KR930001320B1 - 두충을 이용한 히알루론산의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 발효법을 이용하여 얻은 히알루론산의 적외선 스펙트럼이다.
제2도는 본 발명에 따라서 두충의 잎에서 추출하여 얻은 히알루론산의 적외선 스펙트럼이다.
제3도는 본 발명에 따라서 두충의 껍질에서 추출하여 얻은 히알루론산의 적외선 스펙트럼이다.
본 발명은 히알루론산의 새로운 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 한약재로 쓰이는 두충을 이용하여 히알루론산을 얻는 방법에 관한 것이다.
한약재의 상업화는 제반적인 어려움으로 그 속도가 느리다. 그같은 요인들로서는, 표준화의 결여, 미흡한 화학적 구조규명, 품질관리 문제, 전문요원의 부족, 약재의 제한된 공급 등을 들 수 있다. 이같은 문제점을 근본적으로 극복하려면, 우선 특정 한약재의 주된 생리 활성물질을 규명하고, 그같은 특정 활성물질을 화학적 또는 물리적 방법으로 추출해냄으로써 특정 한약재의 상업화가 가능하다. 두충의 약효에 대해서는 약학대사전이나 동의보감 등에 상세히 나타나 있다. 또한 두충의 화학적 성분에 대한 연구도 상당히 이루어져 그 결과가 다음 문헌에 알려져 있다 : Acta Botanica Sinica, 28(5), 528-532, 1986 ; Phytochemistry, 21(1), 201-203, 1982 ; Chem, Pharm. Bull., 35(5), 1785-1789, 1987 ; Acta pharmaceutical Sinica, 21(9), 708-711, 1986. 이들 연구결과는 두충이 피노레시놀(Pinoresinol)유도체를 함유하고 있음을 밝히고 있으나 히알루론산의 존재에 대해서는 전혀 언급하거나 제시한 바가 없다.
따라서, 본 발명은 한방에서 고혈압 치료제 및 강장제로 사용되는 두충에 히알루론산이 존재한다는 새로운 사실의 발견에 기초를 두고 있다. 또한, 본 발명은 두충에 히알루론산이 존재함을 규명하므로써 두충을 이용한 히알루론산의 상업적 생산방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
히알루론산은 고점도성, 보습성, 생체 적응성 등의 특징을 지닌 수용성 다당류의 생체 고분자 물질로서 콜라겐 및 엘라스틴과 함께 피부 삼대 요소중의 하나이다. 히알루론산은 글루쿠론산 및 아세틸 글루코사민이 상호베타 결합으로 이뤄진 가지 달리지 않은 직쇄상의 긴 고분자 물질로서, 그 분자량은 원료 및 정제방법에 따라 수만에서 수백만에 이른다. 히알루론산의 주요 용도로는 안과 수술용, 경주용 말의 무릎 관절 치료용, 화장품의 보습제 등을 들수 있다(미합중국 특허 제4,141,973호 및 미합중국 특허 제4,517,295호 참조). 한편 발효법이나 동물조직의 추출법에 의하여 얻은 히알루론산을 0.5∼3% 함유한 용액을 쥐에게 투여하면 쥐의 중성지방 및 인지질이 감소되어 혈압강하 효과를 나타낸다는 사실이 알려져 있다(일본 특허 제61-47418호).
본 발명자들은 두충 특히, 껍질부분과 잎에 히알루론산이 존재하고 있음을 발견하게 되었다. 껍질의 경우, 서로 얽힌 실모양의 각질속에 히알루론산이 존재하기 때문에 추출하기는 어려우나 순도면에서는 잎의 것(0.93%)보다 고순도(17%)의 것이다.
본 발명에 따른 히알루론산의 제조방법은 두충을 통상적인 방법으로 중탕 침지시켜 얻은 상등액에 히알루론산만을 선별적으로 침전시키는 침전제를 첨가하는 것을 포함한다. 보다 상세하게는, 두충원료(예를들어, 잎 또는 껍질)를 잘게 자르고 중탕시킨 다음 찌꺼기를 제거하여 상등액을 얻고, 바람직하게는 이 상등액을 활성탄으로 처리하여 색깔 및 불순물 등을 일차적으로 제거한다. 이어서, 히알루론산 만을 선별적으로 침전시키는 침전제, 바람직하게는 세틸 피리디늄 클로라이드(CPC)와 같은 계면활성제와 염화나트륨을 가하여 히알루론산을 침전시킴으로써 히알루론산을 얻는다. 이때 얻은 히알루론산을 더욱 정제시킬수도 있다. 예를들면, 침전된 히알루론산을 NaCl, BaCL2또는 CaCl2와 같은 염 용매에 용해시킨 다음 차가운 에탄올을 가하여 히알루론산을 재침전시킴으로써 정제시킬수 있다.
지금까지 히알루론산을 얻는데 흔히 사용되어온 방법은 동물조직으로부터 추출하거나 균주를 이용한 발효법이다. 발효법을 이용하면 통상 1ℓ기준의 배양육즙으로부터 순수 히알루론산 1 내지 1.2g을 얻을 수 있다. 한편, 본 발명의 방법을 이용하여 두충으로부터 히알루론산을 회수하는 비율은 약 0.01 내지 약 0.1%정도로 상당히 낮다. 그러나 이 비율은 두충 2g을 정제하여 20 내지 200㎎의 순수 히알루론산을 얻음을 뜻하므로 이는 발효법에 상응하는 결과이다. 결국 본 발명은 발효법에 의해 고가로 제조되는 히알루론산을 흔한 한약재로 대체하므로써 보다 경제적으로 히알루론산을 제조하는 잇점을 제공한다.
하기 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하면, 이 실시예에 의해 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.
[실시예 1]
이 실시예는 두충의 잎에 히알루론산이 존재함을 보여준다.
두충의 잎 50g을 잘게 자른다음 8시간 정도 중탕했다. 그후 여과지로 여과한 다음 원심분리하여 얻은 상등액에 상등액 ㎖당 3M NaCl 10㎕ 및 10% 세틸 피리디늄 클로라이드(CPC) 80㎕를 첨가하여 잘 섞었다. 상온에서 1시간 방치후 원심분리하여 얻은 침전물에 2M CaCl250㎖를 가하여 넣고 완전히 용해시켰다. 이것을 여과지로 여과한 다음 차가운 에탄올 2배 부피를 넣어 잘 섞고 이를 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이때 얻은 히알루론산을 냉동 건조 및 고온 건조에 의해 분말상태로 만들어 적외선 스펙트럼을 얻었다. 그 결과는 제2도에 나와 있으며 이는 현행 발효법에 의해 제조된 히알루론산의 적외선 스펙트럼(제1도로 나타냄)과 동일함을 알 수 있다. 즉, 본 실시예에서 수득한 물질이 히알루론산임을 명백히 보여준다.
히알루론산의 정량을 위해 상기 수득한 분말에 증류수 2.5㎖를 가하여 카바졸(carbazole) 발색반응을 실시했다. 실험결과는 표 1에 나와있다.
[표 1 잎으로 부터의 히알루론산의 회수율 및 순도]
[실시예 2]
이 실시예는 두충의 껍질에 히알루론산이 존재함을 보여준다.
두충의 껍질 32.2g을 잘게 자른다음 8시간 정도 중탕했다. 그후 여과지로 여과한 다음 원심분리하여 얻은 상등액에 상등액 ㎖당 3M NaCl 10㎕ 및 10%세틸 피리디늄 클로라이드 40㎕를 첨가한 후 잘 섞었다.
상온에서 2시간 방치한 후 원심분리하여 얻은 침전물을 2M CaCl250㎖에 완전히 용해시켰다. 이것을 여과지로 여과한 다음 차가운 에탄올 2배 부피를 첨가하여 잘섞고 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이때 얻은 침전물을 더욱 정제하기 위한 이 침전물을 증류수 50㎖에 완전히 용해시키고, 여과지로 여과한 다음 활성탄 10g에 통과시킨 후 원심분리하여 상등액을 얻었다. 여기에 차가운 에탄올 2배 부피를 첨가하여 잘섞고 원심분리하여 침전물을 얻었다.
이것을 냉동건조와 고온건조를 통해 분말상태로 만들어서 적외선 스펙트럼을 얻었다(제3도). 제3도의 스펙트럼과 제1도의 스펙트럼으로부터 본 실시예에서 얻은 물질이 히알루론산 임을 확인할 수 있다.
히알루론산의 정량을 위해, 상기 수득한 분말을 증류수 9.3㎖에 녹인후 카바졸 발색반응을 실시했다.
실험결과는 표 2에 나와 있다.
[표 2 껍질로부터의 히알루론산의 회수율 및 순도]
[실시예 3]
이 실시예는 두충의 잎과 껍질을 동시에 처리하여 히알루론산을 얻는 방법을 보여준다.
두충의 잎 1.58g과 껍질 0.88g을 각각 잘게 자른다음 8시간 정도 중탕했다. 이를 원심분리하여 얻은 상등액에 활성탄 0.5g을 넣었다. 30분간 방치한 후 원심분리하여 얻은 상등액에 상등액 ㎖당 3M NaCl 10㎕ 및 10% CPC 80㎕를 첨가한 후 잘 섞었다. 상온에서 1시간 방치후 원심분리하여 얻은 침전물에 2M CaCl2 1.5㎖를 넣고 완전히 용해시켰다. 이것을 원심분리하여 얻은 상등액에 차가운 에탄올 3㎖를 첨가하였다. 이를 원심분리하여 침전물을 얻었다.
Claims (7)
- 두충을 침출시켜 얻은 상등액에, 히알루론산을 선별적으로 침전시키는 침전제를 가하는 단계를 포함하여 두충으로부터 히알루론산을 얻는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 두충의 원료로 두충의 잎 또는 줄기 껍질을 사용하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 침전제가 계면활성제와 염화나트륨인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 계면활성제가 세틸 피리디듐 클로라이드인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 침전시켜 얻은 히알루론산을 정제시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 정제를 염용매와 에탄올을 사용하여 실시하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 염용매가 CaCl2또는 BaCl2인 방법.
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