KR940001730B1

KR940001730B1 - 괄루근으로부터 생체활성다당의 제조방법

Info

Publication number: KR940001730B1
Application number: KR1019910011988A
Authority: KR
Inventors: 곽의종; 한창균
Original assignee: 주식회사 선경인더스트리; 이승동
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1991-07-15
Publication date: 1994-03-05
Also published as: KR930002368A

Abstract

내용 없음.

Description

괄루근으로부터 생체활성다당의 제조방법

제1도는 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 괄루근 다당의 페이퍼 전기영동데이터이다.

제2도는 본 발명의 실시예 2에서 얻어진 괄루근 다당의 IR 데이터이다.

본 발명은 괄루근으로부터 생체활성 다당을 분리, 정제하여 제조하는 방법에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 한약재로 사용되는 괄루근(일명 천화분)으로부터 유효생체 활성물질인 괄루근 다당을 고순도 고수율로 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.

괄루근은 동속 근연식물(박과)의 다년생 초본식물의 뿌리로서 우리나라에서는 제주도와 중북부산지 또는 수림아래에 야생으로 존재하고 있으며, 그 주요성분으로는 스티그마스테롤(Stigma sterol), 스피나스테롤(Spinasterol), 여러지방산, 사포닌(Saponin), 폴리사카라이드(Polysaccharide), 갈락토오즈 결합렉틴(Galactose binding lectin), 트리코산틴(Trichosanthin), 트립신 저해제(Trypsin inhibitor) 등이 알려져 있다.

이러한 괄루근을 탕제로 사용할 경우 동의보감등에 나타난 한의학적 약리작용으로는 청량, 지갈, 해열, 이뇨, 진혈, 중풍치료, 구담, 당뇨병치료등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 현대의학에서는 괄루근 중에서 트리코산틴을 분리, 정제하여 낙태제 등에 유효생체 활성물질로 이용하고 있을 뿐만아니라, 괄루근의 엑기스를 맥문동등과 복합처방에 의하여 당뇨병치료제로서 이용되기도 하고 있으며, 일반적인 폴리사카라이드(Polysaccharide)의 면역 촉진작용(Immuno stimulant effect)이 알려져 있는바, 본 발명은 괄루근으로부터 이러한 생체활성 폴리사카라이드를 고순도, 고수율로 분리 정제하는 방법의 개발과 이 물질들의 면역 촉진작용의 연구에서 이루어진 것이다.

한편, 이와 같은 생체활성 다당을 괄루근으로부터 분리하는 방법이 일부 학술문헌에 공지되어 있는바, 이 방법에 따르면 괄루근을 노르말-헥산(n-hexane)으로 추출하여 지질등의 비극성물질을 제거한후 수산화나트륨(NaOH) 용액으로 추출하여 에칠알콜(Ethyl alcohol)을 이용 조침전물을 얻은후, 이를 다시 물에 녹여 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid) 등으로 침전을 얻어 정제한 다음에, 다시 에칠 알콜을 이용 침전을 형성하여 투석후 동결건조시키는 방법을 취하거나, 세파덱스 컬럼(Sephadex column) 또는 이온교환 컬럼(Ion exchange column) 등을 통과시켜 정제하는 방법이 있으나, 이러한 방법들은 공업적으로 비경제적일 뿐만아니라 목적하는 물질의 파손등을 초래할 수 있으며, 그 정제과정이 부적당하여서 핵산, 단백질 등의 불필요한 물질의 혼입가능성이 크므로 대량생산의 조건이 되지 못하고 부적당한 조침전물 분획을 취하게 되므로써 그 순도 및 수율도 떨어지기 때문에 개선의 여지가 많았다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래의 방법에서의 문제점을 해소하기 위해, 괄루근으로부터 유효 생체활성 다당을 고순도 고수율로 분리 정제함에 있어서, 공업적 경제성을 높이기 위하여 아세톤(acetone) 또는 메칠알콜(Methyl alcohol) 등과 같은 저렴한 가격의 용매를 이용하였을 뿐만아니라 세파덱스 또는 이온교환 수지의 컬럼을 이용하지 않고도 고순도 고수율로 정제하는 아주 효율적이고 간소한 방법을 개발하였고, 이렇게 하여 얻어진 다당의 쥐에 대한 in vivo 또는 in vitro 실험을 통하여 생체 활성도를 입증함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 괄루근으로부터 생체활성 다당을 분리 정제함에 있어서, 간단하고 경제적인 방법으로 고순도 고수율의 다당을 분리 정제하는 방법 및 그 활용방안을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 괄루근으로부터 생체활성 다당을 분리함에 있어서, 마쇄한 괄루근 파우더에 증류수를 4∼7㎖/g 비율로 가하고 환류 추출한다음, 이를 원심분리하여 세포잔사를 제거하고 여액에 저급알콜 1.9∼2.3 부피비를 적가한후 생성된 침전물을 여과하고 아세톤 또는 에테르로 침전물을 세척하여 괄루근 다당 조침전물을 분리하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 마쇄한 괄루근 파우더를 증류수를 4∼7㎖/g 비율로 가하고 환류 추출한다음, 이를 원심분리하여 세포잔사를 제거하고 여액에 저급케톤 1.0∼1.2 부피비를 적가한다음 생성된 침전물을 여과하고, 이 상등액에 다시 저급알콜 0.9∼1.2 부피비를 적가하고 여과한다음 아세톤 또는 에테르로 침전물을 세척하여 괄루근 다당 조침전물을 분리하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기의 과정을 거쳐 분리한 조침전물을 수산화나트륨 수용액에 용해시킨후 수산화바륨과 황산아염을 첨가하고 원심분리하여 침전물과 불용물을 제거한다음, 저급알콜을 적가하여 정제된 다당 침전물을 수거한후, 이를 증류수상에서 투석하여 염이나 저분자 물질을 제거하여 생체활성 괄루근 다당을 정제하는 것을 포함한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

건조 괄루근을 표면적을 크게하여 추출 효율을 높이기 위하여 분쇄기를 이용하여 마분쇄한후 4∼7㎖/g의 비율로 증류수를 첨가하고 4시간씩 2회 환류 추출한후 원심분리하여 세포잔사를 제거한후 저급알콜 1.9∼2.3 부피비를 적가하여 생성된 침전물을 여과한후 소량의 아세톤 및 에테르를 이용하여 씻어주어 다당의 조침전물을 얻는다.

이때, 상기 증류수의 첨가량이 4㎖/g 미만일 경우에는 페이스트(Paste) 상태가 되어 추출효율이 훨씬 떨어지는 등의 문제가 있고, 7㎖/g을 초과할 경우에는 지나치게 많은 용매의 사용등 경제성에 문제가 있을 뿐만아니라 다음 정제 과정에서 불순물의 혼입 등으로 순도에도 영향을 미치게 되는 문제가 있다. 또한 상기 저급알콜의 첨가량이 1.9 부피비 미만일 경우에는 원하는 다당분획의 침전형성이 완전히 이루어지지 않기 때문에 수율이 저하될 우려가 있고 2.3 부피비를 초과하면 원치않는 불순물 분획의 초과혼입의 가능성이 커지므로 정제 과정이 복잡해지고 순도가 떨어지는 문제가 있다.

한편, 보다 정제된 다당의 조침전물을 얻기 위해서 상기 세포잔사를 제거한 상등액에 1∼1.2 부피비의 저급케톤을 적가한후 생성되는 단백질이 많은 침전물을 원심분리하여 제거하고, 이 상등액에 다시 0.9∼1.2 부피비의 저급알콜을 적가하고 여과한후 소량의 에테르와 아세톤으로 씻어준다.

이때 상기 저급케톤 첨가량이 상기 범위 미만이면 원치않는 단백질 분획의 과다혼입을 유발하고 저급알콜의 첨가량이 상기 범위미만이면 원하는 다당분획의 손실이 발생하게 되며, 또한 저급케톤의 첨가량이 상기 범위를 초과하면 원하는 다당분획의 손실을 초래하게 되는 문제가 있고 저급알코올의 첨가량이 상기 범위를 초과하면 원치않는 불순물 분획의 혼입이 유발되어 순도가 떨어지게 되는 문제가 있다.

이와 같은 과정을 거쳐 제조한 상기의 다당 조침전물을 차가운 0.1N의 수산화나트륨용액에 5℃에서 용해시킨후 0.5%(w/v)의 수산화바륨과 0.25%(w/v)의 황산아연을 첨가하여 잘 녹이고, 5℃에서 2시간 방치시켜 생성되는 침전물 및 불용물을 원심분리하여 제거한후, 2(두께의) 부피비의 저급알콜을 적가한후 5℃에서 12시간 방치시켜 생성되는 정제된 다당 침전물을 수거한다음, 이를 증류수 상에서 투석하여 잔존할 수 있는 염이나 저분자 물질을 제거한후 냉동 건조시키면 생체활성 괄루근 다당을 얻을 수 있다.

여기서 상기 수산화나트륨은 생체활성 다당의 물에 대한 용해도가 좋지않기 때문에, 물에 녹일 경우 그 작업 부피가 지나치게 커지므로 상대적으로 용해도가 좋은 수산화나트륨 용액을 사용하는바, 그 농도가 상기의 범위를 벗어나면 용해도가 낮아지거나 가수분해를 유발할 수 있는 문제가 생기고, 수산화바륨과 황산아연은 단백질 핵산등의 제거 목적으로 첨가하는바 사용량이 상기의 범위를 벗어나면 정제가 잘 되지 않아 불순물의 혼입 가능성이 커지게되는 문제가 생긴다.

상술한 바와 같이 본 발명에 의하면 괄루근으로부터 생체활성 다당을 추출정제함에 있어서 매우 간단하고도 경제적인 방법으로 고순도 고수율로 얻을 수 있으며, 이 다당은 면적 증강 효과가 있음을 쥐에 대한 실험을 통하여 확인하였으므로 항암 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

건조 괄루근을 잘게 자른후 웨어링 혼합기(waring blender)를 이용하여 미세하게 마쇄한후 100g을 700㎖의 증류수에 넣어 4시간동안 2회에 걸쳐 환류추출시킨후 원심분리(3000rpm, 30분)하여 세포잔사등을 제거시키고 여액에 2600㎖의 메칠알콜을 적가시켜 생성된 침전물을 여과하고, 침전물을 50㎖의 에테르 및 50㎖ 아세톤으로 균일하게 분산시키면서 씻어주어 불순물을 제거시키면 약 15g의 괄루근 다당 조침전물을 얻는다.

이 침전물을 다시 300㎖의 찬 0.2N 수산화나트륨 용액에 5℃에서 용해시킨후 300㎖의 7% TCA 용액 3g의 수산화바륨과 1.5g의 황산아연을 첨가시킨후 잘녹인다음 5℃에서 2시간 방치시켜 생성되는 침전물 및 불용물을 원심분리하여 제거하고 1,200㎖의 메칠알콜을 적가시킨후, 5℃에서 12시간 방치시켜 생성되는 정제된 다당침전물을 원심분리하여 모은 뒤 80% 메칠알콜 100㎖에 완전히 분산시킨다음 여과하여 80% 메칠알콜용액에 가용 불순물을 제거한후 증류수상에서 투석시켜 잔존할 수 있는 염등과 저분자 물질을 제거하고 냉동건조하여 생체활성 괄루근 다당 1.92g을 얻었다.

[실시예 2]

건조 괄루근을 잘게 자른후 웨어링 혼합기(waring blender)를 이용하여 미세하게 마쇄한후 100g을 400㎖의 증류수에 넣어 4시간동안 2회에 걸쳐 환류추출시킨후 원심분리(3000rpm, 30분)하여 세포잔사등을 제거시키고 여액에 720㎖의 아세톤을 적가시켜 생성된 침전물을 제거한후 여액에 다시 메칠알콜 1400㎖를 적가시켜 생성된 침전물을 여과하고 이것을 50㎖의 에테르 및 50㎖ 아세톤으로 균일하게 분산시키면서 씻어주고 불순물을 제거시키면 약 12g의 괄루근 다당 조침전물을 얻는다.

이 침전물을 다시 200㎖의 찬 0.1N 수산화나트륨 용액에 5℃에서 용해시킨후 1g의 수산화바륨과 0.5g의 황산아연을 첨가하여 잘녹인 다음 5℃에서 2시간 방치시켜 생성되는 침전물 및 불용물을 원심분리 하여 제거하고 400㎖의 메칠 알콜을 적가시킨후 5℃에서 12시간 방치시켜 생성되는 정제된 다당침전물을 원심분리하여 모아서 80% 메칠알콜 100㎖에 완전히 분산시킨후 여과하여 80% 메칠알콜용액에 가용불순물을 제거한다음, 증류수상에서 투석시켜 잔존할 수 있는 염등과 저분자 물질을 제거시킨후 냉동건조하여 생체활성 괄루근 다당 1.88g을 얻었다.

상기 실시예 2에서 얻어진 생체활성 괄루근다당의 순도확인을 위한 페이퍼 전기영동한 그림을 제1도에 나타내었고, 이 다당의 IR 데이터를 제2도에 나타내었다.

상기 실시예 2에서 얻은 괄루근 다당의 화학적 분석데이터를 다음 표 1에 나타내었다.

[표 1]

1. 수분 : 열천칭 TSG를 사용한 표준열 무게측정(100℃까지 중량손실)

2. 단백질 : Lowry법(Lowry et al., J. Biol. Chem., 193 : 265(1951))

3. 헥산 : UV법(Warburg and Christian, Biochem, Z., 310 : 384(1942))

4. 중금속 : EDAX

상기 실시예 2에서 얻은 괄루근 다당의 면역증강 효과에 의한 항암작용을 다음 표 2에 나타내었는바, 이 실험은 무균실(Clean room)에서 사육한 쥐를 가지고 일반적 항암실험과 동일한 조건으로 실시하였다.

[표 2]

상기 실시예 2에서 얻은 괄루근 다당의 항암작용에 의한 생존일수 증가 정도를 S-180 암세포를 이식시킨 쥐에 대하여 관찰한 결과 다음 표 3에 나타내었다.

[표 3]

Claims

괄루근으로부터 생체활성 다당을 분리함에 있어서, 마쇄한 괄루근 파우더에 증류수를 4∼7㎖/g 비율로 가하고 환류 추출한다음 이를 원심분리하여 세포잔사를 제거하고 여액에 저급알콜 1.9∼2.3 부피비를 적가한후 생성된 침전물을 여과하고 아세톤 및 에테르로 침전물을 세척하여 괄루근 다당 조침전물을 분리하는 것을 특징으로 하는 괄루근으로부터 생체활성 다당을 제조하는 방법.
괄루근으로부터 생체활성 다당을 분리함에 있어서, 마쇄한 괄루근 파우더에 증류수를 4∼7㎖/g 비율로 가하고 환류 추출한다음 원심분리하여 세포잔사를 제거하고 여액에 저급케톤 1.0∼1.2 부피비를 적가한 다음 생성된 침전물을 여과하고 이 상등액에 다시 저급알콜 0.9∼1.2 부피비를 적가하고 여과한다음 아세톤 또는 에테르로 침전물을 세척하여 괄루근 다당 조침전물을 분리하는 것을 특징으로 하는 괄루근으로부터 생체활성 다당을 제조하는 방법.
괄루근으로부터 분리된 생체활성 다당을 정제함에 있어서, 괄루근으로부터 분리된 괄루근 다당의 조침전물을 수산화나트륨 수용액에 용해시킨후 수산화바륨과 황산아연을 첨가하고 원심분리하여 침전물과 불용물을 제거한다음 저급알콜을 적가하여 다당 침전물을 수거한후 이를 증류수상에서 투석하여 염이나 저분자 물질을 제거함을 특징으로 하는 괄루근으로부터 분리된 생체활성 다당을 정제하는 방법.