CN105936652A - 一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法，属于生物工程技术领域。本发明用纳米二氧化硅负载胰蛋白酶，制得固定化胰蛋白酶酶解猪小肠黏膜液，再将酶解液经树脂吸附，再用氯化钠溶液洗脱解吸附，收集吸附液用超滤膜过滤分离，经乙醇沉淀、干燥一步纯化制得精品肝素钠。本发明利用固定化酶酶解猪小肠，且固定化胰蛋白酶方便回收，因无需高温灭酶，不会转变为杂质影响纯化工艺，又利用D﹣254型树脂可以吸附粗品肝素钠中杂质，提高了除杂率，解决了传统肝素钠提取率低、得率低和性质不稳定等问题，本发明提取的肝素钠纯度较高，性质稳定，操作过程简单，生产成本较低，适合大规模生产。

Description

一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法

技术领域

本发明公开了一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

肝素是一种广泛存在于哺乳动物组织中的黏多糖，具有抗凝血作用，被广泛用于手术和脑血栓、心肌梗死等的治疗。肝素钠以O-连接形式与核心蛋白形成肝素蛋白聚糖。目前还没有任何一种药物可以替代它，且尚不能人工合成，所以对于肝素钠的提取还是分离方法都有待进一步提高。肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质，外观为白色或灰棕色无定性粉末，无臭，无味，有吸湿性，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮和苯等有机溶剂。肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药，近年来研究证明肝素钠还有降血脂作用。肝素钠存在于动物的心、肝、脾、肺、胸腺、肌肉、血管等，但主要来源于动物富含肥大细胞的组织，如肝、肺、内肠等，以O-连接形式与核心蛋白形成肝素蛋白聚糖。肝素可以和百余种蛋白相互作用，呈现出降血脂、抗动脉粥样硬化、免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗单纯孢疹病毒、抗凝血等生物活性。肝素于1920年就开始其大规模制备研究，并于1935年应用于临床，是目前世界上产量和销售量最大的来自天然的糖类药物，目前还没有任何一种药物可以替代它，且尚不能人工合成。

目前，用肝素钠粗品生产低分子肝素钠的工艺有三种，即物理分离法、化学裂解法和合成法。物理分离法主要用于结构测定和生物活性的研究，合成法现在主要用于研究，还不能应用于工业生产。工业生产现用的化学裂解法和酶化学裂解法主要有过氧化物降解法，肝素酶降解法和B消除降解法等。但这些方法的生产周期长，产品得率低只有75~80％，纯度较低，工艺复杂，性质不稳定，生产成本高。

发明内容

本发明主要解决的技术问题：针对目前精品肝素钠提取存在着生产周期大，产品得率和纯率较低，提取的肝素钠工艺复杂生产成本高等问题，提供了一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法。本发明用纳米二氧化硅负载胰蛋白酶，制得固定化胰蛋白酶酶解猪小肠黏膜液，再将酶解液经树脂吸附，再用氯化钠溶液洗脱解吸附，收集吸附液用超滤膜过滤分离，经乙醇沉淀、干燥一步纯化制得精品肝素钠。本发明利用固定化酶酶解猪小肠，且固定化胰蛋白酶方便回收，因无需高温灭酶，不会转变为杂质影响纯化工艺，又利用D﹣254型树脂可以吸附粗品肝素钠中杂质，提高了除杂率，解决了传统肝素钠提取率低、得率低和性质不稳定等问题，本发明提取的肝素钠纯度较高，性质稳定，操作过程简单，生产成本较低，适合大规模生产。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

（1）称取0.2~0.3g胰蛋白酶，加入100~120mL去离子水中，以400~500r/min搅拌15~20min，加入5.0~7.5g纳米二氧化硅，继续搅拌2~3h，转入离心机中离心分离，取沉淀，得固定化胰蛋白酶，备用；

（2）称取300~500g新鲜猪小肠，用去离子水洗涤干净，切开，并用刮刀刮取小肠内壁黏膜，收集小肠内壁黏膜，加入200~300mL质量分数为3%氯化钠溶液中，并用匀浆机匀浆20~30min，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至7.0~7.5，

加热煮沸15~20min，待温度冷却至50~55℃，加入0.2~0.3g固定化胰蛋白酶，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.5~9.0，保持温度酶解4~5h，将混合液置于4000~5000r/min离心机中，在4~5℃下离心分离，清洗沉淀回收固定化胰蛋白酶，收集上清液，得猪小肠酶解液；

（3）向上述猪小肠酶解液中，加入1.2~1.8g D﹣254型树脂，在室温下以50~60r/min搅拌8~10h，静置30~40min，过滤，用去离子水和质量分数为5%氯化钠溶液洗涤树脂2~3次，再将树脂浸泡在8~12mL质量分数为20%氯化钠溶液中，以100~200r/min搅拌洗脱2~3次，每次3~4h，合并洗脱液，将洗脱液用膜通量为3000~4000的超滤膜过滤浓缩至原溶液体积的15~20%，收集截留液，加入30~50mL质量分数为95%乙醇溶液，静置10~12h，过滤，将沉淀置于真空干燥箱中干燥5~6h，得固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠。

本发明的应用方法是：将本发明制得的肝素钠精品与2.5‰苯酚进行杀菌混合，制得无色或者淡黄色澄明液体注射液，首次给药注射4000~8000单位，以后每8小时7000~9000单位，每12小时13000~18000单位，心肌梗死频率降低0.2~0.3%，还可以有效的防止了血栓的发生。

本发明的有益效果是：

（1）本发明制得的肝素钠精品纯率提高60~70%，得率提高了50~60%；

（2）肝素钠提取过程中，性质稳定，不发生成分改变；

（3）操作过程简单，生产周期短，成本低，适合大规模生产和使用。

具体实施方式

首先称取0.2~0.3g胰蛋白酶，加入100~120mL去离子水中，以400~500r/min搅拌15~20min，加入5.0~7.5g纳米二氧化硅，继续搅拌2~3h，转入离心机中离心分离，取沉淀，得固定化胰蛋白酶，备用；称取300~500g新鲜猪小肠，用去离子水洗涤干净，切开，并用刮刀刮取小肠内壁黏膜，收集小肠内壁黏膜，加入200~300mL质量分数为3%氯化钠溶液中，并用匀浆机匀浆20~30min，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至7.0~7.5，加热煮沸15~20min，待温度冷却至50~55℃，加入0.2~0.3g固定化胰蛋白酶，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.5~9.0，保持温度酶解4~5h，将混合液置于4000~5000r/min离心机中，在4~5℃下离心分离，清洗沉淀回收固定化胰蛋白酶，收集上清液，得猪小肠酶解液；向上述猪小肠酶解液中，加入1.2~1.8g D﹣254型树脂，在室温下以50~60r/min搅拌8~10h，静置30~40min，过滤，用去离子水和质量分数为5%氯化钠溶液洗涤树脂2~3次，再将树脂浸泡在8~12mL质量分数为20%氯化钠溶液中，以100~200r/min搅拌洗脱2~3次，每次3~4h，合并洗脱液，将洗脱液用膜通量为3000~4000的超滤膜过滤浓缩至原溶液体积的15~20%，收集截留液，加入30~50mL质量分数为95%乙醇溶液，静置10~12h，过滤，将沉淀置于真空干燥箱中干燥5~6h，得固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠。

实例1

首先称取0.2g胰蛋白酶，加入100mL去离子水中，以400r/min搅拌15min，加入5.0g纳米二氧化硅，继续搅拌2h，转入离心机中离心分离，取沉淀，得固定化胰蛋白酶，备用；称取300g新鲜猪小肠，用去离子水洗涤干净，切开，并用刮刀刮取小肠内壁黏膜，收集小肠内壁黏膜，加入200mL质量分数为3%氯化钠溶液中，并用匀浆机匀浆20min，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加热煮沸15min，待温度冷却至50℃，加入0.2g固定化胰蛋白酶，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.5，保持温度酶解4h，将混合液置于4000r/min离心机中，在4℃下离心分离，清洗沉淀回收固定化胰蛋白酶，收集上清液，得猪小肠酶解液；向上述猪小肠酶解液中，加入1.2g D﹣254型树脂，在室温下以50r/min搅拌8h，静置30min，过滤，用去离子水和质量分数为5%氯化钠溶液洗涤树脂2次，再将树脂浸泡在8mL质量分数为20%氯化钠溶液中，以100r/min搅拌洗脱2次，每次3h，合并洗脱液，将洗脱液用膜通量为3000的超滤膜过滤浓缩至原溶液体积的15%，收集截留液，加入30mL质量分数为95%乙醇溶液，静置10h，过滤，将沉淀置于真空干燥箱中干燥5h，得固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠。

本发明的应用方法是：将本发明制得的肝素钠精品与2.5‰苯酚进行杀菌混合，制得无色或者淡黄色澄明液体注射液，首次给药注射4000单位，以后每8小时7000单位，每12小时13000单位，心肌梗死频率降低0.2%，还可以有效的防止了血栓的发生。

实例2

首先称取0.25g胰蛋白酶，加入110mL去离子水中，以450r/min搅拌17min，加入6g纳米二氧化硅，继续搅拌2.5h，转入离心机中离心分离，取沉淀，得固定化胰蛋白酶，备用；称取400g新鲜猪小肠，用去离子水洗涤干净，切开，并用刮刀刮取小肠内壁黏膜，收集小肠内壁黏膜，加入250mL质量分数为3%氯化钠溶液中，并用匀浆机匀浆25min，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至7.3，加热煮沸17min，待温度冷却至53℃，加入0.25g固定化胰蛋白酶，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.7，保持温度酶解4.5h，将混合液置于4500r/min离心机中，在4.5℃下离心分离，清洗沉淀回收固定化胰蛋白酶，收集上清液，得猪小肠酶解液；向上述猪小肠酶解液中，加入1.5g D﹣254型树脂，在室温下以55r/min搅拌9h，静置35min，过滤，用去离子水和质量分数为5%氯化钠溶液洗涤树脂2.5次，再将树脂浸泡在10mL质量分数为20%氯化钠溶液中，以150r/min搅拌洗脱2.5次，每次3.5h，合并洗脱液，将洗脱液用膜通量为3500的超滤膜过滤浓缩至原溶液体积的17%，收集截留液，加入40mL质量分数为95%乙醇溶液，静置11h，过滤，将沉淀置于真空干燥箱中干燥5.5h，得固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠。

本发明的应用方法是：将本发明制得的肝素钠精品与2.5‰苯酚进行杀菌混合，制得无色或者淡黄色澄明液体注射液，首次给药注射6000单位，以后每8小时8000单位，每12小时15000单位，心肌梗死频率降低0.25%，还可以有效的防止了血栓的发生。

实例3

首先称取0.3g胰蛋白酶，加入120mL去离子水中，以500r/min搅拌20min，加入7.5g纳米二氧化硅，继续搅拌3h，转入离心机中离心分离，取沉淀，得固定化胰蛋白酶，备用；称取500g新鲜猪小肠，用去离子水洗涤干净，切开，并用刮刀刮取小肠内壁黏膜，收集小肠内壁黏膜，加入300mL质量分数为3%氯化钠溶液中，并用匀浆机匀浆30min，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至7.5，加热煮沸20min，待温度冷却至55℃，加入0.3g固定化胰蛋白酶，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至9.0，保持温度酶解5h，将混合液置于5000r/min离心机中，在5℃下离心分离，清洗沉淀回收固定化胰蛋白酶，收集上清液，得猪小肠酶解液；向上述猪小肠酶解液中，加入1.8g D﹣254型树脂，在室温下以60r/min搅拌10h，静置40min，过滤，用去离子水和质量分数为5%氯化钠溶液洗涤树脂3次，再将树脂浸泡在12mL质量分数为20%氯化钠溶液中，以200r/min搅拌洗脱3次，每次4h，合并洗脱液，将洗脱液用膜通量为4000的超滤膜过滤浓缩至原溶液体积的20%，收集截留液，加入50mL质量分数为95%乙醇溶液，静置12h，过滤，将沉淀置于真空干燥箱中干燥6h，得固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠。

本发明的应用方法是：将本发明制得的肝素钠精品与2.5‰苯酚进行杀菌混合，制得无色或者淡黄色澄明液体注射液，首次给药注射8000单位，以后每8小时9000单位，每12小时18000单位，心肌梗死频率降低0.3%，还可以有效的防止了血栓的发生。

Claims (1)

1.一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法，其特征在于具体制备步骤为：

（1）称取0.2~0.3g胰蛋白酶，加入100~120mL去离子水中，以400~500r/min搅拌15~20min，加入5.0~7.5g纳米二氧化硅，继续搅拌2~3h，转入离心机中离心分离，取沉淀，得固定化胰蛋白酶，备用；

（2）称取300~500g新鲜猪小肠，用去离子水洗涤干净，切开，并用刮刀刮取小肠内壁黏膜，收集小肠内壁黏膜，加入200~300mL质量分数为3%氯化钠溶液中，并用匀浆机匀浆20~30min，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至7.0~7.5，

加热煮沸15~20min，待温度冷却至50~55℃，加入0.2~0.3g固定化胰蛋白酶，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.5~9.0，保持温度酶解4~5h，将混合液置于4000~5000r/min离心机中，在4~5℃下离心分离，清洗沉淀回收固定化胰蛋白酶，收集上清液，得猪小肠酶解液；

（3）向上述猪小肠酶解液中，加入1.2~1.8g D﹣254型树脂，在室温下以50~60r/min搅拌8~10h，静置30~40min，过滤，用去离子水和质量分数为5%氯化钠溶液洗涤树脂2~3次，再将树脂浸泡在8~12mL质量分数为20%氯化钠溶液中，以100~200r/min搅拌洗脱2~3次，每次3~4h，合并洗脱液，将洗脱液用膜通量为3000~4000的超滤膜过滤浓缩至原溶液体积的15~20%，收集截留液，加入30~50mL质量分数为95%乙醇溶液，静置10~12h，过滤，将沉淀置于真空干燥箱中干燥5~6h，得固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠。