PL102730B1 - Sposob wytwarzania polisacharydow zawierajacych azot - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia polisacharydów, zawierajacych azot i maja¬ cych wlasciwosci przeciwnowotworowe.

Wiadomo, ze polisacharydy o wlasciwosciach przeciwnowotworowych mozna otrzymywac, oczy- 5 szczajac wyciag, otrzymany przez ekstrakcje grzy¬ bów z gromady: podstawczaków (Basidiomycetes) wodnym rozpuszczalnikiem. Sposobem tym otrzy¬ muje sie jednak aktywne skladniki z mala wy¬ dajnoscia, totez sposób ten nie nadaje sie do sto- 10 sowania w praktyce na skale techniczna. W pro¬ cesie tym stosuje sie wylsalanie siarczanem amo¬ nowym, dialize, wytracanie organicznym rozpusz¬ czalnikiem lub oczyszczanie wyciagu na drodze filtrowania przez zel. Sposoby te nie sa jednak 15 skuteczne dla usuniecia zawartych w wyciagu substancji o malym ciezarze czasteczkowym, to jest mniejszym niz 5000. Te substancje maloczastecz- kowe nie maja prawie wcale zdolnosci przeciwko stalytm nowotorom Sarcoma-180 u myszy przy po- 2q dawaniu sródotrzewnowym, a poza tym sa gorz¬ kie i maja nieprzyjemny zapach, totez obecnosc ich w polisacharydach, stosowanych jako leki, jest niepozadana.

Wad tych nie ma sposób wedlug wynalazku, 25 umozliwiajacy otrzymywanie z wysoka -wydajno¬ scia polisacharydów, zawierajacych azot, wyka¬ zujacych dzialanie przeciwnowotworowe i maja¬ cych inne cenne wlasciwosci farmakodynaniiczne.

Sposób *en polega na ekstrahowaniu grzybów z 30 gromady Basidiomycetes wodnym rozpuszczalni¬ kiem, a cecha tego sposobu jest to, ze grzyb z rodzaju Coriolus, rzedu Polyporaceae ekstrahuje sie alkalicznym roztworem wodnym o stezeniu 0,01in—2n i otrzymany wyciag oczyszcza przez ul- trafiltracje i/albo odwrotna osmoze, w celu usu¬ niecia substancji o ciezarze czasteczkowym niz¬ szym niz 5000.

Okreslenie „grzyby z rodzaju Coriolius" ozna¬ cza znane gatunki grzybów z rzedu Polyporaceae, gromady Basidiomycetes, takie jak np. Coriolus versicolor (Fr.)Quel., Coriolus hirsutus (Fr.)Quel., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus conchifer (Schw.) Pat., Coriolus pubefseens (Fr.)Quel., Co¬ riolus pargamenus ' (Fr.)Pat. i Coriolus biformis (Klotz.)Pat. (patrz Coloured Illustriations of Fungi of Japan, Rókiuya Imazeki i Tsuguo Hongo, .tom I, 1974 ii tom II, 1975). Numery, pod którymi grzy¬ by te zdeponowano w Fermentation Research In- stituite, Aigency of Industrial Science and Tech¬ nology (Chiba-shi, Japonia) sa nastepujace: Co¬ riolus versicolor FERM-P No. 2414, Coriolus con¬ sors FERM-P No. 988, Coriolus hirsutus FERM-P No. 2711 i Coriolus pargarnan/uis J^ERM-P No. 2712.

Okreslenie „grzyb z rodzaju Coriolus" oznacza sztucznie hodowane luib naturalne owocnie i/^%9 girzyfonie ty£h grzybów, przy czym zgodnie z 1yy- nalazkiem najkorzystniej stosuje sie grzybnie sztucznie hodowanjego Coiioilus versicolor (Fr^) Quel. 'i 102 730102 730 3 Jak wyzej wspomniano, zgodnie z wynalazkiem ekstrahuje sie grzyb alkalicznym roztworem wod¬ nym o stezeniu 0,0,ln—2n, korzystnie w ilosci 5— —>200 czesci wagowych na 1 czesc wagowa grzy¬ ba, i z wyciagu usuwa za pomoca utrafiltracji i/albo odwrotnej osmozy skladniki o ciezarze cza¬ steczkowym mniejszym niz 5000. Stosuje sie ste¬ zenie alkalicznego roztworu w wyzej podanych granicach, poniewaz przy stezeniu mniejszym niz 0,01n efekt ekstrakcji nie rózni sie prawie od efek¬ tu* uzyskiwanego przy ekstrakcji woda, zas przy stezeniu wiekszym niz 2n moze zachodzic rozklad czynnej substancji! Ekstrakcje korzystnie prowa¬ dzi sie w temperaturze 50—100°C, zwlaszcza 80— -^8°C, w ciagu 20-^600 minut. Ekstrakcja w temperaturze nizszej niz 50°C nie daje dobrej wy¬ dajnosci, zas w temperaturze powyzej 100°C ak¬ tywnosc otrzymanej substancji czynnej moze zmniejszac sie. Szczególowe warunki procesu ek¬ strakcji dobiera sie w zaleznosci od stezenia al¬ kalicznego roztworu, ale w podanych wyzej gra¬ nicach temperatury i czasu.

Jako alkaliczny roztwór zgodnie z wynalazkiem mozna stosowac rózne substancje alkaliczne, ta¬ kie jak wodorotlenek sodowy, potasowy, amono¬ wy lub wapniowy itp., a korzystnie stosuje sie wodorotlenek sodowy albo potasowy.

Ciekly wyciag, otrzymany w wyniku ekstrakcji, zobojetnienia sie w zwykly sposób mineralnym kwasem, np. rozcienczonym kwasem solnym, po czym podidaje ultrafiltracji lub odwrotnej osmo¬ zie, usuwajac substancje o ciezarze czasteczko¬ wym mniejszym niz 5000. Stwierdzono, ze takie zabiegi oczyszczania daja znacznie lepsze wyniki niz stosowane, w znanych procesach wysalanie siarczanem amonowym, dializa, wytracanie orga¬ nicznym rozpuszczalnikiem lub filtrowanie przez zel, które nie umozliwiaja skutecznego usuwania skladników o ciezarze czasteczkowym mniejszym niz 5000.

Istotna cecha procesu oczyszczania wedlug wy¬ nalazku jest to, ze skladniki, zawarte w roztwo¬ rze, frakcjonuje^-sie wedlug ich ciezaru czastecz- ko/Wego za pomoca przepony, stanowiacej rodzaj .sita molekularnego i pod zwiekszonym cisnieniem.

Przy frakcjonowaniu za pomoca przepony wiel¬ kosci ciezarów czasteczkowych zwykle okresla sie wedlug rodzaju uzytej przepony, ale poniewaz efekt frakcjonowania zalezy w duzej mierze od ciezaru czasteczkowego i konfiguracji czasteczek zawartych w roztworze przeto ciezary czastecz¬ kowe i warunki srodowiska rozdzielania podane w katalogu przez wytwórce przepony nie zawsze moga miec zastosowanie przy frakcjonowaniu zgodnie z wynalazkiem.

Stwierdzono, ze przepona oznaczona jako ty¬ powa dla oddzielania czasteczek o ciezarze cza¬ steczkowym 5000—15000 i majaca stopien inhibi- towania w stosunku do cytochromu c (ciezar cza¬ steczkowy 13000) wynoszacy 98—100^/p, nadaje sie dobrze do procesu oczyszczania wedlug wynalaz¬ ku. Przy stosowaniu takiej przepony warunki pro¬ wadzenia procesu oczyszczania zmieniaja sie w pewnej mierze w zaleznosci od ksztaltu stosowa¬ nego aparatu i jego wielkosci, ilosci przepusz- 4 czanego wyciagu i innych czynników, natomiast przy stosowaniu ultrafiltracji proces prowadzi sie zwykle pod cisnieniem 0,5—5 kG/cm2, korzystnie 1—4 kG/cm2, w temperaturze 5—70°C, przy czym temperatura ta zalezy od rodzaju przepony. W przypadku odwrotnej osmozy zwykle stosuje sie cisnienie 20—35 kG/cm2, korzystnie 20—25 kG/" /cm2, a temperature 5—20°C.

Zwykle uwaza sie, ze ultrafiltracja jest od^- wiednia dla frakcjonowania produktu o ciezarze czasteczkowym powyzej 10 000, podczas gdy od¬ wrotna osmoza nadaje sie do rozdzielania pro¬ duktu o ciezarze czasteczkowym, mniejszym niz: 1000. Zgodnie z wynalazkiem frakcjonuje sie pro¬ dukt o ciezarze czasteozkowym 5000, to jest po¬ srednim pomiedzy obiema wyzej podanymi, za¬ lecanymi granicami, ale stwierdzono, ze obie te metody moga byc stosowane do oddzielania sub¬ stancji o ciezarze czasteczkowym mniejszym od 5000, jezeli dobierze sie odpowiednia przepone. Z tych tez wzgledów^ zgodnie z wynalazkiem moz¬ na stosowac ultrafiltracje albo odwrotna osmoze lub tez obie te metody w kombinacji, w zalez¬ nosci od warunków. Po oddzieleniu niepozada¬ nych substancji o ciezarze czasteczkowym mniej¬ szym niz 5000 wyciag suszy sie metoda rozpy¬ lania lub wymrazania, otrzymujac gotowy pro¬ dukt. Produkt ten ma barwe, watroby i jego za¬ wartosc azotu wynosi 2—#Vo, czesto 3—6% wa¬ gowych. Niema on scislej temperatury topnienia,, lecz przy ogrzewaniu stopniowo czernieje i roz¬ klada sie w temperaturze powyzej okolo 120°C.

'Jest on rozpuszczalny w wodzie i prawie nTe- rozpuszczalny w alkoholu, pirydynie, chloroformie, benzenie i heksanie. Nie ma on smaku ani za¬ pachu. Wyniki testowych reakcji barwnych z produktem, otrzymywanym sposobem wedlug; wynalazku, podano w tablicy.

Tablica 1 Rodzaj reakcji Reakcja [ Molish'a (a-naftol i kwas siarkowy Reakcja Disch'a (indol i kwas siarkowy) Reakcja z an- tronem i. kwasem siarkowym Reakcja z feno¬ lem i kwasem siarkowym Reakcja z tryp- tofanem i kwasem siar¬ kowym Reakcja Lowry- -Folin Barwa Purpuro¬ wa Brazowa Zielona- wo-nie¬ bieska Brazowa Purpuro- wb^bra- zowa Niebieska Wynik [ Potwierdzone f sacharydy | 1 Potwierdzone l* sacharydy f Potwierdzone P sacharydy r Potwierdzone V sacharydy P ' r Potwierdzone l sacharydy r i Potwierdzone 1 wiazanie h peptydowe \i 40 45 50 55 60 /102 730 cd. i Rodzaj reakcji f N , Reakcja ninhy- dronowa po hydrolizie kwasem solT nym Barwa Zielona- wo-nie- bieska ( - Wynik Potwierdzone a-aminokwesy - Wyniki podane w tablicy potwierdzaja, ze pro¬ dukt, wytwarzany sposobem wedlug wynalazku, jest polisacharydem, zawierajacym azot. Ciezar czasteczkowy tego produktu; mierzony metoda ultrawirówki, wynosi 5000—300000, a przecietny ciezar czasteczkowy 10000—100000. Ciezar czastecz¬ kowy produktu, mierzony innymi metodami, ta¬ kimi jak rakcjonowanie za pomoca przepony ul- trafiltracyjnej, takze wynosi 10000—100000, prze¬ to z wielkim prawdopodobienstwem mozna przy¬ jac, ze przecietny ciezar czasteczkowy produktu wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku wy¬ nosi 10000—100000.

Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku poli¬ sacharydy, zawierajace azot, nie tylko przejawia¬ ja silne dzialanie przeciwnowotworowe i wysoki stopien hamowania rozwoju stalego nowotworu Sarcoma-180 u myszy przy podawaniu sródotrzew- nowym, ale sa równiez skuteczne przy podawaniu doustnym. Skutecznosc przy podawaniu doustnym zostala potwierdzona szeregiem róznych doswiad¬ czen, przy czym stwierdzono, ze polisacharydy te nadaja sie nie tylko do zwalczania nowotworów, ale równiez przywracaja calemu organizmowi pa¬ cjenta odpornosc. Z tego wzgledu sa skuteczne przy zapobieganiu ubocznym reakcjom przy che¬ moterapii raka i zwiekszaja wrazliwosc na lecze¬ nie promieniami, ale równiez zapobiegaja obni¬ zaniu sie odpornosci organizmu i spadkowi sil pacjenta po operacji lufo po transfuzji krwi. Po¬ za tym zapobiegaja one zarazliwym chorobom, powodowanym przez wirusy i bakterie przy zmniejszaniu sie odpornosci lub sil fizycznych or¬ ganizmu. Podawane doustnie wplywaja korzyst¬ nie na prace watroby, zwiekszaja apetyt, lagodza zaklócenia w przewodzie pokarmowym i nasilaja wydalanie moczu.

Przyklad I. 200 g suchej (zawartosc wil¬ goci 8,8% i zawartosc azotu 2,5%) grzybni Corio- "lus versicolor (Fr.)Quel. (FERM-P No. 2414) do¬ daje sie do 4 litrów 0,ln roztworu NaOH i mie¬ szajac ekstrahuje we wrzacej kapieli wodnej, u- trzymujac temperature mieszaniny 90—95°C w ciagu ^ godziny, t>o czym, chlodzi sie do tempe¬ ratury nizszej niz 50°C i stopniowo dodaje 0,ln roztwór kwasu solnego tak, aby uzyskac wartosc pH=7,0. Stale substancje odsacza sie przez odsy¬ sanie i przemywa 500 ml wody, otrzymujac 4,2 litra przesaczu z popluczynami. Roztwór ten pod¬ daje sie ultrafiltracii, stosujac ultrafiltr firmy Amicon Inc. z przepona PM-5 i mieszajac oraz ,, chlodzac pod cisnieniem roboczym 1,5 kG/cm*, w temperaturze 10°C, usuwajac • substancje o cie¬ zarze czasteczkowym mniejszym niz 5000. Nastep¬ nie roztwór steza sie do objetosci 300 ml i pod- 6 ^ daje go suszeniu przez wymrazanie, otrzymujac okolo 26,6 g (13,5% wydajnosci) produktu w po¬ staci proszku o barwie watroby. Produkt zawie¬ ra 7,5% wagowych wilgoci, a elementarna anali- za daje zawartosc 40,5% C, 6,2% H, 5,8% N, oraz 47,5% O,, przy czym zawartosc tlenu oblicza sie jako róznice sumy pozostalych 3 skladników od 100%. Stopien hamowania rozwoju twardego no¬ wotworu §arcoma-180 u myszy przy dootrzew^ nowym podawaniu produktu wynosi 90%, a przy podawaniu doustnym 65%.

Wskaznik ten ustalono znana metoda, która po¬ lega na tym, ze ,komórki nowotworu Sarcoma- -180 przeszczepia sie do jamy brzusznej myszy i pozwala im rozwijac sie w ciagu 7 dni, po czym * tyoh komórek przeszczepia sie pod skóre w pachwinie innej myszy, wytwarzajac twarde no¬ wotwory. Po uplywie 24 godzin myszy podaje sie badana substancje, przy czym dootrzewnowo sto¬ suje sie co drugi dzien w ciagu 20 dni dawke mg/tog, to jest lacznie 0,2 ml dla myszy o ma¬ sie ciala 20 g. zas doustnie podaje sie raz dzien¬ nie 1000 mg/kg w ciagu 20 dni, to jest lacznie równiez ^0,2 ml dla myszy o masie ciala 20 g. W dniu od przeszczepienia wyluskuje sie nowotwo¬ ry i okresla stopien zahamowania ich wzrostu w procentach, jako stosunek przecietnej masy nowo¬ tworu u myszy, którym podawano badany sro¬ dek, do przecietnej masy nowotworu u myszy z próby kontrolnej.

W celach porównawczych prowadzi sie równiez proces w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, ale stosujac wóde zamiast 4 li¬ trów 0,1 n roztworu NaOH. Wydajnosc produktu wynosi 7,8%, to jest okolo 60% wydajnosci, uzy¬ skanej przy prowadzeniu procesu sposobem we¬ dlug wynalazku.

Przyklad II. 500 g zywej grzybni Coriolus versicolor (Fr.)Quel. (FERM-P No. 2414) o zawar¬ tosci 70,8% wody i 2,6% calkowitego azotu w przeliczeniu na sucha mase oraz £ litry wody miesza sie i miele w mieszalniku do soków w Ciagu 10—20 minut, po czym do mieszaniny do¬ daje sie stopniowo 500 ml 1 n roztworu NaOH i ekstrahuje w goracej lazni wodnej w ciagu 2 godzin, po czym zobojetnia kwasem solnym, prze¬ mywa i oddziela komórki, jak w przykladzie I.

Otrzymany wyciag poddaje sie ultrafiltracji, sto¬ sujac przepone G-05 T firmy Bio-Engineering Co., w celu usuniecia substancji o ciezarze czastecz¬ kowym mniejszym niz 5000, po czym steza i su¬ szy przez wymrazanie, otrzymujac 24,2 g produk¬ tu w postaci proszku o barwie watroby (wydaj¬ nosc 15,1%). Produkt ten zawiera 7,6% wilgoci i 6,0% calkowitego azotu. Rozpuszczony w wodzie daje 20% substancji nierozpuszczalnych, nato¬ miast 80% rozpuszcza sie latwo. Analiza elemen¬ tarna wykazuje 41,2% wegla, 6,1% wodoru i 6,0% azotu oraz 46,7% tlenu (przez odjecie sumy C -r + H + N od 100%). Produkt ten rozpuszcza sie w wodzie, odsacza substancje nie rozpuszczone przez bibule filtracyjna nr 5c i bada jego dziala¬ nie hamujace rozwój nowotworu Sarcoma-180 u myszy. Przy podawaniu dootrzewnowym stopien 40 45 50 55 60«•* 7 hamowania wynosi 93(0/o, a przy podawaniu do¬ ustnym 70*/o., Przyklad III. 2 kg suchych komórek Corio- lus versicolor (Er.)Quel. (FERM-P No. 2414) o za¬ wartosci wilgoci 8,0% i calkowitej zawartosci a- zotu 2,5% miesza sie z 20 litrami 0,4n roztworu NaOH i mieszajac ekstrahuje w ciagu 2 godzin, utrzymujac za pomoca plaszcza grzejnego tempe¬ rature mieszaniny 90—95°C. Nastepnie chlodzi sie {to temperatury pokojowej, zobojetnia* mieszajac za pomoca dodawanego porcjami 2n kwasu sol¬ nego do wartosci pH=7,0, po czym oddziela cze¬ sci stale przez odwirowywanie. Osad ten miesza sie z 20 litrami 0,4n roztworu NaOH i ekstrahuje w wyzej opisany sposób w temperaturze 90— —95°C w ciagu 2 godzin, chlodzi, zobojetnia i odwirowuje substancje stale. Substancje te pod¬ daje sie ponownie ekstrakcji za pomoca 0,4n NaOH w ciagu 1 godiziny, otrzytoiujac wyciag. W wyniku tych 3 operacji ekstrahowania otrzymu¬ je sie lacznie okolo 58 litrów cieklego wyciagu, totóry steza sie w prózniowej wyparce do objeto¬ sci okolo 10 litrów i poddaje ultrafiltracji w tem¬ peraturze 10°C, pod cisnieniem 2,1 atm, stosujac przepone HFA-180 firmy Abcor Inc., w celu od¬ dzielenia substancji o ciezarze czasteczkowym mniejszym niz 5000. Nastepnie steza sie roztwór do objetosci okolo 5 litrów.

Roztwór o objetosci okolo 70 litrów, otrzymany przy ultrafiltracji i zawierajacy usuniete substan¬ cje o malym ciezarze czasteczkowym, poddaje sie odwirotnej osmozie z uzyciem przepony AS-205 firmy Abcor Inc., oddzielajac substancje o niz¬ szym ciezarze czasteczkowym i otrzymujac okolo litrów przerobionego roztworu. Proces odwrot¬ nej osmozy prowadzi sie pod srednim cisnieniem —30 kG/cm2, w temperaturze okolo 10°C. Roz¬ twór otrzymany po ultrafiltracji i roztwór po od¬ wrotnej osmozie miesza sie, otrzymujac 10 li¬ trów polaczonego roztworu, który suszy sie me¬ toda Tozpylowa, otrzymujac okolo 395 g (wy¬ dajnie 19,9*/o) produktu w postaci proszku o bar¬ wie watroby. Produkt zawiera 7,0% wilgoci, a analiza elementarna daje sklad: 40,8% C, 6,0% H, 730 8 4,0% N i 49,21% O. Wskaznik hamowania wzrostu stalego nowotworu Sareoma-180 u myszy wynosi 92% przy podawaniu stródotrzewnowym tego pro¬ duktu i 7C% przy podawaniu doustnym. Produkt jest debrze rozpuszczalny w, wodzie.

Claims (9)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania polisacharydów zawie¬ rajacych azot i majacych wlasciwosci przeciwno- wotworowe, przez ekstrakcje wodnym rozpusz¬ czalnikiem grzybów z gromady podstawczafiów (Basldiomycetes), znamienny tym, ze grzyb z ro¬ dzaju Coriolus z rzedu Polyporaceae ekstrahuje sie (alkalicznym roztworem wodnym o stezeniu 0,01n—2n, po czym oczyszcza wyciag za pomoca ultrafiltracji i/albo odwrotnej osmozy, usuwajac substancje o ciezarze czasteczkowym mniejszym niz 5000.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ekstrahuje sie sztucznie hodowana lub naturalna owocnie i/albo grzybnie.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ekstrahuje sie grzyb Coriolus versicolor (Fr.) Quel.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze na 1 czesc wagowa grzyba stosuje sie 5—200 cze-» sci wagowych alkalicznego roztworu wodnego.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako alkaliczny roztwór wodny stosuje sie roz¬ twór* wodorotlenku sodojwego.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze proces ekstrakcji prowadzi sie w temperaturze 80—98°C.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze substancje o ciezarze czasteczkowym nizszym niz 5000 usuwa sie pod zwiekszonym cisnieniem.

8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ultrafiltnacje prowadzi sie pod cisnieniem 0,5—5 kG/cm2.

9. Sposób wedlug zastrz 1, znamienny tym, ze odwrotna osmoze prowadzi sie pod cisnieniem 25—35 kG/cm2. LZG Z-d 3 zam. 491^79. Naklad 95+20 egz. Cena 45 zl