CN102286109A

CN102286109A - 一种螺旋藻活性多糖及其制备方法

Info

Publication number: CN102286109A
Application number: CN 201110163760
Authority: CN
Inventors: 叶舟; 吕千; 赖建美; 蓝吓良; 黄裕新; 李会霞; 俞白楠
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-06-17
Also published as: CN102286109B

Abstract

本发明涉及一种螺旋藻活性多糖及其制备方法，引入活性评价指标，通过探讨原料前处理方法、不同提取加工工艺对螺旋藻多糖得率、多糖保存率、蛋白脱除率及多糖抗脂质过氧化作用的影响，评价和筛选既能很好保持螺旋藻多糖生物活性，又具备较高螺旋藻多糖得率的提取加工工艺，以优选工艺条件制备的螺旋藻活性多糖，其主要活性成分是两种分子量分别为100000和95000结合蛋白多糖，具有显著的抗肝组织脂质过氧化活性，两结合蛋白多糖为螺旋藻抗脂质过氧化活性多糖产品质量控制指标成分。与现有工艺探讨方法相比，本发明重视提取、分离、纯化过程对螺旋藻多糖活性的保护，通过综合评价优化制备工艺条件，能大大减少工艺探讨的盲目性和在提取纯化过程中造成的活性成分破坏与丢失。

Description

一种螺旋藻活性多糖及其制备方法

技术领域

本发明属于天然产物制备领域，更具体涉及一种螺旋藻活性多糖及其制备方法。

背景技术

多糖是生物体内重要的生物大分子，是动植物中的支持组织和重要的能量来源。近年来，有关多糖及糖复合物的大量研究表明，多糖有特殊的生物活性，能提高机体的免疫功能，一切重要的生命活动过程都有糖的参与。人们对多糖的研究早期多集中于药用植物类多糖的生物活性方面，如对黄芪、灵芝多糖的活性研究。随着海洋药物的兴起，对海藻多糖的活性研究已成为目前药物研究的重点。关于螺旋藻多糖的药理研究和制备工艺研究已有大量的文献报道，但针对药理活性与提取、分离方法间联系的相关研究还未见报道，不完善的药理和工艺研究导致现有工艺加工所得螺旋藻多糖的生物活性大大降低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明将生物活性的检测贯穿于螺旋藻多糖的整个提取、分离过程，在综合考虑多糖得率和生物活性的基础上，最大程度的保留了制备的螺旋藻多糖的生物学活性，大大减少工艺的盲目性和在提取纯化过程中造成的活性成分的破坏与丢失，使制备的多糖具有良好的开发应用前景。

本发明是通过如下技术方案实施的：

一种螺旋藻活性多糖的制备方法包括螺旋藻鲜料冻融破壁处理、螺旋藻粗多糖微波提取、螺旋藻粗多糖脱蛋白处理、螺旋藻活性多糖冷冻干燥四步骤，在多糖提取、脱蛋白结束后，分别检测各试验多糖样的生物活性，以提取物得率、生物活性检测值综合评分得分高的工艺条件，作为螺旋藻活性多糖的优化微波提取条件；以多糖保存率、生物活性检测值、蛋白脱除率综合评分得分高的工艺条件，作为螺旋藻活性粗多糖的优化脱蛋白条件；

所述提取物得率，生物活性检测值综合评分得分高，是指评分时以各指标测定值的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重，提取物得率权重系数设为0.4，脂质过氧化抑制率权重系数设为0.6，加权求和计算得分，得最高分；

所述多糖保存率、生物活性检测值、蛋白脱除率综合评分得分高，是指评分时以各指标测定值的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重，多糖保存率的权重系数设为0.3，脂质过氧化抑制率的权重系数设为0.3、蛋白脱除率的权重系数设为0.4，加权求和计算得分，得最高分。

所述检测多糖生物活性的方法包括以抗脂质过氧化活性作为产品标示的主要活性指标，以TBA法测定抗小鼠肝组织脂质过氧化活性作为活性试验方法。

所述优化微波提取条件为：微波功率：200-600W，提取时间 3-7min。

所述优化脱蛋白条件是将微波提取后的提取液用铵盐沉淀蛋白，沉淀后的提取液减压浓缩，用一次Sevag法处理进行脱蛋白。

所述铵盐的质量浓度为5-15%，铵盐沉淀蛋白的时间为10-20min。

所述的螺旋藻活性多糖其主要活性成分是分子量分别为100000和9500的结合蛋白多糖。

本发明的优点为：

1）本发明制备的螺旋藻活性多糖具很好的抗脂质过氧化活性，有明确的产品标示主要活性。工艺评价过程选择可靠的活性试验方法，并充分考虑了选择方法与抗肿瘤、提高免疫力活性的联系，重视生物活性试验供试材料制备条件与活性试验结果联系的探讨，避免加工过程活性成分的破坏与丢失，保证原料活性成分完整（活性的保持与高得率获得活性多糖），高效益的生产螺旋藻活性多糖；

2）在制备工艺中，通过加入铵盐初步沉淀的蛋白可复性利用，有利于资源的高效利用；

3）本发明制备的螺旋藻活性多糖、可作为原料药或食品添加剂提供给制药与食品加工企业，生产不同药物或功能性食品；

4）本发明提出的螺旋藻活性多糖加工工艺优化方法和主要工作思路，不仅适用于本发明，而且同样适用于其他涉及螺旋藻活性多糖加工工艺的探讨，不同形式的螺旋藻活性多糖产品，如抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗突变、提高免疫力等螺旋藻活性多糖产品，通过调整活性试验的方法，即可方便的完成相关工艺的优化、制备工作。

附图说明

图1为微波提取正交试验因素水平表；

图2为L₉(3⁴)正交试验设计表及结果；

图3为综合评分方差分析表，注：F_0.05(2.2)＝19.0；

图4为不同脱蛋白处理工艺对螺旋藻活性提取物多糖保存率、蛋白脱除率及活性的影响。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不局限于此实施例。

1）、称取螺旋藻鲜藻500g，加1000mL水搅匀，于-20℃冻融处理2次，加鲜藻3倍量的水后，依正交试验设计的因素和水平，分别调节溶液pH 8-12、400-1000w微波提取2-8min后（见图1），4000rpm离心15min，弃沉淀，取上清液；

2）、取1）所得正交试验各上清液样，减压浓缩至1/3体积，加入3倍量95%乙醇，4℃静置6h，4000rpm离心15min，得各沉淀分离样，测定各沉淀分离样活性提取物得率和抗肝组织脂质过氧化活性，综合评价确定优化提取条件，相关试验结果见图2、图3；以优化条件提取制备活性提取物，冷冻干燥即得螺旋藻活性多糖；该螺旋藻活性多糖其主要活性成分是分子量分别为100000和9500的结合蛋白多糖，其中分子量为100000多糖含量≥9.38%，分子量为9500的多糖含量≥22.12%。

3）、取2）优化条件下制备所得螺旋藻上清液，快速搅拌下缓慢加入粉末状固体硫酸铵，使硫酸铵浓度达10%，沉淀部分蛋白，4000rpm离心15min，弃沉淀（去除的蛋白可复性利用），取上清液；

4）、取3）所得上清液，分别以Sevag法一次、Sevag法四次、三氯乙酸法、酶法进行脱蛋白处理，4000rpm离心15min后，测定各脱蛋白样多糖保存率、蛋白脱除率和抗肝组织脂质过氧化活性，综合评价确定优化脱蛋白工艺条件；以优化工艺条件对3）所得上清液进行脱蛋白处理：经试验后所选择的最终条件为：将3）所得上清液减压浓缩至1/3体积，与氯仿-正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=4:1）等体积混合后，剧烈震荡5min，静置2h后，4000rpm离心15min，离心液加3倍体积95%乙醇，醇析24h，4000rpm离心15min，丙酮洗涤沉淀，沉淀冷冻干燥即得脱蛋白螺旋藻活性多糖。该脱蛋白螺旋藻活性多糖主要活性成分是的分子量分别为100000和9500的结合蛋白多糖，其中分子量100000的结合蛋白多糖含量≥19.51%，分子量为9500结合蛋白多糖含量≥46.02%。相关结果见图4。

分别测定螺旋藻活性提取物总量和提取物抗肝组织脂质过氧化活性，计算螺旋藻活性提取物得率和抑制率，进行多指标综合评分。评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重。提取物得率的权重系数设为0．4，抑制率的权重系数设为0.6，以综合分进行统计分析，结果见图2、图3。

其中综合评分Y=0.4X_l×100／0.2037＋0.6X₂×100／0.4189，公式1）

直观分析表明，综合评分，在所选因素水平范围内，微波处理时间对螺旋藻活性提取物提取效果影响最大，提取液pH影响次之，微波功率影响最小。经方差分析，各因素没有显著性，故以直观分析选取最佳提取条件为A₁B₂C₂ ，即: 微波功率为560w、提取时间为4min、提取液pH10。

微波处理时间对螺旋藻活性提取物提取效果影响最大，从正交试验该因素三水平综合评分趋势和单因素试验看，该因素水平定为微波处理4 min是适宜的。微波功率影响不大，从能耗控制的角度考虑，可以进一步降低至400w水平，提取溶液pH影响不大，从活性保持和中和后处理有利考虑，可选择pH10。微波提取具有穿透力强、选择性好、高效率的特点。

对于脱蛋白的工艺选择（见图4），参考公式1的计算方式，由计算结果可知，脱蛋白方法选择Sevag法1次操作具有较高的多糖保存率和很好的蛋白脱除率，且抗肝组织脂质过氧化活性能得到很好的保持，故选择Sevag法1次操作作为脱蛋白螺旋藻活性提取物的脱蛋白加工工艺。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1. 一种螺旋藻活性多糖的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括螺旋藻鲜料冻融破壁处理、螺旋藻粗多糖微波提取、螺旋藻粗多糖脱蛋白处理、螺旋藻活性多糖冷冻干燥四步骤，在多糖提取，脱蛋白结束后检测多糖的生物活性，以提取物得率、生物活性检测值综合评分得分高的工艺条件，作为螺旋藻活性多糖的优化微波提取条件；以多糖保存率、生物活性检测值、蛋白脱除率综合评分得分高的工艺条件，作为螺旋藻活性粗多糖的优化脱蛋白条件。

2.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性多糖的制备方法，其特征在于：所述提取物得率，生物活性检测值综合评分得分高，是指评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重，提取物得率权重系数设为0.4，脂质过氧化抑制率权重系数设为0.6，加权求和计算得分，得最高分。

3.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性多糖的制备方法，其特征在于：所述多糖保存率、生物活性检测值、蛋白脱除率综合评分得分高，是指评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重，多糖保存率的权重系数设为0.3，脂质过氧化抑制率的权重系数设为0.3、蛋白脱除率的权重系数设为0.4，加权求和计算得分，得最高分。

4.根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性多糖的制备方法，其特征在于：所述检测多糖生物活性的方法包括以抗脂质过氧化活性作为产品标示的主要活性指标，以TBA法测定抗小鼠肝组织脂质过氧化活性作为活性试验方法。

5. 根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性多糖的制备方法，其特征在于：所述优化微波提取条件为：微波功率：200-600W，提取时间 3-7min。

6. 根据权利要求1所述的一种螺旋藻活性多糖的制备方法，其特征在于：所述优化脱蛋白条件是将微波提取后的提取液用铵盐沉淀蛋白，沉淀后的提取液减压浓缩，用一次Sevag法处理进行脱蛋白。

7.根据权利要求6所述的一种螺旋藻活性多糖的制备方法，其特征在于：所述铵盐的质量浓度为5-15%，铵盐沉淀蛋白的时间为10-20min。

8.一种如权利1所述的制备方法制备的螺旋藻活性多糖，其特征在于：所述的螺旋藻活性多糖其主要活性成分是两种分子量分别为100000和9500的结合蛋白多糖。