JP2001240607A - ヘパリン解重合法、解重合ヘパリン、その誘導体および医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ヘパリン解重合法、この解重合法
によって得られる新規な解重合ヘパリンおよびそのアミ
ド化誘導体に関する。また、本発明は、解重合ヘパリン
およびそのアミド化誘導体を有効成分とする医薬組成物
に関する。 【解決手段】 還元性金属および金属酸化物を用いるこ
とを特徴とするヘパリンの解重合方法、およびこの工程
を含むヘパリンの解重合方法、この解重合方法によって
得られた解重合ヘパリン、さらにアミド化された解重合
ヘパリン、これらの解重合ヘパリンまたはアミド化解重
合ヘパリン誘導体を含む、抗血液凝固剤、腎疾患治療
剤、血小板凝集抑制剤、ラジカルスカベンジャー剤、メ
サンギウム細胞増殖抑制剤および補体活性抑制剤を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘパリン解重合
法、この解重合法によって得られる新規な解重合ヘパリ
ンおよびそのアミド化誘導体に関する。また、本発明
は、解重合ヘパリンおよびそのアミド化誘導体を有効成
分とする医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヘパ
リン(ＨＥ)は主として肥満細胞内の顆粒中に存在する平
均分子量１５０００〜２００００の酸性ムコ多糖類の硫
酸エステルである。ヘパリンは血漿中のアンチトロンビ
ンIII(以下、ＡＴIIIと称す)と結合することにより、Ｘ
a因子との結合能が増強し、Ｘa因子を阻害する。また、
プロトロンビンからトロンビンへの変換を抑制するため
に強い抗凝固活性を有している。

【０００３】ゆえに、現在臨床においては汎発性血管内
血液凝固症候群(DIC)の治療、種々の血栓塞栓症(静脈血
栓症、心筋梗塞症、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動脈血栓
塞栓症、術中・術後の血栓塞栓症など)の治療および予防
のほか、血液透析・人工心肺などの体外循環装置使用時
や血管カテーテル挿入時または輸血および血液検査の際
などにおける血液凝固の防止に用いられている。

【０００４】しかし、ヘパリンは出血誘発作用(抗IIa作
用)も併せ持つことから、血液凝固時間の延長に伴い出
血傾向も顕著となることが危惧される。そのため、出血
性病変を有する症例や、術直後の透析患者に対しては局
所ヘパリン化法あるいは減ヘパリン化法などの手段によ
り、これを防ぐ工夫が試みられているが、安全性、簡便
性等に問題がある。

【０００５】また、近年、透析療法の発達・透析対象患
者の増大・透析療法の長期化等に伴い、血小板機能の活
性化、血小板減少症、血管壁のリポ蛋白リパーゼの遊離
促進による中性脂質分解作用、カルシウムとの親和性に
基づく骨粗鬆化等の副作用が報告されている。さらに、
ヘパリンの血中半減期は約６０分であるため、体外循環
装置使用時の血液凝固防止剤として投与する場合には、
過量のヘパリンが血中に残存するという問題点がある。
また、血液透析は通常４〜５時間を要することから、適
正な血中ヘパリン濃度の維持に注意を払う必要があり、
血中からヘパリンが消失するのを防ぐために、透析中に
ヘパリンを補給ないしは持続投与しなければならないと
いう煩雑さがあった。

【０００６】血液体外循環時の灌流血液の凝固防止やDI
Cの治療には、メシル酸ガベキサートやメシル酸ナファ
モスタットなどの蛋白分解酵素阻害剤も用いられている
が、これらの薬剤は、代謝産物であるグアニジン化合物
によって消化器障害が発現する。さらに、分子量が小さ
くダイアライザーから透析除去されるため、回路内凝
血、特にダイアライザー後の静脈側ドリップチャンバー
内で凝血が発生する。

【０００７】以上のように、上記のヘパリンおよびメシ
ル酸ナファモスタットをはじめとする薬剤は、出血傾向
の増大という重篤な副作用が発現する恐れがある。しか
しながら、特に血液透析・人工心肺などの体外循環装置
使用時の血液凝固防止には欠かせない薬剤であり、また
代替すべき適当な他の薬物もないことから、ある程度の
危険性を承知の上で使用せざるを得ないのが現状であっ
た。

【０００８】ヘパリンには前述の抗凝固活性の他に、リ
ポ蛋白リパーゼ活性化作用、抗血小板凝集作用、血圧低
下作用、抗補体作用および癌転移抑制作用などの多くの
生理活性を有することが知られている。しかしながら、
抗凝固活性に伴う出血傾向があまりに強いため、抗凝固
目的以外に用いることはできなかった。

【０００９】ヘパリンのもつ生物活性は、下記のヘパリ
ンの基本となる５つの糖(化１)に左右されており、特に
ヘパリンの基本５糖構造中の硫酸基と様々な生物活性
は、よく調べられている。例えば、下記の３−Ｏ−硫酸
はＡＴIII結合性の５糖のみに存在し、３および５のＮ
−硫酸、１の６−Ｏ−硫酸とともにＡＴIIIに結合する
ために必須である。また、４の２−Ｏ−硫酸、５の６−
Ｏ−硫酸は、ＡＴIIIとの結合に絶対必要とは言えない
が、最大活性発現には重要である。また、Ｃa²⁺結合活
性はＯ−硫酸の存在にかかわらず、Ｎ−硫酸基に依存
し、抗細胞増殖活性は、分子サイズと電荷(ＳＯ₄ ^2-)に
依存している。さらにヘパリンコファクターIIにおける
トロンビン阻害活性の強さは、結合硫酸の置換位置に関
係なく、結合硫酸の総量に依存するものと考えられる。

【００１０】

【化１】

【００１１】ヘパリンは、グリコサミノグリカンの一種
であり、アミノ糖(ヘキソサミン)であるD-グルコサミン
およびウロン酸であるD-グルクロン酸またはL-イズロン
酸から成っている。多くのグルコサミン残基は、Ｎ−ア
セチル化ではなくＮ−硫酸化されている割合が多い。し
かも単一のヘパリン鎖中でも硫酸基の割合にかなりの変
動がある。ヘパリンの繰り返し単位はβ(１→４)結合で
あり、D-グルコサミンにD-グルクロン酸(あるいはL-イ
ズロン酸)が、結合したものからなる。

【００１２】上記に示した硫酸基、ウロン酸あるいはヘ
キソサミンはヘパリンが有する様々な生物活性に影響を
与える因子として重要であり、中でも硫酸基の割合、残
存硫酸基の位置は、抗凝血活性や癌転移抑制作用に関与
しているものとして報告がある(J. Riesenfeld, et al.
; J. Biol. Chem., 256, 2389, 1981、U. Lindahl, et
al. ; J. Biol. Chem., 258, 9826, 1983、T. Irimura,
et al. ; Biochemistry, 25, 5322, 1986)。

【００１３】近年、ヘパリンの解重合により得られる平
均分子量約５,０００ダルトンの低分子量分画である低
分子ヘパリンに、血液凝固第Ｘa因子に対する阻害活性
と活性化部分トロンボプラスチン時間に対する延長作用
の比(抗Ｘa活性／ＡＰＴＴ)の増大が確認され、出血傾
向が比較的少ない薬剤として使用されつつある。現在ま
でにヘパリンを亜硝酸分解して得られた低分子ヘパリン
のナトリウム塩であるダルテパリンナトリウム、および
過酸化水素による解重合で得られた低分子ヘパリンのナ
トリウム塩であるパルナパリンナトリウムが上市されて
いる。

【００１４】低分子量ヘパリンの一般的特徴としては、
１)抗血栓作用(抗Ｘa活性)／出血誘発作用(抗IIa活性)
の比率が高く、出血の危険性が少ない。２)血中半減期
が長い(持続投与をせずに単回投与でよい)。３)脂質代
謝・血小板に対する影響が少ない。４)血漿蛋白により
中和される程度が低い。５)皮下注射時のバイオアベイ
ラビリティーが高い等、その他様々な生理活性を有して
いる。

【００１５】本発明者らは、ヘパリンや低分子ヘパリン
が有する優れた薬理作用を損なうことなく、該ヘパリン
類特有の副作用を克服すべく鋭意研究した結果、平均分
子量８,５００〜９,５００を有する中分子ヘパリン画分
およびそのアミノ酸誘導体が、その目的に沿った性質を
備えていることを見い出した(特願平８−３６６９３
号)。

【００１６】上記のような低分子ヘパリンや中分子ヘパ
リンなどの分画ヘパリン類を得るには、１)ヘパリンか
らの抽出、２)化学的合成、３)ヘパリンの解重合(分解)
などの方法が知られている。しかしながら、１)の抽出
法は生産効率が悪く、特に低分子ヘパリン画分はヘパリ
ン全体の僅か数％しか存在しないため実用的ではない。
２)の化学的合成法も収率は低く、製造コストが高い。
ゆえに、現在では、３)のヘパリンの解重合によって分
画ヘパリンを取得する方法が主流となっている。

【００１７】ヘパリンの解重合方法にはこれまでに、亜
硝酸分解法、過酸化物分解法、酵素(ヘパリナーゼ)分解
法が知られており(E. Holmer, ed. by D. A. Lane, U.
Lindahl, Arnold London, 1989, 575、C. P. Dietriche
t al. ; Academic Press, New York, 1980, 317)、これ
らの方法でヘパリンを解重合した後、濾過クロマトグラ
フィーなどの手段を用いて目的の分子量を有する分画ヘ
パリンを調製するのが一般的である。

【００１８】このように、分画ヘパリンは、ヘパリンの
解重合(分解)によって得ることができ、分画ヘパリンの
薬理活性は、低分子ヘパリンとヘパリンとの間には、硫
酸含量や基本構造には、あまり差が見られないものの
(J. I. Nielsen, et al. ; Ostergaard, Acta chir. Sc
and. Suppl., 543, 52, 1988)、分子量、解重合方法の
違いや解重合により得られたヘパリンの末端化学構造の
違いによって異なり、数種の低分子ヘパリンが上市され
ている。

【００１９】解重合方法には上記のような種々の手段が
あり、その反応機構も様々である。そのため、ヘパリン
を解重合して分画ヘパリンを取得するという目的は同一
であっても、使用する試薬や反応条件如何によってその
分画ヘパリンの分子量や開裂した部位の末端構造は影響
を受けて異なり、薬理活性(アンチトロンビンIII親和性
等)や臨床使用時の抗凝固能等にも大きな差となって現
れることになる。

【００２０】今までに知られているヘパリンの解重合反
応は、いずれの手段も何らかの不都合が存在するのが実
状である。すなわち、亜硝酸を使用した解重合方法にお
いては(特公昭６３−４４７６４、特公平２−３１０８
１)、温度、pＨ等が正確に制御されなければならず、酢
酸ナトリウム等のアルカリ性薬品で反応を停止させるこ
とが必要である。また、多数の汚染物、特に未反応の亜
硝酸により生じた亜硝酸塩および硝酸塩を含有する解重
合混合物が生成する。従って、治療に使用する前に補助
段階を付加し、精製しなければならない。過酸化水素等
の過酸化物を使用した解重合方法においては(特公平４
−４２４０１)、オートクレーブを用いて約１〜２気圧
の圧力下で加熱しなければならず操作が極めて危険かつ
煩雑である。

【００２１】ヘパリナーゼ等の酵素を使用した解重合方
法においては(特公平２−３１７２１)、酵素の安定性、
基質の分解温度のコントロール等の問題がある。これら
の改良法も散見されるが、いずれも操作がさらに煩雑と
なり、大量生産には適していない。また、いずれの方法
においても、反応終了を自在にコントロールするのが困
難であり、結果的に幅広い分子量分布となることから、
目的の分子量を有する分画ヘパリンを選択的に製造する
ことができなかった。

【００２２】ゆえに、操作が簡便であり、常温・常圧で
反応し、かつ反応を任意に停止させることができる解重
合方法が望まれており、さらに、生成した分画ヘパリン
がヘパリンよりも優れた活性を有する物質であることが
必要であった。

【００２３】本発明者らは、出血傾向等の副作用の少な
い抗凝固剤およびそれを得るための方法について検討し
た結果、ヘパリンが有する副作用を減少させ、かつヘパ
リンと同等あるいはそれ以上の生物活性を有する、中分
子ヘパリンおよび中分子ヘパリン誘導体を得るために、
新規合成方法を開発した。本発明の方法によれば、ヘパ
リンの低分子化の割合を反応時間あるいは試薬の量によ
って制御できる。

【００２４】

【課題を解決するための手段】本発明の第１は還元性金
属および金属酸化物を用いることを特徴とするヘパリン
の解重合方法である。

【００２５】より具体的には、ヘパリンをリン酸緩衝液
に溶解し、これに還元性金属および金属酸化物を加え、
激しく攪拌した後、脱塩することにより時間依存的に効
率よく特定の平均分子量を有する分画ヘパリンを得るこ
とができる。この反応によれば、反応時間により効率よ
く目的の分子量を有する解重合ヘパリンを高い収率で得
ることができる。

【００２６】本発明のヘパリン解重合方法は、(１)ヘパ
リンを約ｐＨ６〜８の緩衝液に溶解し、ついで、(２)該
溶解液に還元性金属および金属酸化物を添加した後、反
応液を処理する工程を含む。試薬の量にかかわらず、経
時的的に低分子化されるが、強いていえばヘパリン、還
元性金属および金属酸化物の重量比は、ヘパリン：還元
性金属：金属酸化物＝１：０.０１〜１：０.００５〜５
である。

【００２７】さらに、上記工程(２)の後に、反応液を
(ａ)約ｐＨ３〜５.５に調製し、(ｂ)臭化ヘキサデシル
トリメチルアンモニウムを添加する工程、および(ｃ)ヨ
ウ化ナトリウムのエタノール溶液を添加する工程を含む
ことができる。

【００２８】本発明の第２は、本発明の方法によって得
られ、紫外吸収スペクトルにて２５０ｎｍ〜３３０ｎｍ
の間に吸収を示す解重合ヘパリンである。

【００２９】得られた解重合ヘパリンは平均分子量が約
２,０００〜１３,０００ダルトンの範囲にあり、大部分
は約５,０００〜１０,０００ダルトンの解重合中分子ヘ
パリンである。

【００３０】本発明の第３は(１)紫外吸収スペクトルに
て２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの間に吸収を示し、(２)硫酸
基含量が２０〜４０％、(３)ウロン酸含量が２０〜４５
％、(４)ヘキソサミン含量が１０〜５０％である解重合
ヘパリンである。

【００３１】本発明の第４は、得られた解重合ヘパリン
をアミン化合物を用いてアミド化する、アミド化解重合
ヘパリンの製造方法である。用いられるアミン化合物は
好ましくは第１級アミンである。

【００３２】本発明のアミド化解重合ヘパリンは、(１)
本発明によって得られた解重合ヘパリンを約ｐＨ２〜６
の緩衝液に溶解する工程、(２)アミン化合物を添加する
工程、(３)１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロ
ピル)カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)を添加する工程を
含む。

【００３３】さらに、上記工程(３)後に、さらに(ａ)臭
化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを添加する工
程、(ｂ)ヨウ化ナトリウムのエタノール溶液を添加、
(ｃ)アルカリ化剤を添加する工程、および(ｄ)約ｐＨ３
〜６.５に調整する工程をこの順序で含むことができ
る。

【００３４】本発明の第５は、本発明の方法によって得
られ、平均分子量が約２,０００〜１８,０００ダルトン
である、アミド化解重合ヘパリンである。大部分は約
５,０００〜１５,０００ダルトンのアミド化解重合中分
子ヘパリンである。また、アミド化解重合ヘパリンは、
(１)硫酸基含量が２０〜４０％、(２)ウロン酸含量が２
０〜４５％、(３)ヘキソサミン含量が５〜５０％であ
る。

【００３５】さらに、これらの解重合ヘパリンおよびア
ミド化解重合ヘパリン誘導体化した化合物が医薬品とし
て有用であることも見いだした。特に、本発明の実施例
で得られたＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳの誘導体
は、平均分子量が約７０００〜１２０００であるので、
低分子ヘパリンのようにダイアライザーから漏出する恐
れがなく有用である。また、本来ヘパリンが有している
各種の生理活性を損なうことなく、出血傾向を軽減する
ことができるため、従来、重篤な副作用ゆえに適用でき
なかった種々の疾病に対しても有効に使用することがで
きる。

【００３６】すなわち、本発明の第６は、得られた解重
合ヘパリンまたはアミド化解重合ヘパリンを含む医薬組
成物であり、具体的には抗凝固剤、腎疾患治療剤、血小
板凝集阻害剤、ラジカルスカベンジャー剤、メサンギウ
ム細胞増殖抑制剤または補体活性抑制剤である。

【００３７】本明細書で用いられているヘパリンまたは
アミド化ヘパリン誘導体の略号を以下に示す。 ＨＥ：ヘパリン ＦＳまたは−ＦＳ：本発明で得られた新規ヘパリンまた
はアミド化ヘパリン誘導体であることを示す接頭語また
は接尾語 ＭＨＥ−ＦＳ：中分子ヘパリン ＦＳＦ：中分子ヘパリニルフェニルアラニン ＦＳＲ：中分子ヘパリニルアルギニン ＦＳＤ：中分子ヘパリニルアスパラギン酸 ＦＳＭ：中分子ヘパリニルメチオニン ＦＳＳ：中分子ヘパリニルセリン ＦＳＢＣ：中分子ヘパリニルベンジル-L-システイン ＦＳＡＭＣ：中分子ヘパリニル-２-アミノ-４-メチルチ
オフェン-３-カルボン酸 ＦＳＢＣＫ：中分子ヘパリニルベンジロキシカルボニル
-L-リジン ＦＳＰＡ：中分子ヘパリニル-L-フェニルアラニノール ＦＳＰＥＡ：中分子ヘパリニル-R-フェニルエチルアミ
ン ＦＳＬＰＧ：中分子ヘパリニル-L-フェニルグリシン ＦＳＤＰＧ：中分子ヘパリニル-D-フェニルグリシン ＦＳＴＲ：中分子ヘパリニルタウリン

【００３８】抗凝固剤として好ましいアミド化解重合ヘ
パリン誘導体としては、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳ
ＰＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＰＥＡおよびＦＳＤＰＧであ
る。

【００３９】腎疾患治療剤として好ましいアミド化解重
合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳＤＰＧおよび
ＦＳＬＰＧである。

【００４０】血小板凝集阻害剤として好ましいアミド化
解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳＢＣ、Ｆ
ＳＢＣＫ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＬＰＧである。

【００４１】ラジカルスカベンジャー剤として好ましい
アミド化解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳ
Ｒ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＢＣ、ＦＳＡＭＣ、
ＦＳＢＣＫ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳ
ＤＰＧおよびＦＳＴＲである。

【００４２】メサンギウム細胞増殖抑制剤として好まし
いアミド化解重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、Ｆ
ＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧである。

【００４３】補体活性抑制剤として好ましいアミド化解
重合ヘパリン誘導体としては、ＦＳＦ、ＦＳＢＣＫ、Ｆ
ＳＢＣ、ＦＳＭ、ＦＳＴＲ、ＦＳＤ、ＦＳＬＰＧおよび
ＦＳＤＰＧである。

【００４４】

【発明の実施の態様】本発明のヘパリン解重合法は、ヘ
パリンをリン酸緩衝液(pＨ＝７.２)で溶解し、これに還
元性金属(例えば、鉄、銅粉末等)および金属酸化物(例
えば、カラムクロマト用シリカゲル等)を加え、激しく
攪拌した後、脱塩することにより経時的に効率よく特定
の平均分子量を有する解重合ヘパリンを得ることができ
る。

【００４５】上記還元性金属の例としては、還元作用を
有するものであれば特に制限はないが、銅、鉄、亜鉛、
マグネシウム、スズ、アルミニウム等が好適に用いられ
る。金属は表面積を大きくする意味から粉末状で用いる
のが好ましい。これらの金属は単独であるいは混合物と
して用いられる。より好ましくは、銅および鉄またはそ
れらの塩であり、最も好ましくは鉄またはその塩であ
る。

【００４６】また、本発明の解重合方法で用いる金属酸
化物は、例えば、酸化ケイ素（二酸化ケイ素を含む）、
酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化アンチモン、酸化硫
黄、酸化ウラン、酸化オスミウム、酸化カドミウム、酸
化カルシウム、酸化金、酸化銀、酸化クロム、酸化ゲル
マニウム、酸化コバルト、酸化ジルコニウム、酸化水
銀、酸化スズ、酸化ストロンチウム、酸化セレン、酸化
タングステン、酸化タンタル、酸化チタン、酸化鉄、酸
化テルル、酸化銅、酸化トリウム、酸化鉛、酸化ニオ
ブ、酸化ニッケル、酸化白金、酸化バナジウム、酸化バ
リウム、酸化ビスマス、酸化ヒ素、酸化ベリリウム、酸
化ホウ素、酸化マグネシウム、酸化マンガン、酸化モリ
ブデン、酸化ヨウ素、酸化リチウム、酸化リン、酸化ル
テニウム、酸化レニウム、酸化パラジウム等が好適に用
いられる。酸化ケイ素が特に好ましく、この酸化ケイ素
としてカラムクロマトグラフィー用充填剤として市販さ
れているシリカゲルを用いることができる。

【００４７】解重合中分子ヘパリンのアミド化誘導体の
合成 さらに、本発明の製法により得られる解重合ヘパリンを
アミド化してアミド化誘導体の合成を行う。解重合によ
って得られた新規の中分子ヘパリン(以下、ＭＨＥ−Ｆ
Ｓと称す)を誘導体化してＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導
体の合成を行うことができる。すなわち、ＭＨＥ−ＦＳ
および各種誘導体化エステル試薬を酸性条件下、１-エ
チル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
塩酸塩（ＥＤＣ）を加えることにより反応を行う。反応
終了後、４級アンモニウム塩とし、さらにアルカリ条件
下で加水分解を行い、目的とする各種ＭＨＥ−ＦＳのア
ミド化誘導体を合成する。

【００４８】

【化２】

【００４９】また、アミン化合物としては、例えば第一
級アミン化合物および第二級アミン化合物を挙げること
ができ、合成物、天然物を問わない。第一級アミン化合
物としてはアミノ基を有する化合物で有れば特に制限は
ない。第一級アミン化合物および第二級アミン化合物と
して、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、セリ
ン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギ
ン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジ
ン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリ
ンなどのα−アミノ酸またはその誘導体が好適に用いら
れる。これらのアミノ酸はD体、L体またはDL体のいずれ
でもよい。

【００５０】具体的に用いられる第一級アミン化合物
は、L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩、L-アス
パラギン酸ジメチルエステル塩酸塩、L-メチオニンメチ
ルエステル塩酸塩、L-セリンメチルエステル塩酸塩、L-
アルギニンメチルエステル二塩酸塩、２-アミノ-４-メ
チルチオフェン-３-エチルエステル、L-フェニルアラニ
ノール、R-(+)-フェニルエチルアミン、L-２-フェニル
グリシンメチルエステル一塩酸塩、S-ベンジル-L-シス
テイン、Ｎ−ベンジロキシカルボニル-L-リジン、D-２-
フェニルグリシンメチルエステル一塩酸塩、またはアミ
ノエタンスルホン酸である。

【００５１】上記の第一級アミンを用いて、中分子ヘパ
リニルフェニルアラニン(以下、ＦＳＦと称す)、中分子
ヘパリニルアスパラギン酸(以下、ＦＳＤと称す)、中分
子ヘパリニルメチオニン(以下、ＦＳＭと称す)、中分子
ヘパリニルセリン(以下、ＦＳＳと称す)、中分子ヘパリ
ニルアルギニン(以下、ＦＳＲと称す)、中分子ヘパリニ
ル-２-アミノ-４-メチルチオフェン-３-カルボン酸(以
下、ＦＳＡＭＣと称す)、中分子ヘパリニル-L-フェニル
アラニノール(以下、ＦＳＰＡと称す)、中分子ヘパリニ
ル-R-フェニルエチルアミン(以下、ＦＳＰＥＡと称
す)、中分子ヘパリニル-L-フェニルグリシン(以下、Ｆ
ＳＬＰＧと称す)、中分子ヘパリニルベンジル-L-システ
イン(以下、ＦＳＢＣと称す)、中分子ヘパリニルベンジ
ロキシカルボニル-L-リジン(以下、ＦＳＢＣＫと称
す)、中分子ヘパリニルタウリン(以下、ＦＳＴＲと称
す)および中分子ヘパリニル-D-フェニルグリシン(以
下、ＦＳＤＰＧと称す)が得られる。これらの中分子ヘ
パリンのアミド化誘導体は新規化合物である。

【００５２】ヘパリンの基本５糖構造中の硫酸基と様々
な生物活性については既述したとおりであるが、結合硫
酸基含量は変化させることができる。

【００５３】１．硫酸基含量を増加させる方法 硫酸基含量を増加させる割合によって適宜変更されると
ころであるが、下記に一般的な方法を示す。まず、ＭＨ
Ｅ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体約１００
mgに−４℃にて９５％硫酸２０mLおよびクロロスルホン
酸１０mLを加える。次に適当な時間、例えば約1時間撹
拌した後、室温に戻し、更に約1時間撹拌する。その後
−４℃の冷ジエチルエーテル５０mLを加え、沈殿物を濾
取する。該沈殿物を精製水に溶解し、０.５Ｎ ＮaＯＨ
で中和する。脱塩した後減圧濃縮を行い、硫酸基増加型
ＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を得
ることができる。

【００５４】２．硫酸基含量を減少させる方法 硫酸基含量を減少させる割合によって適宜変更されると
ころであるが、下記に一般的な方法を示す。まず、ＭＨ
Ｅ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体約３gを
精製水２５mLに溶解する。該溶解液をDowex 50W-X8(H
+、20〜50mesh)カラムに供す。カラム溶出液と洗浄液を
合わせ、冷却下にてピリジンを加え、pＨ＝５.５〜６.
０に調製した後濃縮する。得られたＭＨＥ−ＦＳまたは
ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のピリジニウム塩にメタ
ノール（該ピリジニウム塩０.９gに対しメタノール１０
mL）を加え、全体を湿潤させる。次に撹拌しながらＤＭ
ＳＯ ６０mLを添加し、完全に溶解させた後、ジオキサ
ン３０mLを加える。該溶液をガラス製耐圧容器内で９０
℃に加熱する。２４時間後室温に戻し開栓する。さらに
ピリジン塩酸塩（ピリジン２gを精製水８mLと混和し、
３Ｎ ＨＣｌ ７.５mLを少量ずつ撹拌しながら添加し
た後、濃縮乾燥する）のジオキサン−ＤＭＳＯ−メタノ
ール（３：６：１ v/v）溶液4mLを添加し、再度密栓し
て３６時間、９０℃に加熱する。反応終了後、精製水３
００mLを加え、１Ｎ ＮaＯＨにてｐＨ=９〜９.５に調
製した後、再結晶（エタノール）し乾燥させることによ
り、硫酸基減少型ＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのア
ミド化誘導体を得ることができる。

【００５５】本発明の解重合方法で得られる解重合ヘパ
リンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体は、通常の方
法により製剤化し、注射剤や経口剤として投与すること
ができる。また、解重合ヘパリンおよびアミド化解重合
ヘパリン誘導体には一般に生体内において遊離型と実質
的に同等の生理活性または薬理活性を発揮するもの、例
えば、本発明の化合物の誘導体および医薬的に許容され
る塩、付加塩、水和物などは本発明の技術的範囲に含ま
れるものである。また、例えば以下のような投与方法に
よって投与されるが、その投与量あるいは投与速度は、
通常、本剤投与後、全血凝固時間または全血活性化部分
トロンボプラスチン時間を測定しつつ、年齢、症例、適
応領域あるいは使用目的によって決定される。

【００５６】例えば、静脈内点滴投与法では、解重合ヘ
パリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体の５０００
〜５００００ヘパリン単位に相当する量を５％ブドウ糖
注射液、生理食塩液またはリンゲル液１０００mLで希釈
し、１分間に２０〜３０滴前後の速度で静脈内に点滴投
与する。また、静脈内間歇注射法では、解重合ヘパリン
およびアミド化解重合ヘパリン誘導体の２０００〜５０
０００ヘパリン単位に相当する量を４〜８時間毎に静脈
内に注射する。皮下注射・筋肉内注射法では、１回２０
００〜１００００ヘパリン単位に相当する量の解重合ヘ
パリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体を４時間毎
に注射する。更に１日１回〜数回の単回投与も可能であ
る。

【００５７】体外循環時(血液透析・人工心肺)における
使用において、人工腎では各患者の適正使用量は透析前
のヘパリン感受性試験の結果に基づいて算出されるが、
全身ヘパリン化法の場合、通常、透析開始に先だって、
１０００〜３０００ヘパリン単位に相当する量の解重合
ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体を投与
し、透析開始後は、１時間当たり５００〜１５００ヘパ
リン単位に相当する量を間歇的に追加する。局所ヘパリ
ン化法の場合は、１時間当たり１５００〜２５００ヘパ
リン単位に相当する量を持続注入する。また、人工心肺
灌流時では、術式・方法によって異なるが、通常、１５
０〜３００ヘパリン単位／kgに相当する量を投与し、更
に体外循環時間の延長に応じて適宜追加投与する。特
に、実施例で得られたＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳ
のアミド化誘導体は、平均分子量が約７０００〜１２０
００であるので、低分子ヘパリンのようにダイアライザ
ーから漏出する恐れがなく、有用である。

【００５８】経口投与の場合は、５００〜２０００ヘパ
リン単位／gに相当する量の解重合ヘパリンおよびアミ
ド化解重合ヘパリン誘導体を１日１〜数回服用する。外
用剤の場合は、１００〜５００ヘパリン単位／gに相当
する量の解重合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン
誘導体の軟膏として用いられ、適量を１日１〜数回塗布
またはガーゼ等に延ばして貼付する。座剤の場合は、１
０００〜４０００ヘパリン単位／gに相当する量の解重
合ヘパリンおよびアミド化解重合ヘパリン誘導体を１日
１〜２回肛門または膣に適用する。

【００５９】

【実施例】実施例１ ＨＥ(ヘパリン)の解重合条件の検
討 ヘパリン(Scientific Protein Laboratories)を５０mg
秤取し、これを０.２５Ｍリン酸緩衝液４mL(pH７.２)で
溶解し、鉄粉末(Ｆｅ)を２０または４０mg(和光純薬製)
およびワコーゲル(シリカゲル)(ＳiＯ₂)１２.５、２
５、５０または１００mg(和光純薬製)を加え、室温で密
栓して激しく撹拌した。０、０.５、１、２、３、４、
５および６時間後、反応物を濾過後、ＨＰＬＣに供し、
ヘパリンの推定分子量の経時的変化を測定した。その結
果を図１に示した。

【００６０】いずれの条件の場合もヘパリンは、試薬の
量にかかわらず経時的に低分子化されており、６時間の
反応で平均分子量４,０００〜５,０００に低分子化され
ていた。

【００６１】液体クロマトグラフ(HPLC)による分子量分
画の確認は、ＭＨＥ−ＦＳを蒸留水にて溶解し、次の条
件により、分子量の分画を行った。検出器：RID-１０A
(島津製作所製)、光散乱検出器：mini dawn(Wyatt tech
nology)、カラム：Shodex OHpak SB-５００３(昭和電工
製)、ガードカラム：Shodex OH pak SB-５０００G(昭和
電工製)。スタンダードにはポリエチレングリコール１
０,０００(Mw.Av.＝１０,０００、ALDRICH)、＃６,００
０(Mw.Av.＝８,５００、東京化成)、＃４,０００(Mw.A
v.＝３,０００、東京化成)および＃１,５４０、(Mw＝
１,４５０、関東化学)を用い、検量線を作成し、分子量
分画部分を確認した。

【００６２】以上の結果より反応時間および試薬量を調
節することで特定の分子量を有するヘパリンを合成でき
ることが明らかとなり、今回、これらの方法のうち比較
的安定して反応が進行し、また、必要最小限の試薬を用
いる方法(ヘパリン：Ｆｅ：ＳiＯ₂＝５：２：１.２５)
で、大量のＭＨＥ−ＦＳ(中分子ヘパリン)の合成を行っ
た。

【００６３】実施例２ 最適条件下でのＭＨＥ−ＦＳ
(中分子ヘパリン)の合成 ヘパリン１.０ｇを０.２５M リン酸緩衝液８０mL(pＨ=
７.２)で溶解し、これに鉄粉末４００mgおよびワコーゲ
ル２５０mgを加え、室温で密栓して激しく撹拌した。４
時間後、反応生成物をセライト(和光純薬製)で濾過し、
濾液を酢酸でpＨ=４.５に調製し、５％臭化ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウム水溶液をアンモニウム塩の沈
澱物が生じなくなるまで加えた。次にこの沈澱物を遠心
により完全に分離した後、沈澱物に５％ヨウ化ナトリウ
ムのエタノール溶液(５０mL)を加え、１時間撹拌後に濾
過し、沈澱をエタノールで再結晶を行い粗ＭＨＥ−ＦＳ
を得た。これを蒸留水に溶解し、HPLCに供し、分子量
５,０００〜１０,０００の分画を分取した。減圧濃縮し
た後、エタノールで再結晶し、ＭＨＥ−ＦＳ(７２０mg)
を得た。その結果、約７０％の収率で目的とするＭＨＥ
−ＦＳ(中分子ヘパリン)が合成できた。

【００６４】実施例３ ＭＨＥ−ＦＳの機器分析 フーリエ変換赤外分光計FTIR-８２００PC型(島津製作所
製)を用いて赤外線吸収(ＩＲ)スペクトルの測定を行っ
た。試料の調製はＫＢr錠剤法により行った。すなわ
ち、ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳを約３mg秤量し、ＫＢ
r約１００mgを混ぜ合わせ、ハンディープレスでペレッ
トを作製しＩＲスペクトルの測定を行った。

【００６５】自記分光光度計UV-２４０(島津製作所製)
を用いて紫外線吸収(ＵＶ)スペクトルの測定を行った。
ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳを１mg秤量し、蒸留水で、
１mg/mLの濃度に調製しＵＶスペクトルの測定を行っ
た。

【００６６】Varian XL-２００(２００MHz)を用いてヘ
パリンおよびＭＨＥ−ＦＳをD₂Oに溶解し、¹H ＮＭＲス
ペクトルの測定を行った。

【００６７】その結果、ＭＨＥ−ＦＳのＩＲ、ＮＭＲス
ペクトルではヘパリンと略同一であったが、ＵＶスペク
トルで２９０nmに極大吸収が認められた(図２)。

【００６８】実施例４ ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体
合成方法 アミド化誘導体合成のために下記の試薬を用いた(かっ
こ内はアミド化誘導体になった場合の略号を示す)。

【００６９】

【化３】

【００７０】具体的には、L-アルギニンメチルエステル
二塩酸塩(SIGMA)、L-アスパラギン酸ジメチルエステル
塩酸塩(SIGMA)、L-メチオニンメチルエステル塩酸塩(SI
GMA)、L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩(Aldri
ch)、L-セリンメチルエステル塩酸塩(半井テスク)、２-
アミノ-４-メチルチオフェン-３-エチルエステル(Lanca
ster)、L-フェニルアラニノール(東京化成)、R-(+)-フ
ェニルエチルアミン(東京化成)、L-２-フェニルグリシ
ンメチルエステル一塩酸塩(Aldrich)、D-２-フェニルグ
リシンメチルエステル一塩酸塩(Aldrich)、アミノエタ
ンスルホン酸(タウリン)(和光純薬)、Ｎ−ベンジロキシ
カルボニル-L-リジン(Lancaster)、S-ベンジル-L-シス
テイン(Lancaster)である。

【００７１】中分子へパリニルフェニルアラニン(ＦＳ
Ｆ)の合成 ＭＨＥ−ＦＳ５６０mgの水溶液１５mLにpＨ=４.７５に
おいてL-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩９００
mg、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)７００mg(半井テスク)の水溶液
５.１mLを徐々に加え、４時間撹拌した後、少量の水お
よび５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(半
井テスク)水溶液をアンモニウム塩の沈澱物が生じなく
なるまで加えた。次にこの沈澱物を遠心により完全に分
離した後、沈澱物に５％ヨウ化ナトリウム(半井テスク)
のエタノール溶液５０mLを加え、１時間撹拌後、濾過
し、沈澱をエタノールで再結晶を行うことにより、白色
粉末のヘパリニルフェニルアラニンメチルエステルを得
た。次いで、この化合物に０.１mol/L水酸化ナトリウム
溶液１０mLを加えて０〜５℃で窒素気圧下２日間撹拌し
た。反応後反応液に酢酸を加えpH=５とした後、濾過
し、濾液にエタノールを加え生成する白色粉末の中分子
へパリニルフェニルアラニン(以下、ＦＳＦと称す)を６
８％の収率で３８０mg得た。

【００７２】ＭＨＥ−ＦＳの各種アミド化誘導体を上記
のアミド化試薬を用いて、上記のＦＳＦの合成方法と同
様に、それぞれＦＳＲ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳ
ＢＣ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥ
Ａ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＴＲを合成し
た。また、各誘導体の合成収率を表１に示した。

【００７３】

【表１】MHE-FSのアミド化誘導体の収率

【００７４】実施例５ ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよび
ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の機器分析 フーリエ変
換赤外分光計FTIR-８２００PC型を用いて赤外線吸収(Ｉ
Ｒ)スペクトルの測定を行った。試料の調製はＫＢr錠剤
法により行った。すなわち、ヘパリンおよびＭＨＥ−Ｆ
Ｓを約３mg秤量し、ＫＢr約１００mgを混ぜ合わせ、ハ
ンディープレスでペレットを作製した。そして、以下の
条件によりＩＲスペクトルの測定を行った。

【００７５】自記分光光度計UV-２４０(島津製作所製)
を用いて紫外線吸収(ＵＶ)スペクトルの測定を行った。
各種中分子ヘパリンを１mg秤量し、蒸留水で、０.５mg/
mLの濃度に調製し、ＵＶスペクトルの測定を行った。

【００７６】Varian XL-２００(２００MHz)を用いてヘ
パリンおよび新規中分子ヘパリンをD ₂Oに溶解し、¹H Ｎ
ＭＲスペクトルの測定を行った、

【００７７】各誘導体のＩＲおよびＵＶスペクトルの結
果を表２に示した。

【表２】HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体のIR
およびUVスペクトルのデータ

【００７８】実施例６ ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体
の絶対分子量測定 ヘパリンのような複雑な構造を有する生理活性物質は、
分子量分布、分子サイズ、レセプターとの親和性などか
ら多様な活性を示すと考えられる。今まで低分子ヘパリ
ンの分子量を測定する際には、分子量スタンダードを使
って校正曲線を作成し、相対的な分子量を求めていたた
めに、精度はスタンダードの品質に依存されていた。ま
た、各スタンダードの分子量は固有粘度や超遠心などを
用いて求めており、そのため各社における低分子ヘパリ
ンの分子量分布が大きく異なっていた。今回、絶対分子
量の測定にＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ法(James, E. Knobloch
etal. ; Anal. Biochem., 245, 231-241, 1997)を用
い、ヘパリン、本発明で得られた中分子ヘパリン並びに
各中分子ヘパリン誘導体１３種ＦＳＦ、ＦＳＤ、ＦＳ
Ｍ、ＦＳＳ、ＦＳＲ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥ
Ａ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＴＲおよ
びＦＳＤＰＧの絶対分子量を多角度光散乱検出器を用
い、分子排除クロマトグラフ法(SEC/MALLS)にて測定す
るとともに、ヘパリンおよびダルテパリン(キッセイ薬
品、フラグミン注、Lot No ７０４７AH)との違いを検討
した。なお、本実験の標準物質として単分散で分子量が
明確なpullulan P-１０(昭和電工製、Mw.Av.=１１,８０
０)を用い、絶対分子量の正確性を確認した。その結
果、pullulanは単分散であり、平均分子量は１１,７６
０であった。ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳ、ダルテパリンお
よびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を２.５〜３mg秤取
し、２５mg/mLの濃度に調製した。これをＨＰＬＣに注
入し、ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ法により分子量を測定した。
次の条件で分析を行った。検出器：RID-１０A(島津製作
所製)、光散乱検出器：mini dawn(Wyatt technology)、
カラム：Shodex OH pak SB-８０３HQ(昭和電工製)、ガ
ードカラム：Shodex OH pak SB-G(昭和電工製)。また、
スタンダードについても同様の方法で行った。得られた
データについては解析ソフトASTRAを用いて解析し、そ
れぞれの平均絶対分子量を求めた。

【００７９】ＳＥＣ／ＭＡＬＬＳ法によるヘパリン、Ｍ
ＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の分子
量の測定結果を表３(Ｍｗ：絶対分子量(重量分子量)、
Ｍｎ：数平均分子量)に示す。すなわち、今回使用した
ヘパリンの平均分子量は１４,１７０であり、また、こ
のヘパリンより合成したＭＨＥ−ＦＳの平均分子量は、
８,３２７であった。ダルテパリンの平均分子量は、６,
６３５であり、ＭＨＥ−ＦＳと大きく異なっていた。Ｍ
ｗ／Ｍｎが１であれば単分散を示し、１より大きくなる
に従って多分散性を示す。測定結果を表３に示した。

【００８０】

【表３】HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体のSE
C/MALLS 分析

【００８１】実施例７ 硫酸基の測定 合成したＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘
導体に含まれる硫酸基の割合を測定した。標準液として
硫酸アンモニウム０、５、１０、２５、５０、７５、１
００μmol/mL(和光純薬)を蒸留水に溶解したものを使用
した。

【００８２】ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−Ｆ
Ｓのアミド化誘導体における硫酸基の含量を求めるため
にＸ軸に硫酸アンモニウム濃度、Ｙ軸に吸光度(５００n
m)として検量線を作成した。

【００８３】ヘパリン約１mgを１mol/Lの塩酸で１mg/２
mLの濃度に調製し、１、３、５および６時間加水分解
し、硫酸含量を測定した。

【００８４】ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−Ｆ
Ｓのアミド化誘導体における硫酸基の含量をK.S.Dodgso
nらの方法(K. S. Dodgson, et al. ; Biochem. J., 84,
106, 1962)に基づいて測定した。ヘパリン、ＭＨＥ−
ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を約５mg秤取
し、１mol/Lの塩酸で１０mg/mLの濃度に調製した。次に
この溶液１００μLを共栓付試験管に移し、ドラフト中
にて沸騰水浴中で、５時間加水分解を行った。加水分解
後、減圧濃縮し、これに０.１mol/Lの塩酸４.５mLを加
え、沈澱をよく溶解した後、３０００rpm、１０min遠心
した。標準液については各々１００μLを共栓付試験管
に採取し、０.１mol/L塩酸４.４mLを加えた。次に標準
液および試料液(遠心上清)を２mLずつ試験管に２本(空
試験用、本試験用)分けて採取し、空試験にはゼラチン
溶液(０.５ｇのゼラチン(DIFCO)に１００mLの蒸留水を
加え、湯浴(６０〜７０℃)で溶解し、４℃で一晩放置し
たもの)、本試験にはゼラチン-塩化バリウム溶液(左記
のゼラチン溶液５０mLに０.５ｇの塩化バリウム(無水)
(和光純薬)を加え、４時間以上撹拌したもの)を０.２５
mL加えよく混合し、室温で２０分間放置した後、１時間
以内にUVIDEC ７７Σ(日本分光)を用いて５００nmで吸
光度を測定した。結果を表４に示した。

【００８５】

【表４】HE, MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体の硫
酸基含量

【００８６】ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳの硫酸基の割
合はそれぞれ３１.７５％および３４.５２％であったの
に対し、ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体では２３.５１
〜３１.８０％であった。従って、ヘパリンおよびＭＨ
Ｅ−ＦＳと比較してＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の硫
酸基の割合が低くなっていることからＭＨＥ−ＦＳをア
ミド化誘導体化することによりヘパリンのもつ抗血液凝
固活性が軽減されたと考えられる。

【００８７】実施例８ ウロン酸含量の測定 合成したＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘
導体に含まれるウロン酸(L-イズロン酸およびD-グルク
ロン酸)を測定した。標準液としてグルクロン酸ナトリ
ウム０、０.０５、０.１、０.２５、０.５mg/mL(和光純
薬、Lot No ECK４８５４)を蒸留水に溶解したものを使
用した。

【００８８】ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−Ｆ
Ｓのアミド化誘導体におけるウロン酸の含量を求めるた
めにＸ軸にグルクロン酸ナトリウムの濃度、Ｙ軸に５３
０nmにおける吸光度として検量線を作成した。

【００８９】ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−Ｆ
Ｓのアミド化誘導体のウロン酸含量をT.Bitterらの方法
(T. Bitter, et al. ; Anal.Biochem., 4, 330, 1962)
を用い、測定した。ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨ
Ｅ−ＦＳのアミド化誘導体を秤取し、１mg/mLの濃度に
蒸留水を用いて調製した後、これらの試料、ブランク
(蒸留水)および標準物質をそれぞれ２００μL共栓付試
験管に採取した。次に室温以上にならないように注意し
ながら氷冷した四硼酸ナトリウム硫酸溶液(四硼酸ナト
リウム十水和物０.９５ｇ(和光純薬、Lot No ACN３４５
６)を氷冷した濃硫酸１００mL(キシダ、Lot No ES６０
４２４H)に溶解したもの)３.０mLを試料の入った試験管
に滴下し、さらに、カルバゾール液(カルバゾール１２.
５mg(和光純薬、Lot No ＣAJ００３４)を無水エタノー
ル１０mLで溶解したもの)を１００μL加えた。十分に混
合した後、沸騰水浴中で２０分間加熱し、室温まで氷冷
し吸光度(５３０nm)を島津自記分光光度計 UV-２４０を
用いて測定した。結果を表５に示した。

【００９０】

【表５】HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体のウ
ロン酸含量

【００９１】ウロン酸(L-イズロン酸およびD-グルクロ
ン酸)の含量は、ＦＳＤＰＧが４３.４３％と最も多く含
有しており、他は２８〜４０％ウロン酸を含有してい
た。

【００９２】実施例９ アミノ糖(ヘキソサミン)含量の
分析 一般にヘキソサミンは、硫酸基およびウロン酸と同様、
ヘパリンのもつ様々な生物活性に影響を与える因子とし
て大変重要であるとされている。一方、このヘキソサミ
ンの測定には、今まで比色分析法が主として使用されて
いたが、微量での分析が困難であった。今回、我々はヘ
キソサミンがアミノ糖であり、ニンヒドリン反応で呈色
することを利用し、微量のＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−
ＦＳのアミド化誘導体を用い、ヘキソサミン含量の測定
を行った。

【００９３】標準液には、D-(+)-グルコサミン塩酸塩
(和光純薬、Lot No TPH６５２５)０、１０、１００、１
０００μg/mLを０.０２mol/L塩酸に溶解したものを使用
した。また、測定には日立高速アミノ酸分析計L-８５０
０形を使用し、アミノ酸クロマトグラフ法で測定した。
分析条件は次の通りである。注入量：３０μL、カラ
ム：日立カスタムイオン交換樹脂#２６２２を内径４.６
mm、長さ６０mmのステンレス管に充填したもの、緩衝液
(表６)：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５、反応液：
和光純薬製ニンヒドリン試液Ｌ-８５００セット、化学
反応槽温度：１３５℃、検出器：可視部吸光光度計(測
定波長：４４０nmおよび５７０nm)。

【００９４】

【表６】アミノ酸分析装置用緩衝液

【００９５】１)和光純薬製ニンヒドリン試薬Ｌ-８５０
０セット。ニンヒドリン溶液(１Ｌ中、ニンヒドリン０.
２２moL、水素化ホウ素ナトリウムおよびプロピレング
リコールモノメチルエーテルを含む)と緩衝液(１Ｌ中、
酢酸リチウム二水和物２.０moL、プロピレングリコール
モノメチルエーテルを含む)を等量混合した液。 ２)pＨ９.０のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
塩酸緩衝液 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン６
０.５７mgを希塩酸３２.５mLに溶かし、水を加えて１０
００mLとした。 ３)０.１Mジトレイトール試液 ジトレイトール７７mg
をpＨ９.０のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩
酸緩衝液に溶かし、５mLとする。 ４)酸性ニンヒドリン試液 ニンヒドリン２.５gを氷酢酸に溶かし、塩酸４０mLを加
える。用時調製。 ５)クエン酸試液 クエン酸一水和物２４.２gを量り、水で１０００mLとす
る。

【００９６】ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−Ｆ
Ｓのアミド化誘導体について各々約１００μgを試料用
試験管に秤量し、この試験管を反応バイアル内に入れ減
圧乾燥させた。次に反応バイアル底に加水分解用６mol/
L塩酸(１％フェノール含有)を１００μL入れ、減圧下、
反応バイアル内を窒素で置換した後、１０５℃で１８時
間加水分解を行った。乾燥後、試験管を取り出し、０.
０２mol/L塩酸１００μLを加えてよく混合し、フィルタ
ーで濾過し、濾液を試料溶液とした。この試料溶液につ
いてアミノ酸分析装置を用い、各誘導体におけるヘキソ
サミンの含量を測定した。結果を表７に示した。

【００９７】

【表７】HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体のヘ
キソサミン含量

【００９８】ヘパリンのヘキソサミン含量は約１４％で
あり、ＭＨＥ−ＦＳは約１５％であった。また、ＭＨＥ
−ＦＳのアミド化誘導体では約１３〜４０％であった。
ＦＳＤＰＧにおいては４０％と高い値を示した。

【００９９】実施例１０ 元素分析 ヘパリンの構成成分はウロン酸とアミノ糖そして硫酸で
ある。これらの成分は、Ｃ、Ｈ、Ｏ、ＮおよびＳの五種
類の元素から成り立っており、これらの元素の割合がヘ
パリンの持つ薬効を左右している可能性も考えられてい
る。ゆえに、今回合成したＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導
体について、一分子中に含まれる個々の元素含量を元素
分析により求めた。元素分析機は、CHN CORDER(柳本製)
を用いた。

【０１００】ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘
導体について約３mg／バイアルを秤取した後、十分に乾
燥させ燃焼法にて各元素(Ｃ、Ｈ、Ｎ、ＯあるいはＳ)含
量を測定した。結果を表８に示した。

【０１０１】

【表８】HEおよびMHE-FSのアミド化誘導体の元素分析

【０１０２】今回合成した誘導体は、硫黄含量(Ｓ)が
７.８４〜９.７２％、酸素含量(Ｏ)が５２.４８〜５７.
９６％とヘパリンの硫黄含量(１０.５８％)および酸素
含量(６１.２５％)と比較して減少していたが、水素含
量(Ｈ)、炭素含量(Ｃ)および窒素含量(Ｎ)は増加してい
た。

【０１０３】 実施例１１ 抗血液凝固剤 ＭＨＥ−ＦＳ ５０００ 低分子ヘパリン国際単位(抗第Ｘa因子活性) 生理食塩水 適量 pＨを５.０〜７.５に調整し、全量を５mLとした。得ら
れた抗血液凝固剤は浸透圧比が約１(対生理食塩水比)で
あった。

【０１０４】実施例１２ 抗血液凝固剤 ＭＨＥ−ＦＳの代わりにＦＳＬＰＧを用いる以外は実施
例１１と同様にして調製した。得られた抗血液凝固剤は
浸透圧比が約１(対生理食塩水比)であった。

【０１０５】薬理試験 薬理試験１． in vitro血液凝固系に及ぼす影響 ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のin
vitroにおける血液凝固系に及ぼす影響を検討した。す
なわち、ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳの
アミド化誘導体におけるＡＰＴＴの延長作用と抗Ｘa活
性を調べるためにヒト正常血漿(Coagulation Control P
lasma (Normal) Level l:Pacific Hemostasis 製)を用
いて、以下の項目について測定を行った。

【０１０６】１) 活性化部分トロンボプラスチン時間
(ＡＰＴＴ)の測定 ＡＰＴＴ測定にはＡＰＴＴ-テストワコー(ＡＰＴＴ-P試
薬、ケファリン)(和光純薬)、Amelung-Coagulometer、
デカベット(エム・シー・メディカル)を使用した。ヒト
正常血漿９容にヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−
ＦＳのアミド化誘導体あるいはPBS(-)(対照)１容を加え
て被験血漿を調製し、これらの被験血漿１００μLに活
性化部分トロンボプラスチン試薬１００μLを加え、３
７℃、３分加温後、塩化カルシウム溶液を１００μL添
加し、血液凝固時間自動測定器Amelung-Coagulometerを
用いて、凝固するまでの時間を測定した。

【０１０７】２) 抗Ｘa活性の測定 抗Ｘa活性測定には、テストチームＲヘパリンＳ(第一化
学薬品)を使用した。ヒト正常血漿２容にヘパリン、Ｍ
ＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体あるい
は緩衝液(５０mM ２-アミノ-２-ヒドロキシル-１、３-
プロパンジオール、pH８.４)(対照)２容および緩衝液６
容加えて被験血漿を調製し、これらの被験血漿１００μ
Lを３７℃で５分間加温した後、ウシ由来Ｘa試液(７.１
nkat／mL)５０μLを加えた。さらに３０秒間加温した
後にあらかじめ加温しておいた基質液(Ｎ−ベンゾイル-
L-イソロイシル-L-グルタミル-グリシル-L-アルギニル-
p-ニトロアニリド・塩酸塩)１００μLを添加し、３分間
加温を続けた後、反応停止液(１０％酢酸)９５０μLを
加え、波長４０５nmの吸光度で残存するＸa因子を測定
した。測定結果を表９に示した。

【０１０８】

【表９】HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体の抗
Xa活性/APTT活性 *: ＡＰＴＴを100秒に延長する濃度

【０１０９】表９ではＡＰＴＴの延長作用をヘパリン比
で表した場合、値が大きい程、出血傾向がヘパリンより
軽減されており、例えばＭＨＥ−ＦＳでは約２倍軽減さ
れていることになる。また、抗Ｘa活性を１/ヘパリン比
で表した場合、この値が１より大きい程、抗Ｘa活性(抗
血栓作用)が、ヘパリンよりも優れていることになる。
従って、抗凝固能の表現方法の一つとして用いられてい
る抗Ｘa活性とＡＰＴＴの延長作用の比(抗Ｘa活性/ＡＰ
ＴＴ比)が大きい程、より安全性の高いヘパリン代用薬
としての可能性がある。つまり、ヘパリンを１とした
時、ＭＨＥ−ＦＳが２.４４、ＦＳＡＭＣが２.１５、Ｆ
ＳＢＣＫが４.８９、ＦＳＰＡが１.２４、ＦＳＬＰＧが
１.２７と高い値を示した。このことから、これらの誘
導体は、抗Ｘa活性が保持されＡＰＴＴの延長作用が弱
められた結果、出血助長が少なく、かつ抗血栓作用をも
ったより安全性の高い抗凝固薬として期待される。

【０１１０】ＭＨＥ−ＦＳのカルボン酸を置換した誘導
体のうち、Ｃ末端の官能基の種類(水酸基(ＦＳＰＡ)、
カルボン酸(ＦＳＦ))ではＡＰＴＴ活性にほとんど差が
なかったが、抗Ｘa活性は、水酸基(ＦＳＰＡ)の方がカ
ルボン酸(ＦＳＦ)の約７倍の活性を示した。また、Ｃ末
端の官能基がカルボン酸(ＦＳＬＰＧ)と比較してメチル
基(ＦＳＰＥＡ)の場合、ＡＰＴＴは、約１/２.５に軽減
されていたが、抗Ｘa活性は、約１/４に低下していた。
ベンゼン環が、ヘパリンとの結合部位より遠隔になるＦ
ＳＤＰＧ、ＦＳＦ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫの順でＡＰＴ
Ｔの延長作用が軽減されていた。さらに天然型のＬ体と
非天然型のＤ体を比較するとＡＰＴＴはほとんど変わら
ないが、抗Ｘa活性はＬ体のほうが約１０倍高かった。

【０１１１】薬理試験２． ex vivo血液凝固系に及ぼ
す影響 ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のex
vivoにおける血液凝固系に及ぼす影響を検討した。雄
性マウス(１群３〜５匹)にヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳ
を０.１、０.３および１.０mg/kg、ＦＳＬＰＧおよびＦ
ＳＤＰＧを０.３、１.０、３.０および１０.０mg/kg、
その他のＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体を１.０、３.
０、１０.０および３０.０mg/kg(対照はPBS(-))の用量
で尾静脈内に投与し、投与１５分後にエーテルおよびネ
ンブタール麻酔下で腹部大動脈より３.８％クエン酸ナ
トリウム(血液９容に対して１容)を用いて採血し、以下
の項目について測定を行った。

【０１１２】１) 活性化部分トロンボプラスチン時間
(ＡＰＴＴ)の測定 ＡＰＴＴ測定にはＡＰＴＴ-テストワコー(ＡＰＴＴ-P試
薬、ケファリン)(和光純薬)、Amelung-Coagulometer、
デカベット(エム・シー・メディカル)を使用した。採血
した血液より得た血漿１００μLに活性化部分トロンボ
プラスチン試薬１００μLを加え、３７℃、３分加温
後、塩化カルシウム溶液を１００μL添加し、血液凝固
時間自動測定器Amelung-Coagulometerを用いて、凝固す
るまでの時間を測定した。

【０１１３】２) 抗Ｘa活性 抗Ｘa活性測定には、テストチームＲヘパリンＳ(第一化
学薬品)を使用した。採血した血液より得た血漿２容に
緩衝液(５０mM ２-アミノ-２-ヒドロキシル-１、３-プ
ロパンジオール、pＨ８.４)８容加えて被験血漿を調製
し、この被験血漿１００μLを３７℃で５分間加温した
後、ウシ由来Ｘa試液(７.１ nkat/mL)５０μLを加え
た。さらに３０秒間加温した後にあらかじめ加温してお
いた基質液(Ｎ−ベンゾイル-L-イソロイシル-L-グルタ
ミル-グリシル-L-アルギニル-p-ニトロアニリド・塩酸
塩)１００μLを添加し、３分間加温を続けた後、反応停
止液(１０％酢酸)９５０μLを加え、波長４０５nmの吸
光度で残存するＸa因子を測定した。結果を表１０に示
した。

【０１１４】

【表１０】HE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘導体の
抗Xa活性/APTT活性 *: ＡＰＴＴを100秒に延長する投与量

【０１１５】表１０においてはＡＰＴＴの延長作用をヘ
パリン比で表した場合、値が大きい程、出血傾向がヘパ
リンより軽減されている。また、抗Ｘa活性を１/ヘパリ
ン比で表した場合、この値が１より大きい程、抗Ｘa活
性(抗血栓作用)が、ヘパリンよりも優れていることにな
る。従って、抗凝固能の表現方法の１つとして用いられ
ている抗Ｘa活性とＡＰＴＴの延長作用の比(抗Ｘa活性/
ＡＰＴＴ比)が大きい程、より安全性の高いヘパリン代
用薬としての可能性がある。つまり、ヘパリンを１とし
た時、ＦＳＡＭＣが１.９１、ＦＳＰＡが２.１４、ＦＳ
ＰＥＡが１.８１、ＦＳＬＰＧが２.４８、ＦＳＢＣＫが
２.２２と、高い値を示した。すなわち、これらの誘導
体については、臨床においてヘパリンより安全性の高い
抗凝固薬としての応用が期待される。

【０１１６】ＭＨＥ−ＦＳのカルボン酸を置換した誘導
体の内、Ｃ末端の官能基の種類(水酸基(ＦＳＰＡ)、カ
ルボン酸(ＦＳＦ))ではin vitroでの結果と同様、ＡＰ
ＴＴ活性にほとんど差がなかったが、抗Ｘa活性は、水
酸基(ＦＳＰＡ)の方がカルボン酸(ＦＳＦ)の約７倍の活
性を示した。また、Ｃ末端の官能基がカルボン酸(ＦＳ
ＬＰＧ)と比較してメチル基(ＦＳＰＥＡ)の場合もin vi
troでの結果同様、ＡＰＴＴは、約１/３に軽減されてい
たが、抗Ｘa活性は、約１/４.５に低下していた。天然
型のＬ体(ＦＳＬＰＧ)と非天然型のＤ体(ＦＳＤＰＧ)を
比較するとＡＰＴＴの延長はＤ体では、Ｌ体と比較して
約１/３に軽減されているが、抗Ｘa活性はＬ体のほうが
約１０倍高い活性を示していた。

【０１１７】薬理試験３． ＰＡＮ腎症に及ぼす影響 ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のpu
romycin aminonucleoside(ＰＡＮ)腎症に及ぼす影響を
検討した。

【０１１８】生理食塩液に溶解したＰＡＮ(和光純薬)を
１１０mg/５mL/kgの用量でラットに１回腹腔内投与する
ことによりＰＡＮ腎症を惹起した。ＰＡＮ腎症惹起１、
４、７、１０および１４日後にラットに水道水２５mL/k
gを経口投与した後、代謝ケージ(CT-１０型、日本クレ
ア)に収容し、絶食・給水下の条件で１６時間採尿を行
った。採取した尿は尿量を計測し、尿中蛋白濃度をマイ
クロTPテストワコー(和光純薬)を用いて測定し、尿蛋白
排泄量／日を算出した。

【０１１９】試験物質は０.１５〜５mg/mL/kgの用量で
静脈内投与し、メチルプレドニゾロン(注射用メプレド
ロン、富士レビオ、MP)は１０mg/５mL/kgの用量で経口
投与した。投与期間はＰＡＮ投与３０分前および投与１
日後より１回／日、連日１４日間とした。

【０１２０】動物は４週齢のJcl:SD系雄性ラットを使用
した。各群の動物数は６〜７匹とした。また、陽性対照
物質はＭＰを添付溶解液(全量２mL)に溶解した後、PBS
(-)で希釈し２mg/mLの濃度に調製し使用した。

【０１２１】測定値は平均値±標準誤差で表示した。対
照群と試験物質投与群間については多重比較検討を行っ
た。まずLevene法で各群の分散の一様性を検定し、等分
散の場合には一元配置分散分析を、不等分散の場合には
データを順位変換した後Kruskal-Wallis検定を行った
後、Tukey法により検定した。また、対照群と陽性対照
群間についてはｔ検定を実施した。結果を図３に示し
た。各測定値は１群当たりの動物数６〜７匹の平均値±
Ｓ.Ｅ.示す。*(Ｐ＜０.０５)、**(Ｐ＜０.０１)におい
て対照との間に有意差が見られた。

【０１２２】対照群における尿蛋白排泄量はＰＡＮ投与
４日後に５８.６±３１.９mg/dayと増加し始め、１０日
後に１３０±２４.７mg/日とピークを示し、その後減少
した。これに対して、陽性対照物質であるＭＰ投与群に
おける尿蛋白排泄量はＰＡＮ投与７日後以降有意に減少
した(図３Ａ)。ＦＳＦ１mg/kg投与群においては尿蛋白
排泄量の減少傾向が認められ、３mg/kg投与群の尿蛋白
排泄量はＰＡＮ投与１０日後において対照群の３２％ま
で減少した(図３Ｂ)。ＦＳＤＰＧ １mg/kg投与群におい
ては尿蛋白排泄量の減少傾向が認められた(図３Ｃ)。Ｆ
ＳＬＰＧ １mg/kg投与群における尿蛋白排泄量は、ＰＡ
Ｎ投与７および１０日後において有意に減少した(図３
Ｄ)。ゆえに、ＦＳＦおよびＦＳＬＰＧはＰＡＮ腎症に
おける尿蛋白排泄を抑制することが明らかとなったこと
から、急性・慢性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿
病性腎症、腎硬化症、間質性腎炎、慢性腎盂腎炎、急性
尿細管壊死、通風腎、重金属・薬剤中毒、薬剤による副
作用、尿細管性アシドーシス、腎不全、ループス腎炎等
の腎性蛋白尿をきたす、各種腎疾患の予防・治療剤に応
用できる。

【０１２３】薬理試験４． in vitro血小板凝集能に及
ぼす影響 ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のラ
ット血小板に対するコラーゲンおよびトロンビン誘発凝
集の影響を検討した。

【０１２４】１)ラット血小板の採取 ペントバルビタールナトリウム(ネンブタール注、大日
本製薬)４０mg/kg、i.p.麻酔下にてSD系雄性ラットを開
腹し、腹部大動脈を露出した。３.８％クエン酸ナトリ
ウム溶液(診断用チトラミン“フソー”、扶桑薬品)０.
８mLを含む２０mLシリンジポンプに１８ゲージ注射針を
装着し、腹部大動脈より８mL以上の血液を採取した。採
血後、直ちにクエン酸ナトリウム溶液の添加比率が採血
量の１０％となるよう、同溶液をシリンジポンプ内に添
加し、転倒混和した。この血液を低速遠心(６５０〜７
５０rpm、２５℃にて２０分)し、上清を採取した。これ
を多血小板血漿(PRP)とした。さらに残りの血液を遠心
(３０００rpm、４℃にて、１０分)し、上清を採取し
た。これを乏血小板血漿(PPP)とした。

【０１２５】２)洗浄血小板溶液の調製 PRPに１/１００容の２００mmol/L EDTA-２Na溶液を添加
し、穏やかに混和した。これを遠心(２３００rpm、４℃
にて、１０分)し、上清を吸引除去した。沈渣をもとのP
PPとほぼ同量の０.３mmol/L EDTA-２Naを含むトリス塩
酸緩衝生理食塩液(pH ７.４)に懸濁した。再び遠心(２
３００rpm、４℃にて、１０分)し、上清を吸引除去し
た。沈渣を元のPPPとほぼ同量の０.１％ウシ血清アルブ
ミン(Fraction V、生化学工業)を含むＣa²⁺-freeタイロ
ード(BSA-Tyrode)液に懸濁し、これを洗浄血小板溶液と
した。

【０１２６】３)コラーゲン誘発血小板凝集に対する影
響 PRPを測定に使用した。PRPは、多項目自動血球測定装置
にて血小板数をカウントし、いずれも５×１０⁵/mLとな
るようPPPにて調製した。対照用のキュベットにPPP、測
定用のキュベットに調製PRP各々１８０μLを添加した。
添加したキュベットを予め５分間以上３７℃で加温した
後、測定を開始した。測定開始１分後にPBS(-)１０μL
あるいは種々の濃度の試験物質(ヘパリン、ＭＨＥ−Ｆ
ＳあるいはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体)の１０μLを
測定用キュベットに添加した。さらに３分後に、血小板
凝集物質として０.４mg/mLコラーゲンの１０μL(終濃度
２０μg/mL)を添加し、その後１０分間測定を行った。
測定開始時におけるPPPの光透過率を１００％、調製PRP
を０％とし、凝集物質添加後の光透過率の変化を血小板
凝集率として測定した。コラーゲン(コラーゲンリエー
ジェント“ホルム”、Nycomed Arzneimittel−モリヤ産
業)は試薬に付属のＳＫＦバッファーにて希釈した。血
小板数の測定には多項目自動血球測定装置(K-１００
０、日本分光)を、血小板凝集能の測定には血小板凝集
能測定装置(PAM-８C、メバニクス)を使用した。

【０１２７】４)トロンビン誘発血小板凝集に対する影
響 洗浄血小板溶液を測定に使用した。前項と同様に洗浄血
小板溶液の血小板数をカウントし、５×１０⁵/mLとなる
ようBSA-Tyrode液にて希釈した。対照用のキュベットに
BSA-Tyrode液、測定用のキュベットに洗浄血小板溶液各
々１８０μLを添加し、前項と同様に測定を行った。但
し、凝集物質としては４０ unit/mLトロンビン溶液の１
０μL(終濃度０.２ unit/mL)を添加した。トロンビン
(トロンビン５,０００単位モチダ、持田製薬)はPBS(−)
にて溶解した。

【０１２８】５)統計解析 各凝集物質添加１０分後までの最大凝集率を求めた。ヘ
パリン、ＭＨＥ−ＦＳまたはＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘
導体の血小板凝集に対する阻害率は以下の式により算出
した。但し、阻害率を算出に用いるデータは、各々同一
個体の血小板より得られたデータとした。

【０１２９】抑制率(％)=(１−各試験物質添加時の最大
凝集率／PBS(-)添加時の最大凝集率)×１００ また測定は、各々異なる個体の血小板を用いて３〜５回
繰り返して行い、その平均値と標準偏差を算出した。ま
た濃度依存的な血小板凝集抑制を示した被験物質につ
き、抑制率が５０％の前後となる２〜４用量における直
線回帰式を求め、５０％抑制率(IC₅₀)を算出した。

【０１３０】６)試験物質 ヘパリン、ＭＨＥ−Ｆ
Ｓ、ＦＳＦ、ＦＳＲ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＡ
ＭＣ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＢＣ、
ＦＳＢＣＫ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＴＲを使用した。ヘ
パリン、ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘
導体は種々の濃度にPBS(-)を用いて調製し、０.４５μm
のフィルター(ザルトリウス)で濾過した後使用した。陰
性対照物質としてPBS(-)を使用した。

【０１３１】その結果、コラーゲンおよびトロンビン凝
集に対してはヘパリンをはじめ、すべての薬物で濃度依
存的な凝集抑制作用が観察されたが、そのＩＣ₅₀は薬物
によって大きく異なっていた。コラーゲン誘発凝集に対
してはＦＳＬＰＧとＦＳＤＰＧがヘパリンの作用を上回
る強い抑制作用を示した(表１１)。トロンビン凝集に対
してはＦＳＦ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＤＰＧ、ＦＳＢＣおよ
びＦＳＢＣＫがヘパリンの作用を上回る強い抑制作用を
示した(表１２)。以上の結果より、ヘパリンより強い作
用を示した誘導体は、いずれもヘパリンに替わる抗凝固
剤、DIC治療剤あるいは血小板凝集阻害に基づく腎疾患
治療剤としての応用が期待される。

【０１３２】

【表１１】ラットにおけるコラーゲン(20μg/mL)誘導血
小板凝集に対するHE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化誘
導体に対する５０％抑制濃度

【０１３３】

【表１２】ラットにおけるトロンビン(0.2単位/mL)誘導
血小板凝集に対するHE、MHE-FSおよびMHE-FSのアミド化
誘導体に対する５０％抑制濃度

【０１３４】今回、スクリーニングに使用したＭＨＥ−
ＦＳ誘導体のうち、ベンゼン環の配置をＭＨＥ−ＦＳと
の結合部位に最も近くしたＦＳＬＰＧとＦＳＤＰＧは、
コラーゲンおよびトロンビンによる血小板凝集をともに
強く抑制し、いずれもヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳより強い
作用であった。またＦＳＦおよびベンゼン環の配置を若
干遠くしたＦＳＢＣおよび最も遠い配置のＦＳＢＣＫ
は、トロンビン誘発凝集は強く阻害したが、コラーゲン
誘発凝集に対してはヘパリンと同程度(ＦＳＦ)か約１/
４(ＦＳＢＣ)または１/８(ＦＳＢＣＫ)程度弱い作用で
あった。これらの事実は、ＭＨＥ−ＦＳに結合させる化
合物がベンゼン環とカルボン酸を有することにより、ト
ロンビンによる血小板凝集を強く抑制するようになる
が、コラーゲン誘発凝集については、ベンゼン環の配置
をＭＨＥ−ＦＳとの結合部位付近に近づけることによっ
て、強い抑制作用を有するようになることを示唆してい
る。

【０１３５】薬理試験５． ラジカルスカベンジ作用に
及ぼす影響 ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のラ
ジカルスカベンジ作用を検討した。

【０１３６】腎炎の発症にフリーラジカルの関与が報告
されている。特に、抗原抗体複合体が関与する腎炎、尿
毒素の一種であるメチルグアニジンが生体に蓄積するこ
とに起因する腎炎においてはフリーラジカルの関与が明
らかにされている(大柳善彦；活性酸素と病気、化学同
人、京都(１９８４)、大柳善彦；ＳＯＤと活性酵素調節
剤−その薬理作用と臨床応用−、日本医学館、東京(１
９８９)、佐中孜他；腎と透析臨時増刊号、１２２-１２
６、東京医学社(１９９４)、青柳一正他；腎と透析臨時
増刊号、１２７-１３４、東京医学社(１９９４))。

【０１３７】１)被験物質 ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳ、ＦＳＦ、ＦＳＲ、ＦＳＤ、Ｆ
ＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、Ｆ
ＳＬＰＧ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＤＰＧおよびＦ
ＳＴＲを用いた。調製は各々１mg/mLに培地を用いて調
製した。

【０１３８】２)方法 L.M.hiebertとJi-min Liuの方法(L.M.Hiebert and Ji-m
in Liu : Atherosclerosis, ８３、４７-５１、１９９
０)に準じて行った。すなわち、正常ブタ肺動脈血管内
皮細胞(ＰＰＡ−ＥＣ)(大日本製薬)、またはヒトさい帯
動脈血管内皮細胞(ＨＵＡ−ＥＣ)(ダイアトロン)をタイ
プＩコラーゲンコーティングフラスコ(７５cm²;ファル
コン)で２０％ウシ胎児血清(Bio-whittaker)および細胞
増殖添加因子(EGM-２添加因子セット；三光純薬)含有の
M１９９アール培地(ギブコ)(２mL)により培養した。３
回目の継代時に細胞を１×１０⁵ cells/wellの細胞密度
でタイプＩコラーゲンコーティング６穴プレート(ファ
ルコン)に分注し、実験を行った。すなわち被験物質(１
mg/mL)を全培地量の１/２０容処置し、その後培地で調
製したヒポキサンチン(０.２μM/mL)(シグマ)およびキ
サンチンオキシダーゼ(４U/mL)(ベーリンガーマンハイ
ム)をいずれも全培地量の１/２０容ずつ加えてフリーラ
ジカルを発生させ放置した。その、２４時間後培地上清
を回収し、EDTA-トリプシン(０.０２％-０.２５％=１:
１)処理により細胞を回収し、コールターカウンター(コ
ールター社)を用いて生細胞数を計測した。その後被験
物質を適用しない細胞(Normal)の平均生細胞数を１００
％としてcell viabilityを算出した。群間の有意性はBa
rtlett法にて分散の均一性を確認した後、Tukey法によ
り検定した。結果を表１３に示した。

【０１３９】

【表１３】ピポキサンチンおよびキサンチンオキシダー
ゼ処理によるPPA-ECEに対するHE、MHE-FSおよびMHE-FS
のアミド化誘導体の作用 ＊＊P<0.01, V.S. PBS.(Tukey's test)

【０１４０】その結果、ＰＰＡ−ＥＣを用いた検討にお
けるcell viabilityは被験物質を適用していない細胞と
比べ、ＦＳＰＡ以外の被験物質処置細胞において有意(P
<０.０１;Tukey's test)に高かった(表１３)。すなわ
ち、ＦＳＰＡ以外の被験物質においてラジカルスカベン
ジ作用が確認された。

【０１４１】薬理試験６． in vitroにおけるラットメ
サンギウム細胞(ＭＣ)および正常ヒトメサンギウム細胞
(ＮＨＭＣ)に及ぼす影響 ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のin
vitroにおけるラットメサンギウム細胞(ＭＣ)および正
常ヒトメサンギウム細胞(ＮＨＭＣ)増殖抑制作用につい
て検討した。インスリン(Sigma)、L-グルタミン(コスモ
バイオ)、抗生物質としてAntibiotic-antimycotic(GIBC
O)を使用した。試験薬物は３００〜３０００μg/mLの濃
度に培地を用いて調製し、０.４５μmフィルターでろ過
した後使用した。

【０１４２】１)ＭＣ増殖抑制作用の検討 ＭＣを２０％FCS含有RPMI１６４０(GIBCO)培養液に加
え、６-wellマイクロプレート(FALCON)に４.０×１０⁴c
ells/well播種し、２４時間培養した。その後０.４％FC
S(FCS、Biowhittaker)含有RPMI 1640培養液に置換し、
３日間培養した。さらに、１０％FCS含有RPMI 1640培養
液に置換し、各試験物質を全容量の１/１０容添加し
た。４日後にTrypsin−EDTA液にて細胞をすべてはが
し、コールターカウンターを用いて細胞数を測定した。
結果を図４Ａに示した。

【０１４３】２)ＮＨＭＣ増殖抑制作用の検討 ＮＨＭＣ(TaKaRa)を２０％FCS含有ＭsＢＭ培養液(Biowh
ittaker)に加え、６-wellマイクロプレートに細胞数を
３.５×１０⁴cells/well播種し、２４時間培養した。そ
の後０.４％FCS(FCS、Biowhittaker)含有MsBM培養液に
置換し、３日間培養した。さらに、１０％FCS含有ＭsＢ
Ｍ培養液に置換し、各試験物質を全容量の１/１０容添
加した。６日後にTrypsin−EDTA液にて細胞をすべては
がし、コールターカウンターにて細胞数を測定した。結
果を図４Ｂに示した。

【０１４４】ＭＣおよびＮＨＭＣ増殖抑制作用に対する
試験物質の評価は、下式に示す抑制率により行った。 抑制率(％)＝[１−(試験物質処置時の細胞数−０.４％F
CS含有培養液添加７又は９日後の細胞数／無処置対照の
細胞数−０.４％FCS含有培養液添加７又は９日後の細胞
数)]×１００

【０１４５】その結果、ヘパリン適用群は３０〜３００
μg/mLの用量においてＭＣ増殖を用量依存的に３１.３
２〜４６.０５％抑制した。ＦＳＦ、ＦＳＬＰＧおよび
ＦＳＤＰＧ適用群においては３０〜３００μg/mLの用量
においてそれぞれ用量依存的に抑制し、その抑制率はヘ
パリン適用群と比べてすべての用量において上回った
(図４Ａ)。

【０１４６】また、ヘパリン適用群は５０〜２００μg/
mLの用量においてＮＨＭＣ増殖を用量依存的に５７.９
３〜７７.２７％抑制した。ＦＳＦおよびＦＳＤＰＧ適
用群において、それぞれ用量依存的に増殖抑制が見られ
た。またＦＳＦ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧ各中分子
ヘパリン誘導体適用群においてその抑制率はヘパリン適
用群と比べて上回るものであった(図４Ｂ)。以上の結果
より、今回用いたＦＳＦ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧ
がヘパリンよりも優れた腎メサンギウム細胞増殖抑制作
用を有する化合物であることが明らかとなった。

【０１４７】薬理試験７． in vitro補体活性化抑制作
用に及ぼす影響 ＭＨＥ−ＦＳおよびＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のin
vitroにおける補体活性化抑制作用について検討した。

【０１４８】感作ヒツジ赤血球(８.５％感作ヒツジ赤血
球、デンカ生研、以下ＥＡ)を５×１０⁸ cells/mLの濃
度になるようにゼラチンベロナール緩衝液(以下、ＧＶ
Ｂ)に浮遊させ、このＥＡ浮遊液２００μLにＧＶＢで溶
解・希釈したモルモット補体(乾燥補体、デンカ生研)を
加えＧＶＢを用いて全量１.５mLとした。３７℃の恒温
槽中で１時間反応させた後、３０００rpmで１０分間遠
心分離し、上清のヘモグロビン量をUVIDEC−７７Σ(日
本分光)を用いて測定波長５４２nmで測定した。同時に
物理的溶血として補体の代わりにＧＶＢを加えたものお
よび１００％溶血として補体およびＧＶＢの代わりに純
水を加えた検体を作製し、同様の操作を行った後にその
上清のヘモグロビン量を測定した。各被験物質の作用の
検討は、補体活性化による溶血率が約５０％になる条件
で行った。また被験物質の添加量は全容量の１/１００
容となるように添加した。各被験物質の補体活性化によ
るＥＡの溶血に対する阻害率を下記の式により算出し
た。

【０１４９】抑制率(％)＝[１−(各試験物質添加時の溶
血率／コントロール(溶媒のみを添加)の溶血率)]×１０
０

【０１５０】ヘパリン、ＭＨＥ−ＦＳ、ＦＳＦ、ＦＳ
Ｒ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＡＭＣ、ＦＳＰＡ、
ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳ
ＤＰＧおよびＦＳＴＲを使用した。陽性対照薬としてNa
famostat mesilate(注射用フサン^ョ、鳥居薬品)を使用し
た。結果を表１５に示した。

【０１５１】

【表１４】

【０１５２】補体活性化抑制作用などの抗凝固作用以外
のヘパリンの生理活性を臨床に応用する場合、出血傾向
などの副作用が問題になってくる。補体活性化抑制作用
が強く、かつ出血傾向の少ないＭＨＥ−ＦＳのアミド化
誘導体を検出するための指標として(ヘパリンがＡＰＴ
Ｔを１００秒に延長した用量を１とした時のそれぞれの
ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体の用量比)×(ヘパリンの
補体活性化抑制作用のＩＣ₅₀を１にした時のそれぞれの
ＭＨＥ−ＦＳのアミド化誘導体のＩＣ₅₀の比の逆数)を
算出した。その結果、陽性対照薬として用いたNafamost
atのIndex,１５.３０よりも小さい値ではあったが、L-
フェニルグリシン(LPG)、フェニルアラニン(F)、D-フェ
ニルグリシン(DPG)、ベンジル-L-システイン(BC)、ベン
ジロキシカルボニル-L-リジン(BCK)、メチオニン(M)、
アスパラギン酸(D)を導入することによってIndexは８.
７８〜１.１５となりヘパリンの１より大きな値を示し
た(表１５)。このことからＦＳＦ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＢ
Ｃ、ＦＳＤＰＧ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＭおよびＦＳＤはヘ
パリンよりも副作用が少なくかつ補体活性化抑制作用が
強いことが示唆された。

【０１５３】今回の結果からＦＳＦ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳ
ＢＣ、ＦＳＤＰＧ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＭ、ＦＳＤ、特に
ＦＳＦは補体の活性化が病態の発症あるいは進展に関与
していると考えられている腎炎等の疾患の治療薬として
の臨床応用が示唆された。また、ＭＨＥ−ＦＳにベンゼ
ン環およびＯＨ、ＯＣＨ₃、-ＯＣＯＣＨ₃、-ＮＨＣＯＣ
Ｈ₃等の電子供与基を有した物質を導入する事によって
更に強い補体活性抑制作用が得られると推測される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 反応時間および試薬量によるヘパリンの推定
分子量の時間的変化を示す折線グラフである。

【図２】 ヘパリンおよびＭＨＥ−ＦＳのＵＶスペクト
ルを示す

【図３】 ヘパリン誘導体のＰＡＮ腎症ラットに及ぼす
影響を示す折線グラフである。*(Ｐ＜０.０５)、**(Ｐ
＜０.０１)

【図４】 ヘパリン誘導体のin vitroにおけるラットメ
サンギウム細胞(ＭＣ)(Ａ)および正常ヒトメサンギウム
細胞(ＮＨＭＣ)(Ｂ)に及ぼす影響を示す棒グラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大谷 裕也 和歌山県和歌山市大河内559−２ (72)発明者 西川 裕之 奈良県香芝市五位堂26−８ (72)発明者 武田 誠一 大阪府大阪市港区夕凪１−13−16 (72)発明者 島田 千明 大阪府高槻市栄町４−21−11 (72)発明者 北川 知津子 奈良県奈良市学園朝日元町２−529−３− Ｂ104 (72)発明者 安部 智之 大阪府枚方市村野本町30−39 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA27 MA01 MA04 MA65 NA06 NA14 ZA54 ZA81 ZC41 4C090 AA01 AA02 AA04 AA05 AA09 BA68 BA97 BB02 BB17 BB22 BB24 BB33 BB36 BB55 BB62 BB98 BC27 BD15 BD37 CA31 CA35 DA09 DA23

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 還元性金属および金属酸化物を用いるこ
   とを特徴とするヘパリンの解重合方法。
2. 【請求項２】 下記の工程を下記の順序で含む、請求項
   １記載のヘパリンの解重合方法。 (１)ヘパリンを約ｐＨ６〜８の緩衝液に溶解 (２)該溶解液に還元性金属および金属酸化物を添加
3. 【請求項３】 上記工程(２)の後に、さらに下記の工程
   を下記の順序で含む、請求項２記載のヘパリンの解重合
   方法。 (ａ)約ｐＨ３〜５.５に調整 (ｂ)臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを添加 (ｃ)ヨウ化ナトリウムのエタノール溶液を添加
4. 【請求項４】 上記還元性金属が鉄またはその塩であ
   る、請求項１〜３記載のヘパリンの解重合方法。
5. 【請求項５】 上記金属酸化物が二酸化ケイ素である、
   請求項１〜４記載のヘパリンの解重合方法。
6. 【請求項６】 請求項１〜５記載の解重合方法によって
   得られ、紫外吸収スペクトルにて２５０ｎｍ〜３３０ｎ
   ｍの間に吸収を示すことを特徴とする、解重合ヘパリ
   ン。
7. 【請求項７】 平均分子量が約２,０００〜１３,０００
   ダルトンである、請求項６記載の解重合ヘパリン。
8. 【請求項８】 平均分子量が約５,０００〜１０,０００
   ダルトンである、請求項６記載の解重合ヘパリン。
9. 【請求項９】 下記特徴を有する解重合ヘパリン (１)紫外吸収スペクトルにて２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの
   間に吸収を示す (２)硫酸基含量が２０〜４０％ (３)ウロン酸含量が２０〜４５％ (４)ヘキソサミン含量が１０〜５０％
10. 【請求項１０】 請求項６〜９に記載の解重合ヘパリン
    をアミン化合物を用いてアミド化することを特徴とす
    る、アミド化解重合ヘパリンの製造方法。
11. 【請求項１１】 下記の工程を下記の順序で含む、請求
    項１０記載のアミド化解重合ヘパリンの製造方法。 (１)請求項６〜９に記載の解重合ヘパリンを約ｐＨ２〜
    ６の緩衝液に溶解 (２)アミン化合物を添加 (３)１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カ
    ルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)を添加
12. 【請求項１２】 上記工程(３)の後に、さらに下記の工
    程を下記の順序で含む、請求項１１記載のアミド化解重
    合ヘパリンの製造方法。 (ａ)臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを添加 (ｂ)ヨウ化ナトリウムのエタノール溶液を添加 (ｃ)アルカリ化剤を添加 (ｄ)約ｐＨ３〜６.５に調整
13. 【請求項１３】 上記アミン化合物が第一級アミンであ
    る、請求項１０〜１２のいずれか１項記載のアミド化解
    重合ヘパリンの製造方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０〜１３記載のアミド化解重
    合ヘパリンの製造方法によって得られ、平均分子量２,
    ０００〜１８,０００ダルトンであることを特徴とす
    る、アミド化解重合ヘパリン。
15. 【請求項１５】 上記平均分子量５,０００〜１５,００
    ０ダルトンである請求項１４記載のアミド化解重合ヘパ
    リン。
16. 【請求項１６】 下記の特徴を有する請求項１４または
    １５記載のアミド化解重合ヘパリン。 (１)硫酸基含量が２０〜４０％ (２)ウロン酸含量が２０〜４５％ (３)ヘキソサミン含量が５〜５０％
17. 【請求項１７】 請求項６〜９に記載の解重合ヘパリン
    およびを含むことを特徴とする抗血液凝固剤。
18. 【請求項１８】 請求項１４〜１６に記載のアミド化解
    重合ヘパリンを含むことを特徴とする抗血液凝固剤。
19. 【請求項１９】 上記アミド化解重合ヘパリンがＦＳＡ
    ＭＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＰＡ、ＦＳＬＰＧ、ＦＳＰＥＡ
    およびＦＳＤＰＧである、請求項１８記載の抗血液凝固
    剤。
20. 【請求項２０】 請求項６〜９に記載の解重合ヘパリン
    を含むことを特徴とする腎疾患治療剤。
21. 【請求項２１】 請求項１４〜１６に記載のアミド化解
    重合ヘパリンを含むことを特徴とする腎疾患治療剤。
22. 【請求項２２】 上記アミド化解重合ヘパリンがＦＳ
    Ｆ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＬＰＧである、請求項２１記
    載の腎疾患治療剤。
23. 【請求項２３】 請求項６〜９に記載の解重合ヘパリン
    を含むことを特徴とする血小板凝集阻害剤。
24. 【請求項２４】 請求項１４〜１６に記載のアミド化解
    重合ヘパリンを含むことを特徴とする血小板凝集阻害
    剤。
25. 【請求項２５】 上記アミド化解重合ヘパリンがＦＳ
    Ｆ、ＦＳＢＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＬＰ
    Ｇである、請求項２４記載の血小板凝集阻害剤。
26. 【請求項２６】 請求項６〜９に記載の解重合ヘパリン
    を含むことを特徴とするラジカルスカベンジャー剤。
27. 【請求項２７】 請求項１４〜１６に記載のアミド化解
    重合ヘパリンを含むことを特徴とするラジカルスカベン
    ジャー剤。
28. 【請求項２８】 上記アミド化解重合ヘパリンがＦＳ
    Ｆ、ＦＳＲ、ＦＳＤ、ＦＳＭ、ＦＳＳ、ＦＳＢＣ、ＦＳ
    ＡＭＣ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＰＡ、ＦＳＰＥＡ、ＦＳＬＰ
    Ｇ、ＦＳＤＰＧおよびＦＳＴＲである、請求項２７記載
    のラジカルスカベンジャー剤。
29. 【請求項２９】 請求項６〜９に記載の解重合ヘパリン
    を含むことを特徴とするメサンギウム細胞増殖抑制剤。
30. 【請求項３０】 請求項１４〜１６に記載のアミド化解
    重合ヘパリンを含むことを特徴とするメサンギウム細胞
    増殖抑制剤。
31. 【請求項３１】 上記アミド化解重合ヘパリンがＦＳ
    Ｆ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧである、請求項３０記
    載のメサンギウム細胞増殖抑制剤。
32. 【請求項３２】 請求項６〜９に記載の解重合ヘパリン
    を含むことを特徴とする補体活性抑制剤。
33. 【請求項３３】 請求項１４〜１６に記載のアミド化解
    重合ヘパリンを含むことを特徴とする補体活性抑制剤。
34. 【請求項３４】 上記アミド化解重合ヘパリンがＦＳ
    Ｆ、ＦＳＢＣＫ、ＦＳＢＣ、ＦＳＭ、ＦＳＴＲ、ＦＳ
    Ｄ、ＦＳＬＰＧおよびＦＳＤＰＧである、請求項３６記
    載の補体活性抑制剤。