。これらのオリゴ
糖は、ヘパリンより高い抗Xa活性を有しており
全体的抗凝血活性は極めて弱い。 上記方法で回収したATに親和力を持つ生成
物を１個または数個の段階で処理して前記の短鎖
オリゴ糖を選択的に分離する。 有利な分離方法では、ATに親和力を持つ溶
出した生成物の混合物をその分子量及び／又はイ
オン濃度によつて分画し、次に所望画分を回収す
る。 変形として解重合混合物に分画処理を直接実施
することも可能である。この段階で、オリゴ糖短
鎖を含む画分好ましくはオリゴ糖自体を単離し得
る。次に前記の如く、ATに対して高い親和力
を有する画分とATとを接触させる段階を使用
して、該画分、場合によつてはオリゴ糖を分離す
る。 本発明のオリゴ糖画分は前記の種々の段階を使
用して得られるような画分である。これらの画分
の特徴は、８個より多くの糖残基を含むオリゴ糖
を含まないこと、画分が、８個より多くの糖残基
を含有せず少なくとも主要な程度に抗Xa活性を
決定的に支配する８個未満の糖残基を含む１個の
配列を含有するオリゴ糖から成ることである。 ひとつの具体例によれば、本発明の画分は、特
に水性媒体中で亜硝酸HNO₂を用いる化学的プロ
セスによつてヘパリン材料を解重合する方法によ
つて得られるようなものである。 この場合ヘパリン鎖はＮ−スルフエートグルコ
サミン単位（残基）とその次のウロン酸単位との
間で切断され、還元末端に２，５−無水マンノー
ス残基を含有する鎖が生成する。 別の具体例に於いては、解重合は、好ましくは
精製された高純度のヘパリナーゼ、特に細菌のヘ
パリナーゼを用いた酵素的プロセスによつて行な
われる。 この酵素は、Ｎ−スルフエートグルコサミン残
基のアノマー炭素とその次のウロン酸単位との間
でヘパリン鎖を切断する。 この酵素の作用によつて、重合度が２の倍数で
非還元未端がα，β−不飽和ウロン酸であるオリ
ゴ糖（二糖、四糖、六糖、八糖類）の混合物が生
成する。 精製ヘパリンを用いる解重合は、８個までの糖
残基を含みそのうちのあるものは６個以下の糖残
基を含む生物学的に活性な前記オリゴ糖が生成す
るような条件下で実施するのが有利である。これ
らの条件では酵素反応の極限が達成される。換言
すれば、生成したオリゴ糖は高精製ヘパリナーゼ
の作用を受けなくなつている。 この生物学的に活性なオリゴ糖は、ATに対
する親和力をもつ生成物は固定または保持し得る
がこのような親和力を持たない生成物は例えば洗
浄によつて除去し得るような条件下で、担体に固
定化したAT例えばアガロースに固定化した
ATに吸着させて（化学的又は酵素的方法で得
られた）前記解重合混合物から分離できるものに
相当する。 前記吸着処理の後、保持又は吸着された生成物
を溶出して回収し、分画して抗Xa活性を有する
短鎖を単離する。 場合によつては、ATに対する画分の親和力
に基いた分離処理の前に、解重合混合物に前記の
如き分画処理を施して所望鎖を分離する。このよ
うな分離にはゲルパーミエーシヨン（ゲル過）
を使用するのが有利である。 前記の如く単離されたオリゴ糖鎖の大部分は、
その特徴として、ATに対する高い親和力従つ
て抗Xa活性を有する以外に、Ｎ−スルフエート
グルコサミン残基の２位の炭素の領域に特有のシ
グナルを含むNMRスペクトルを示す（このシグ
ナルは第５図及び第６図で星印で示されている）。
このシグナルはヘパリンでは現われない。これは
３位酸素原子に置換基、特にＮ−スルフエート−
Ｄ−グルコサミン糖残基に３−０−スルフエート
基が存在するためであろう。 これらのオリゴ糖の特徴は更に、イン−ウエス
ラー力価とUSP力価との比が少なくとも30、好
ましくは少なくとも100の値を有することである。 好ましいオリゴ糖画分及びオリゴ糖は、ヘパリ
ンより高度なAT親和力と抗Xa活性（イン−
ウエスラー）を有するものからなる。抗Xa活性
はヘパリンの10倍にもなり得る。或る種のオリゴ
糖では100iu／mgより高い活性を観察し得ること
もある。別のオリゴ糖では700iu／mgより高い値、
少なくとも1000iu／mg、更に1200、時には
2000iu／mg以上に達する値を観察し得る。 本発明の活性オリゴ糖は、好ましくは３−０−
スルフエート置換されたＮ−スルフエート化Ｄ−
グルコサミン残基（以下の式中Ｆで示される）を
有する。 別のオリゴ糖は更に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グル
コサミン残基Ｄ及び／又はＤ−グルクロン酸残基
Ｅ及び／又は２−０−スルフエート−Ｌ−イズロ
ン酸残基Ｇ及び／又はＮ−スルフエート−Ｄ−グ
ルコサミン残基Ｈを含む。 別のオリゴ糖中で下記の糖残基即ち２−０−ス
ルフエート−４，５−不飽和ウロン酸Ａ及び／又
はＮ−スルフエート−Ｄ−グルコサミン単位Ｂ及
び／又はＬ−イズロン酸単位Ｃが観察される。 本発明の好ましいオリゴ糖は還元末端にＮ−ス
ルフエート−Ｄ−グルコサミン残基を有する。こ
の残基は３位及び／又は６位にスルフエートを有
していてもよい。 いくつかのオリゴ糖は前出の残基全部を含む。
Annal.Biochem.，1979，98，478−480に収載の
Smith及びGilkersonの方法によつてＮ−アセチ
ル−グルコサミン単位を比色法で定量すると、オ
リゴ糖鎖１個当りＮ−アセチルグルコサミン分子
が約１個存在することが分かる。酸加水分解の前
後のグルコサミンの定量によつて、Ｎ−スルフエ
ート−グルコサミン及びＮ−アセチル−グルコサ
ミン残基の各々の量を測定し得る。 本発明のオリゴ糖のあるものは、２個のＮ−ス
ルフエート−グルコサミン残基に対して１個のＮ
−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基が存在するの
が特徴であると考えられる。 別のオリゴ糖の特徴は、３個のＮ−スルフエー
ト−Ｄ−グルコサミン残基に対して１個のＮ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミン残基が存在することで
ある。 この種のオリゴ糖は、下記の配列
ABCDEFGHに相当する八糖類から成る。 式中、Ｒは水素原子又はスルフエート基SO₃を
示す。 別の八糖類は配列ABGHCDEFを有する。 本発明の活性な六糖類は同様に前記糖残基Ａ，
Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ及びＨの中の残基を６個
含む。これらの六糖類の１種は配列ABCDEFを
有する。 別の六糖類は配列CDEFGHを有しており、式
中のＣは不飽和ウロン酸である。 更に別の六糖類は配列CDEFGHでＣがイズロ
ン酸残基のものである。 別の活性オリゴ糖は五糖類、特に構造DEFGH
を持つ五糖類である。 同様に生物学的に活性のあるより短いオリゴ糖
鎖もまた本発明の一部を成す。 更に、上記のオリゴ糖の薬剤上許容できる塩も
本発明の一部である。 本発明は更に、前記の如き画分の製法を提供す
ることを目的とする。本発明の製法は、ヘパリン
の解重合段階と得られた解重合混合物を処理して
前記の如き８個までの糖残基を有するオリゴ糖を
含有する画分（有利にはオリゴ糖自体）を分離す
る段階とを含む。得られる画分又はオリゴ糖は、
ATに対する高い親和力と高い抗Xa活性（イ
ン−ウエスラー）とを有する。 解重合段階は、オリゴ糖鎖を完全には分解せ
ず、抗Xa活性（イン−ウエスラー）を実質的な
程度でもたらす残基を保持するような温和な条件
下で実施する。 好ましくは、前記方法の解重合条件は、得られ
るオリゴ糖の少なくとも一部が固定化ATに特
異的に保持され得るという該オリゴ糖の能力を維
持するように調整する。 これらの条件はまた、得られるオリゴ糖の少な
くとも一部の（イン−ウエスラーテストにより測
定可能な）抗Xa活性を示す能力が維持され、
USPテストによる抗凝血活性を事実上なくなる
ように選択するのが有利である。 前記の解重合条件の変更は勿論可能であるが、
抗Xa活性（イン−ウエラスー）を有するオリゴ
糖を高収率で得たいときは前記の条件に調整する
のが有利でると考えられる。 HNO₂によりヘパリンを解重合するには、PH２
乃至４、好ましくは約３として周囲温度に近い温
度を用いた水性媒体中で反応を実施するのが有利
である。 ヘパリナーゼで解重合する場合、好ましくは高
精製ヘパリナーゼ、特に細菌のヘパリナーゼ、よ
り特定的にはフラボバクテリウム・ヘパリウム
（Flavobacterium heparinum）由来のヘパリナ
ーゼを使用する。条件は、ATに対する親和力
と抗Xa活性（イン−ウエスラー）とを維持して
いる最も短い断片が得られるように調整する。 ６乃至８の範囲、特に中性に近いPHを用いほぼ
周囲温度で処理するのが有利である。ヘパリナー
ゼは、加水分解が完了するまで少量ずつ反応混合
物に添加する。 場合によりヘパリナーゼによる解重合は、ヘパ
リンをHNO₂で分解後得られたオリゴ糖画分に対
して実施してもよいし、同様に、８未満の残基を
含む活性オリゴ糖と一緒に固定化ATに保持さ
れた後これらの短鎖オリゴ糖と共に溶出する高分
子量のオリゴ糖に対して実施してもよい。 所望のオリゴ糖を含有する画分の分離及び回収
は、固定化ATを含むカラム内でのアフイニテ
イークロマトグラフイーによつて行なうのが有利
である。 AT分子を結合した商標セフアロース
（Sepharose）として市販のアガロースゲルを使
用すると満足な結果が得られる。 解重合混合物に含まれており抗Xa活性の高い
生成物の大半を所望通りに分離するためには、約
0.2M好ましくは0.1M以上のイオン強度をもち６
乃至８好ましくはほぼ中性又は中性よりやや高い
PHの緩衝液でカラムを平衡させるのが有利であ
る。 ATに対する親和力の無い生成物又は極めて
微弱な親和力しか持たない生成物は緩衝液で洗浄
して除去される。カラムの平衡化に使用した緩衝
液と同種の緩衝液を使用するのが有利である。 ATに保持又は吸着された抗Xa活性（イン
−ウエスラー）を持つ生成物の好ましい回収方法
では、目的を達成すべく十分なイオン強度を持つ
緩衝液で溶出してオリゴ糖全部の脱着と回収とを
行なう。この溶出に使用される緩衝液は、回収画
分に含まれるオリゴ糖の（特にアルコール沈澱に
よる）以後の回収段階を妨害しない緩衝液の中か
ら選択するのが有利である。適当な緩衝液は、オ
リゴ糖の沈澱を生起する或る濃度のアルコール
（任意の適当なアルコール例えばエタノール）の
存在中で可溶性を維持するカルシウム塩例えば塩
化カルシウムを含有している。ナトリウム塩も又
使用し得る。 ATに対する親和力を持つ生成物の溶出後、
アルコール沈澱によりこれらの生成物を回収し、
次に例えば遠心分離によつてこれらの生成物を分
離するのが有利である。 所要とされる高い抗Xa活性（イン−ウエスラ
ー）と十分な均質性とを持つオリゴ糖画分を得る
ためには、既にATに保持されたオリゴ糖全部
の混合物を、ゲル過若しくはイオン交換クロマ
トグラフイー又は両方法又は同様の結果を与える
他の何らかの方法によつて分画する。 この分画処理は、大きめの分子が溶出した後に
小さめの分子を回収するようにすると有利であ
り、イン−ウエスラー力価とUSP力価との比が
少なくとも30好ましくは100の画分から始めて、
少なくともイン−ウエスラーテストでは抗Xa活
性を示す残りの画分全部を回収する。 順々に溶出する画分の容量は、ゲル過または
クロマトグラフイー処理にかけられる溶液の量に
応じ、所望の用途に対して最適の画分を得るよう
に常法に従つて選択する。 変形例に於いては、ATへの固定段階の前
に、８個より多くの糖残基を含むオリゴ糖を解重
合混合物から除去する。これは、前記の如きゲル
過又は同様の方法によつて行なうのが有利であ
る。 得られた溶出画分から、生物学的活性オリゴ糖
即ち八糖、七糖、六糖、五糖、四糖及び三糖類を
単離することができる。 本発明の画分及びオリゴ糖に関する薬理学的研
究によれば、イン−ウエスラー単位で表わした抗
Xa活性と抗トロンビン活性との間に１つの関係
が存在することが判明した。 これらの画分とオリゴ糖とは強力な抗トロンビ
ン活性を示すと考えられる。全体的な抗凝血活性
が弱いか又は全くないので、有利なことに出血の
危険は事実上除去される。 抗トロンビン活性を検査するための生体内アツ
セイの中から、J.Appr.Physiol.，1959，14，943
−946に収載のウエスラー（Wessler）他による
方法を用いてラビツトに対して行なつたテストを
下記に説明する。 活性化プロトロンビンの複合体を注射してラビ
ツトの頚静脈に血栓を形成させた。 凝塊形成性複合体25単位／Kgを注射する前に、
イン−ウエスラー力価2000単位／mgを有する八糖
ABCDEFGHを注射して血栓形成に対するこの
八糖の予防効果を検討した。 トロンボプラスチン複合体より前にオリゴ糖を
150乃至250iu／mg（イン−ウエスラー）で注射す
ると、血栓形成に対する十分な保護が得られる。 従つてこの八糖は強力な抗トロンビン活性を有
すると思われる。有利なことに全体的な抗凝血活
性は検出できない。 本発明のオリゴ糖画分は毒性を持たない。本発
明の画分の１種を10000u/Kg（イン−ウエスラー
力価）でラビツトに投与しても、いかなる毒性反
応も、また、フランス薬局方によるラビツトの発
熱テストに於ける発熱作用も示さない。 従つて本発明の組成物は、人又は動物の凝血の
いくつかの段階を特異的に調節するために特に適
当である。特に、血液のXa因子の活性の選択的
調節（例えばアテローム病の患者の手術後又は手
術前の細菌又は酵素性活性化因子による凝血機序
の変調（Perturbation）の調節）が望まれるとき
に特に適当である。 従つて本発明は、高い抗Xa活性を有する前記
のオリゴ糖画分又はオリゴ糖自体を含む薬剤に係
る。 本発明は特に、有効量の活性成分を賦形剤と共
に含有した発熱物質を含まない薬剤に係る。 特に本発明は、経口投与に適する担体（ベヒク
ル）を含む組成物に係る。経口投与に適した本発
明の有利な剤形は、耐胃性のカプセル剤、錠剤又
は丸剤である。 別の薬剤組成物はオリゴ糖又は画分を直腸投与
に適した賦形剤と共に含有する。この剤形は座薬
である。 本発明の別の剤形は、スプレー剤又は軟膏から
成る。 本発明は更に、無菌又は滅菌可能な注射用薬剤
組成物にも係る。 これらの溶液は皮下注射剤として使用されると
きは1000乃至100000u（イン−ウエスラー）／ml、
好ましくは5000〜50000例えば25000u／mlのオリ
ゴ糖又はオリゴ糖画分を含有するのが有利であ
る。静脈注射又は潅流に使用されるときは例えば
500乃至1000特に5000u/mlのオリゴ糖又はオリゴ
糖画分を含有し得る。 このような薬剤は、任意の適切な時に使用でき
る使い捨て注射器の形態にしてあるのが有利であ
る。 本発明は更に、特に血栓症の予防と治療に有効
な別の活性成分、例えばジヒドロエルゴタミン又
はニコチン酸塩の如き静脈緊張調節剤又はウロキ
ナーゼの如き血栓溶解剤と組み合わせて前記オリ
ゴ糖を含有する薬剤組成物にも係る。 本発明のオリゴ糖画分及びオリゴ糖はナトリウ
ム及び／又はカルシウム及び／又はマグネシウム
の如く生理的に許容される少なくとも１種の金属
の塩の形態とするのが有利である。 本発明の薬剤組成物は、人又は動物の血液凝固
の（予防的な又は治療的な）調節に特に適切であ
る。特に適当な場合は、特に有機物によるトロン
ボプラスチンの放出例えば組織トロンボプラスチ
ンの放出の結果として凝血亢進の危険を持つ患者
（外科手術、アテローム進行、腫瘍の発達、及び
細菌又は酵素性活性化因子による凝血機序の乱れ
等）の場合である。 本発明を説明するために、人に対する薬用量の
１例を下記に示す。 この薬用量は、患者の凝血亢進の危険度即ち血
栓形成状態に応じて、１日２乃至３回の皮下注射
による1000〜25000uの投与、又は一定間隔を置
いた間欠的静脈注射又は連続的な潅注による24時
間当り1000〜25000uの投与、又は筋肉注射によ
る（一週間に３回の）1000〜25000uの投与から
なる（この力価はイン−ウエスラー単位で示す）。
これらの用量は勿論、各患者毎に予め実施した血
液分析の結果及び罹患している病気の種類及び患
者の健康状態に従つて調整する。 更に本発明は、本発明のオリゴ糖及び該オリゴ
糖を含有する画分を生物試薬の構成成分として使
用することにも係る。これらの生物試薬は、他の
物質の特にXa因子の阻害レベルでの抗凝血活性
を研究するための比較標準として実験室で使用し
得る。 同様に本発明の目的は、核医学に於ける放射性
試薬として本発明のオリゴ糖画分及びオリゴ糖を
使用することである。前記のオリゴ糖及び画分
は、この分野で常用のトレーサーの中から選択さ
れたトレーサー特にテクネチウム99mによつて標
識する。 このためには、市販品の非反応性で７価の過テ
クネチウム酸ナトリウムの形態のテクネチウム
99mを、より反応性のテクネチウムの形状である
４価の還元テクネチウムに変換する。この変換
は、錫塩（塩化第一錫）、鉄塩（硫酸第一鉄）、チ
タン塩（三塩化チタン）その他の塩から成る還元
系によつて行なわれる。 ほとんどの場合、このようにテクネチウムを単
に還元することによつて、所与のPH条件で該当分
子にテクネチウムを固定できるようになる。 所謂担体を構成する本発明の生成物は、100乃
至200IU（イン−ウエスラー）程度の用量で使用
し得る。 これらの放射性薬剤の製造では、The Journal
of Nuclear Medicine，21，No.２，117〜121に収
載のP.V.KULKARNI他の方法による処理を使用
し得る。 前記の如く標識された生成物は、血栓症及び血
栓形成状態の程度を検知且つ診断するための生体
内テストに於いて有利に使用し得る。 本発明の更に別の特徴及び利点は、図面を参照
した下記の実施例の記載から明らかになるであろ
う。 実施例 １ 次の段階を含むオリゴ糖画分の製法： −HNO₂によるヘパリンの解重合； −セフアロース−AT上のクロマトグラフ
イーによる生物学的に活性なオリゴ糖の分
離； −溶出画分のゲル過及び所望生成物の回
収。 亜硝酸存在下でのヘパリンの解重合 室温の水800mlにヘパリン（USP力価：
150IU／mg、イン−ウエスラー力価：150IU／
mg）を20ｇ溶解した。0.5M硫酸200mlを添加
し、次に亜硝酸ナトリウム13.8ｇを添加した
（硫酸の最終モル濃度；0.1M、亜硝酸塩の最終
モル濃度：0.2M）。反応に伴なつて窒素ガスが
発生した。15分後、5N水酸化ナトリウムでPH
を７〜7.2に調整して反応を止めた。解重合生
成物を７倍容（この場合７）のエタノールで
沈澱させた。沈澱を遠心分離し、アルコールで
洗浄して減圧乾燥した。 USP力価Ｏおよびイン−ウエスラー力価
7IU／mgの生成物が24.8ｇ得られた。 沈澱物の重量の見掛けの増加は、解重合生成
物と共に硫酸ナトリウムが１部沈澱したためで
ある。 セフアロース−アンチトロンビン上のクロ
マトグラフイー 得られた解重合生成物を、アンチトロンビン
を保持したセフアロースゲル上でクロマトグ
ラフイーにかけた。 セフアロース−AT200ml（セフアロース
１ml当りウシATが約10mg固定化されてい
る）を含んでいるこのカラム（直径2.6cm、高
さ40cm）は、NaCl0.2M、トリス−HCl0.05M
から成るPH7.2の緩衝液で平衡させた。 前記解重合生成物1.6ｇを0.2MのNaCl緩衝液
16mlに溶解し、この溶液を毎時50mlの速度でカ
ラムに通し、次にこのカラムを0.2MのNaCl緩
衝液500mlで洗つた。 次に、固定化ATに保持されたオリゴ糖を
全部脱着させ得る緩衝液（CaCl₂0.2M、トリス
−HCl0.05M、PH7.2）を用いて、保持されてい
るオリゴ糖をカラムから溶出させた。オリゴ糖
を含有する溶出液を回収し、10倍容のエタノー
ルによつてこれらのオリゴ糖を沈澱させた。 エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥後、
USP力価が66IU／mgでイン−ウエスラー力価
が1600IU／mgの生成物５mgを回収した。 こうして得られた生成物は、高分子量のムコ
多糖と低分子量のオリゴ糖との混合物から成つ
ていた。 ゲル過 以上のようにして得られたムコ多糖とオリゴ
糖との混合物90mgを蒸溜水２mlに溶解した。こ
の溶液を、商標セフアデツクス
（SEPHADEX）G50として市販されている極
微細粒子から形成されたゲル過カラム（高さ
1m、直径2.6cm）の頂部に載せた。このカラム
は蒸留水で平衡させておいた。流速26ml／時の
蒸溜水でカラムを展開した。溶出液を少量ずつ
（試験管１本当り６ml）回収した。206ナノメー
タのUV吸収によつて各試験管のムコ多糖含量
を評価した。 試験管の中味をプールして１〜５番までの画
分を形成した。 これらの各画分に含まれていたムコ多糖をア
ルコールで沈澱させて乾燥した。 これらの画分の重量と抗凝血特性とを次に示
す。 画分 (1) 重量 ：15mg USP力価 ：156IU／mg イン−ウエスラー力価 ：190U／mg 画分 (2) 重量 ：16mg USP力価 ：139IU／mg イン−ウエスラー力価 ：520U／mg 画分 (3) 重量 ：17mg USP力価 ：50.3IU／mg イン−ウエスラー力価 1390U／mg 画分 (4) 重量 ：40mg USP力価 ：7IU／mg イン−ウエスラー力価 ：870U／mg 画分 (5) 重量 ：１mg USP力価 ：0IU／mg イン−ウエスラー力価 ：150U／mg 以上で得られた画分の分子量の範囲特に“画分
４”と“画分５”の分子量の範囲を、ペーパーク
ロマトグラフイー及び高圧液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）の双方によつて、十糖のヘパリンを
用いて同じ実験系で得られた結果と比較して評価
した。なお、 −ペーパークロマトグラフイーでは、SILVA及
びDIETRICHの論文（M.E.SILVA及びC.P.
DIETRICH，J.Biol.Chem.，250巻（1975）、
6841〜6846ページ）に記載の標準生成物も使用
し、 −シリカゲルHPLCでは、漸増する既知の分子量
を持つ一連のポリスチレン−スルホン酸ナトリ
ウムと既知の分子量のヘパリン試料も使用し
た。 “画分４”は８個未満の糖残基、恐らく６個以
下の糖残基を有するオリゴ糖から構成されると考
えられ、“画分５”は６個未満の糖残基、恐らく
は４個以下の糖残基を有するオリゴ糖から構成さ
れると考えられる。 実施例 ２ 次の段階を含むオリゴ糖画分の製法： Ａ−ヘパリナーゼを用いた消化によるヘパリンの
解重合； Ｂ−DEAEセフアデツクスA25上のゲル過によ
る解重合混合物の分画； Ｃ−アガロース−AT上のクロマトグラフイー
による生物活性生成物の選択。 Ａ ヘパリナーゼを用いた消化によるヘパリンの
解重合 １ ヘパリナーゼの調製 Flavobacterium heparinum酵素を使用し
てヘパリンを分解した。 Flavobacterium heparinumの酵素をJ.
Biol.，Chem.，1956，223，853〜858に収載
のPayza及びKornの方法で培養した。凍結
乾燥細胞をアルミナの存在中で乾式で粉砕
し、中性PHの酢酸塩緩衝液で抽出した。 不溶分を除去し、得られた溶液をDEAE
（ジエチルアミノエチルセルロース）及び２
種のアガロース上で順次クロマトグラフイー
にかけた。アガロースは、例えば商標CMセ
フアロースCL6B及びウルトロゲル
（Ultrogel）ACA54としてそれぞれ市販され
ているものである。 この方法で、純度90％（電気泳動法で評価
した純度）及び力価30000単位／mg
〔HOVINGH他の方法（J.Biol.Chem.，245，
６，1970）により測定すると8333単位〕のヘ
パリナーゼ20mgを得た。 ２ヘパリンの解重合 治療用のヘパリン１ｇを蒸溜水50mlに溶解
した。酢酸ナトリウム１ｇと塩化カルシウム
100mgを添加した。1NのHOClを添加してPH
を7.2に調整した。 次に、上記で得られた高精製の細菌性ヘパ
リナーゼ溶液１mgを添加し、30℃で15時間混
合物をインキユベートした。100゜GLのエタ
ノール10容で沈澱後、得られた解重合生成物
を乾燥した。この生成物を以後Ｐで示す。 Ｂ “DEAEセフアデツクスA25”での分画 商標“DEAEセフアデツクスA25”として市
販されていて公知のゲル50mlを収容した直径16
mmのカラムを、0.1MのNaCl緩衝液（PH7.0）で
平衡させた。前記生成物Ｐ（180mg）をこの緩衝
液に入れた溶液20mlをカラムの頂部に載せ、
0.1MのNaCl緩衝液（PH7.0）250mlから0.5Mの
CaCl₂緩衝液（PH7.0）250mlまでの勾配で溶出
した。流速は30ml／時に調整した。10mlずつを
順次回収した。 第１図は、232nmでの光学密度を測定して描
いた溶出ダイヤフラムである。溶出液体を、第
１図に示すように光学密度の測定値に従つて画
分１、２、３、４にプールした。夫々の画分の
光学密度を次表に示す。 【表】 Ｃ アガロース−AT上での第２画分のアフイ
ニテイークロマトグラフイー ATを固定化したアガロース（アガロース
−AT）50mlを収容した直径2.5cmのカラム
を、0.1MNaCl、トリス−HCl0.025M（PH7.4）
で兵衡化した。 表１の画分番号２（P2）60mgを前記緩衝液６
mlに溶解し、この溶液をカラムの頂部に載せ
た。以下の溶液を順次溶出剤に用いて溶出を実
施した。 使用した最初の溶出剤は前記の溶出剤と同じ
溶出剤であつた（これにより、232nmで検出さ
れた第１の光学密度ピークに含まれていた生成
物P2(B)50mgを含む溶出液を分離した）。 溶出剤を0.2MNaCl、0.05Mとトリス−HCl
（PH7.4）に変えると、ゲルから活性の画分は全
く脱着しなかつた。 次に溶出剤として2MのCaCl₂を使用して１
個のピークを得た。このピークを示す画分を含
む溶出液をアルコールで沈澱させると本発明の
高活性画分（生成物Ｐ２(A)とする）が５mg得ら
れた。 この最後の画分の物理的及び生物学的特性を
次に示す。 イン−ウエスラー力価：1400単位／mg 〔α〕²⁰ _D＝＋24（ｃ＝１、水） 光学密度OD^235nm _HCl0.03N＝4.5 P2(A)画分の分析結果を次に示す。 1° 化学分析 P2(A)の構成成分を下記の如く定量した。 −ウロン酸に関してはT.Bitter他の方法
（Anal.Biochem.，４，（1962）、330〜334）
を実施した。 −ヘキソサミンに関しては、一方でC.A.
Antonopoulos他（Biochem.Biophys.
Acta，83，（1964）１−19）により修正さ
れたElson−Morganの方法を（窒素雰囲
気中110℃で6NのHClによる４時間のP2(A)
の加水分解後）、他方ではR.L.Smith及び
〔．Gilkersonの方法（Anal.Biochem.，
98，（1979）、478−480）をP2(A)の加水分
解サンプル又は未加水分解サンプルに対し
て実施した。 −スルフエートに関しては、T.T.Terho他
の方法（Anal.Biochem.，41，（1971）、
471〜476）を用いた。 組成に関する結果を下記の表に要約す
る。表の第１桁は重量％で示し、第２行は
Smith及びGilkersonの方法による加水分解
後のグルコサミン単位（H⁺）に対するモル
比で示す。 【表】 これらの結果より本発明のオリゴ糖が主と
して −ヘキソサミン１モル当りウロン酸１モル、 −（１個のウロン酸単位と１個のヘキソサミ
ン単位とを含む）二糖残基１モル当りスル
フエーと1.4モル −Ｎ−アセチルグルコサミン単位１個当りＮ
−スルフエートグルコサミン単位２個 を含むことが分かる。 2゜ 高圧液体クロマトグラフイ P2(A)0.5mg/mlの溶液50μlを、0.02Mの
Na₂SO₄で一連のカラムを通して溶出した
（１ml／分）。第１及び第２カラム（250×4.6
cm）はそれぞれ、商標リクロホスフアー
（LICHROPHOSPHER）Si100として市販
のシリカを収容しており、第３カラム（250
×３cm）には商標マイクロボンダゲル
（micro−BONDAGEL）としてWaters and
Associatesより市販の材料を充填した。本発
明の画分の分子量は、既知の分子量（夫々、
4000、6500、16000及び31000）の標準ポリス
チレン−スルホネート及び700〜900の既知分
子量を持つ四糖の溶出時間（すなわちカラム
での保持時間）と分子量に対応する対数値と
の直線関数関係に基づいて概算した。測定は
スペクトラフイジクス
（SPECTRAPHYSICS）3500クロマトグラ
フを用いて実施し、画分の検出にはUV分光
測光（200mμ及び230mμ）を用いた。 このアツセイと、A.Linker及びP.
Hovingh，Biochem.，11巻、４号、1972、
563〜567ページによる他の化学的アツセイに
より、本発明の活性オリゴ糖が８個以下、さ
らには８個未満の糖残基を含有することが確
認された。 3゜ 紫外線吸収 215〜260nmのUV帯内でP2(A)の100γ／ml
溶液に対するUV吸収を測定した。230〜
235nmに最大の吸収ピークが観察された。 実施例 ３ 次の段階を含むオリゴ糖画分の製法： ヘパリンの酵素的解重合； セフアロース−AT上でのクロマトグラフ
イーによる生物活性生成物の選択； 溶出画分のゲル濾過及び所望生成物の回収。 ヘパリンの酵素的解重合 治療用ヘパリン２ｇを酢酸塩緩衝液
（NaOAc0.15M、NaCl0.15M、CaCl₂0.005M、
PH6.9）100mlに溶解した。 この溶液を24時間30℃に保温した。 前記の方法で得られた高精製ヘパリナーゼを
下記の如く溶液に添加した。 ｔ＝０の時点で0.4mg（蛋白質量基準） ｔ＝＋８時間の時点で0.2mg ｔ＝＋24時間の時点で0.2mg ｔ＝＋36時間の時点でもう一度ヘパリナーゼ
を添加しても232nmでの光学密度は増加しなか
つた。反応が終了したと考えてアルコール沈澱
により生成物を回収して乾燥した（収率90重量
％）。 解重合生成物のセフアロースAT上でのア
フイニテイークロマトグラフイー セフアロース１ml当り固定化AT10mlを含
むクロマトグラフイーカラム（５×18cm）を
NaCl0.1M、トリス−HCl0.05M、PH7.5の緩衝
液で平衡化した。 ヘパリンの解重合生成物２ｇをカラムの頂部
に載せた。 前記緩衝液でカラムを洗つて非固定画分を除
去した（対応する物質を以後UPで示す）。 次に、固定生成物を（FPで示す）をPH7.2の
CaCl₂1M溶液で溶出した。 生成物をアルコール沈澱させ、遠心分離によ
つて回収した。一方でUP1.6ｇを回収し、他方
で800iu／mg（イン−ウエスラー）のFP8mgを
回収する。 ゲル過 UP及びFPを別々にゲル過処理した。すな
わち、各生成物25mgをセフアデツクス
G50Super fineのゲルのカラム（200×0.6cm）
で過した。 NaCl0.2M溶液で溶出する画分0.65mlを回収
した。セフアデツクスG25上で塩を除去し、生
成物を凍結乾燥した。第２図はUP画分の溶出
ダイアグラム（実線）及びFP画分の溶出ダイ
ヤグラム（点線）である。230nm（ヘパリナー
ゼにより形成される二重結合の吸収波長）での
光学密度の測定によつて溶出を調整・制御し
た。 光学密度の測定によつて、UP画分を二糖、
四糖、六糖及び八糖（UP₂，UP₄，UP₆及び
UP₈）と、より高い重合度を有する他の生成物
UP₊₈とに分画した。UP₈及びUP₊₈は第２図の
溶出曲線に表われない。これは、割合が余りに
も少なく（夫々、3.4及び1.3％）、高感度でな
ければ検出されないからである。 FP画分を更に溶出容量の減少する順にFPa，
ｂ，ｃ，ｄと指称する４つの画分に分離した。
FP画分の大半はUP画分の少し前に溶出してい
る。 UP画分及びFP画分の夫々に関する結果を後
掲の表に示す。 これらの結果には下記の要素が含まれる： UP画分とFP画分に由来する前記の各画分の
溶出量（ml）；UP画分及びFP画分の夫々の混
合物中の前記の各画分の割合（％）；前記の各
画分の比旋光度（通常１％水溶液中で電子偏光
計によつて測定）；230nmでの吸光度
（HCl0.03M中の0.01％溶液中で測定、結果は
１／1000溶液の光学密度で示す）；前記のイン
−ウエスラーテストによつて測定したFP画分
のヒト血漿中での抗Xa活性。 【表】 【表】 この表に示した結果より、FP画分の各画分が
抗凝血活性を有しており、最大の生物活性は画分
FPaが有することが分かる。この画分はFP混合
物の50乃至60％を占める。 画分FPaの構造を解明するために画分FPaにさ
まざまな処理を実施した。下記の如く分析結果が
得られた。 −亜硝酸処理によるFPaの分解 ゲル過後に回収された画分FPaを、オリゴ糖
鎖を分解し得る条件下水性媒体中でHNO₂と共に
インキユベートした。これは、Biochemistry，
1976，15，3932−3942に収載のShiveley及び
Conradの方法で実施した。 HNO₂の作用下でオリゴ糖鎖はＮ−スルフエー
ト化グルコサミン残基の後で切断されて二糖及び
四糖に断片化される。前記の残基は２，５−無水
マンノース基に転化する。 こうして得られた二糖及び四糖をセフアデツク
スG50上のクロマトグラフイーで分離した（200
×0.5cm、NaCl0.2M）。 溶出ダイヤグラムを第３図に示す。 これらの各画分に対して下記の測定を行なつ
た：230nmでの光学密度（曲線ａ）、ウロン酸の
量（曲線ｂ）、２，５−無水マンノースの量（曲
線ｃ）、（酸加水分解前後の）グルコサミンの量、
HNO₂による分解以前に被分析生成物をトリチウ
ム化しておいたときの放射能。 これらの画分の光学密度の測定によつて、光学
密度の90％が二糖類断片のピークに現われ、10％
が四糖類断片のピークに現われるので、不飽和分
子の大半は二糖類であることが判明した。 このことから、四糖単位は二重結合を持つたウ
ロン酸残基を含有しないと考えることができる。
このような残基は、Ｎ−スルフエートグルコサミ
ンも含有する二糖の一部を成し、この二糖GH
は、亜硝酸分解前にはオリゴ糖の非還元末端に位
置している。 更に、これらの画分内の２，５−無水マンノー
ス残基を定量すると（第３図の曲線ｃ）、２，５
−無水マンノース基の33％が四糖類断片中に存在
し、66％が二糖類断片中に存在することが判明す
る。オリゴ糖鎖がＮ−スルフエート−グルコサミ
ン残基で終結すると仮定すると、これらの結果よ
り、画分FPaは四糖鎖１個当り二糖鎖２個を含む
と結論し得る（第３図の曲線ｂ参照）。これらの
結果は、Annual.Biochem.，1962，４，330−334
に収載のBitter及びMuirによるウロン酸の定量
（曲線ｂ）及びFPa画分より得られた分解生成物
中のグルコサミン残基の定量によつて確認した。
すなわち、これらの分解生成物は四糖分子の２倍
の数の二糖分子を含む。 −水素化硼素ナトリウムによる画分FPaの還元後
の亜硝酸分解 亜硝酸分解以前に画分FPaを還元すると、鎖の
還元末端は亜硝酸分解中に２，５−無水マンノー
ス残基に転化しない。PH9.5の水素化硼素ナトリ
ウム緩衝液で還元を実施する。このときにオリゴ
糖鎖FPaの還元末端はトリチウム化ヘキシトール
に転化する。セフアデツクスG25上の過によ
り、混合物中に存在する塩から還元生成物を分離
する。次に、亜硝酸による分解処理を実施し、引
続いて前記の如きゲル過を実施する。２，５−
無水マンノース残基の定量により、二糖類画分中
ではこの残基の明らかな減少が観察されるが、四
糖類画分は事実上不変である。 トリチウム化した水素化硼素化物により還元す
ると、放射能の70〜80％が二糖類中に認められ、
20〜30％が四糖類中に認められる。さらに、この
処理後、２，５−無水マンノースの量は、四糖類
ピーク中よりも二糖類ピーク中で遥かに多く減少
していることが観察された。このような結果は、
還元末端の二糖類断片の存在割合が分子の70％
で、四糖類が30％であることを示す。 −非常に温和な条件下での亜硝酸による画分FPa
の分解 非常に温和な条件下でも画分FPaを亜硝酸分解
処理した。 すなわち、ゲル過及びアフイニテイークロマ
トグラフイーの後に、配列ABCDEF及び
CDEFGH（この配列もまた本発明の一部を構成す
る）を有する２個の六糖を主として含むオリゴ糖
画分を得ることが可能であつた。 この方法では、CIFONELLI及びKINGにより
記載の方法（Carbohydrate Res.，1972，21，
173−186）でFPa画分に亜硝酸を作用させたが、
１〜５分後、好ましくは３分後に反応を停止した
点はCIFONELLIの方法と異なる。得られた断片
からセフアデツクスG25上のゲル過によつて塩
を除去し、前記条件でアフイニテイークロマトグ
ラフイーにかけた。 画分FPaを研究するための前記の分析方法によ
り溶出画分の中に主要な２種即ちCDEFGHおよ
びABCDEFが存在することが判明した。これら
の画分は抗Xa活性（イン−ウエスラー）を維持
していた。 −NMRによる八糖画分の定性 八糖画分を単離した。この画分のイン−ウエス
ラー力価は2000IU／mg及びAPTT力価は4IU／
mgであつた。 この生成物の13CNMRスペクトルを第５図に
示す。これにより生成物が八糖類であることが確
認される。また、この生成物が配列
ABCDEFGHで示される構造を有することも確
認される。 観察されたシグナルは夫々次のものの特徴であ
る。 −上記構造の種々の残基（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆ，Ｇ及びＨ）の１位のアノマー炭素（各残基
が同定できるように図中の約90〜105ppmの各
ピークに各残基名を示す）、 −約60及び約70ppmに於ける６位の炭素（記号
C₆）及びグルコサミン残基の２位の炭素（記
号C₂）（55〜60ppm）、及び、 −Ｄに於ける基−NHAcのCH₃（約25ppm）。 更に、Ｎ−スルフエート−アミノ−グルコサミ
ン残基のＣ−２領域に新しい共鳴シグナル（記号
^＊）の存在が観察される。このシグナルは、常用
ヘパリンを同様の条件で処理して得られるNMR
スペクトルのいかなる共鳴シグナルとも一致しな
い。 実施例 ４ −抗Xa因子活性をもつ六糖画分の単離 別の一連の試験では、アフイニテイークロマト
グラフイー段階後に得られた混合物（80mg）を、
Sephadex G50 Superfineゲルのカラム（200×
2.5cm）でクロマトグラフイーにかけた。 0.2M塩化ナトリウムで溶出した。生成物は
230nmでのUV吸収によつて検出した（第４図参
照）。 生成物の大半部が八糖領域で溶出し、これは前
記の生成物と同じ性質を示した。 六糖画分を合せて塩を除去した。得られた生成
物を凍結乾燥した。収量は２mgであつた。 この化合物はイン−ウエスラーテストで
510IU／mgという高い活性を有していた。APTT
力価は3IU／mgである。 この六糖画分はヘパリナーゼによる分解後に得
られるので、八糖画分の特徴的な残基Ａ及びＨを
含有している。更に、この生成物はATに対す
る親和力を有しているので、四糖配列CDEFを含
有する筈である。従つて、構造ABCDEFで示す
ことができる。 しかし乍ら、この材料中には構造CDEFGHを
有する生成物も微量で存在し得る。ここで、Ｃは
不飽和ヘキサウロン酸残基（２位のOH基はスル
フエート化されていてもいなくてもよい）であ
る。 前記の八糖類の場合と同様にしてこの六糖画分
の分析試験（即ち亜硝酸による分解と断片の検
査）を実施すると、ABCDEFとCDEFGHとの両
者の存在が判明する。 実施例 ５ −八糖ABCDEFGHの分解及び得られたオリゴ
糖 １ Carbohydrate Research 62，235−244、
1979に収載のL.A.Franssonの方法を用い、PH
７の燐酸塩媒体中で過ヨウ素酸ナトリウムによ
る八糖ABCDEFGHの酸化反応を37℃で約14
時間実施する。 次に水酸化ナトリウムを添加してPHを11−12
に上昇させてアルカリ加水分解を生起し、その
後、反応混合物を室温に30分放置した後中和す
る。構造FGHに対応すると思われる三糖をセ
フアデツクスG50上でのクロマトグラフイーに
よつて分離する。 イン−ウエスラーテストによつて抗Xa活性
を試験すると、アツセイによつて約100〜
200IU／mgの活性が証明された。 ２ Flavobacterium heparinumから抽出した精
製ヘパリナーゼを前記の八糖に作用させる。実
験の処理条件、特にPH、温度、継続時間は実施
例２の酵素分解で使用した条件と同様である。 実施例２と同様にしてセフアデツクスＧ−50
ゲル上で過し、解重合混合物から２種の四糖
類を回収する。これらは構造EFGH及び
ABCDで示すことができる。 これらの四糖類をセフアロース−ATカラ
ムに通すと、EFGHが保持され、ABCDが除
去される。次に1MのNaCl溶液で溶出して
EFGHを回収する。いろいろなアツセイで測定
したイン−ウエスラー活性は、約100〜
200IU／mgである。 ３ 八糖ABCDEFGHを温和な亜硝酸分解にか
ける。 溶液１ml当り八糖１mgを使用する。Ｎ／1000
の亜硝酸ナトリウムとHClとを添加して（濃度
約1mMの）亜硝酸をその場で生成する。 PHを３に調整する。 10分後、周囲温度にてPHを７調整する。 先行実施例に記載の条件で、反応混合物をゲ
ル過にかけ、次にアフイニテイークロマトグ
ラフイーを実施する。NaCl1M又はCaCl₂1M
の溶液で溶出して、六糖構造CDEFGHで示さ
れる生成物を回収することができる。 この六糖類に、人の腎臓から抽出したα−Ｌ
−イズロニダーゼを作用させる。この酵素分解
段階は37℃でPHを７として実施する。 セフアデツクスG50カラムで解重合混合物を
過し、五糖構造DEFGHで示されるオリゴ糖
を単離する。テストの結果、この生成物のイン
−ウエスラー抗Xa活性は400IU／mg以上と考
えられる。 実施例 ６ −実施例１で得られたオリゴ糖画分のNMRによ
る定性 この画分のNMRスペクトル ¹³Cはグルコサミ
ン残基のＣ−２領域に前記シグナル^*が存在する
ことを示す（第６図参照）。このシグナルは、Ｎ
−スルフエート化され、かつ３位が基−OSO^- ₃
で置換されたグルコサミン単位を示すと考えられ
る。 このグルコサミン残基は６位にスルフエートを
含む場合もあり含まない場合もある。 更に、積分曲線によつて、この生成物は平均し
て８個未満の残基を有しており、大半が六糖類及
び八糖類からなることが確認される。 牛の肺から抽出したヘパリンを調整下に分解
し、前記の如きアフイニテイークロマトグラフイ
ー及びゲル過を実施して、構造ABCFGHGH
を有する八糖を単離し得る。この生成物は抗Xa
アツセイに於いて高度に活性である。 同様に微量の六糖ABCFGHが抽出される。こ
れもまた抗Xaアツセイで活性である。 本発明の範囲は勿論、ヘパリン又はヘパリン化
合物を別の解重合方法で処理した後イン−ウエス
ラーテストで測定可能な抗凝血活性を有する低分
子量のオリゴ糖を回収して得られるオリゴ糖に及
ぶ。 ヘパリン又は類縁化合物の別の解重合方法の例
として、過ヨウ素酸酸化を挙げることができる。
更に、化学的方法によるヘパリン又はヘパリンエ
ステルのα，β−脱離反応を生起して同様の結果
を得る方法、又は、下記の段階を含む方法が挙げ
られる。 −セフアロースゲルに固定化されたATと原料
のヘパリン画分とを接触させて、ヘパリン画分
のATに結合し得る成分を固定し、 −固定されたヘパリン成分をヘパリナーゼ特に細
菌起源ヘパリナーゼにより消化し、 −ATに結合する断片をゲルから溶出し、場合
によつて前述の処理にかける。