CN104127386A - 一种大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及其制备方法和应用。该纳米微球为壳聚糖与三聚磷酸钠交联形成的三维网状结构，大叶茜草素以分子形式固定其中，大叶茜草素的包封率为4.58～14.64％，纳米微球的平均粒径为96～467nm，纳米微球粒径的多分散系数为0.25～0.27，载药量为5.73～28.153μg/mg，Zeta电位为45.07～48.73mV。其制备方法步骤如下：(1)配制壳聚糖组分液；(2)配制大叶茜草素组分液；(3)将大叶茜草素组分液逐滴加入壳聚糖组分液中，充分搅拌，并逐滴加入1.0～3.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，制备得到大叶茜草素/壳聚糖纳米微球。本发明所制备的纳米微球形状规则、粒径较小、分散性好，具有显著的抗氧化和抑制癌细胞作用，是一种潜在的抗氧化和抗肿瘤制剂。

Description

一种大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及其制备方法和应用。
背景技术
茜草(Rubia cordifolia L.)是一种医药学上应用前景广阔的中草药，而大叶茜草素(mollugin)是茜草科植物中的主要活性成分。研究发现，大叶茜草素具有良好抗肿瘤、抗氧化、抗诱变、抗病毒、抗菌、抗炎抗风湿、保护神经、抑制脂肪积聚、止血等生物活性，用于关节炎、痛经、大出血、风湿和泌尿系统紊乱等疾病的治疗，是一种有着广阔研究价值和市场前景的植物活性物质。但由于大叶茜草素中酚羟基的存在，致使该化合物不稳定，在有机溶剂中易氧化降解；而且大叶茜草素不溶于水，生物利用率低，限制了其发展应用。相关研究表明，将纳米技术引入传统中药，制备纳米中药，可改善药物水溶性，利用纳米粒子的实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)可实现药物控释缓释、提高药物靶向性，从而提高中药生物利用度；同时，还可丰富传统中药剂型和给药途径，解决中药剂型单一的问题。虽然纳米技术在中医药领域起步较晚，但已展现出巨大的潜力及广阔的前景。
壳聚糖是自然界中唯一碱性多糖，天然无毒，不仅具有生物相容性，还拥有氨基等活性基团，使它在药物的控制与释放、改善药物的溶解性和吸收性等方面发挥重要作用。壳聚糖作为缓释载体具有维持血药浓度平衡、降低药物不良反应、提高药物疗效等优势。近年来已公开了一些壳聚糖载药微球的报道。例如，专利CN201612864U提供了一种以壳聚糖与戊二醛的缩合物为囊壳，包覆白藜芦醇、氧化白藜芦醇、紫檀芪和白皮杉醇的缓释微球，微球粒径为2～100μm；CN102293752B公开了通过离子交联法联合喷雾干燥法制备壳聚糖载辣椒素微球，微球粒径为0.8～4.5μm；专利CN101991541B报道了通过离子交联法，经二次冷冻干燥制备负载阿昔洛韦的壳聚糖-明胶纳米粒。这些壳聚糖载药微球的制备方法存在一定缺陷，如有些方法使用了有毒试剂(戊二醛)，有些方法制备复杂，反应条件较高(离子交联法联合二次冷冻干燥法)，并且所得到的载药微球粒径均偏大，分布较广等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种粒径较小、分散良好的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及其制备方法和应用。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
一种大叶茜草素/壳聚糖纳米微球，该纳米微球为壳聚糖与三聚磷酸钠交联形成的三维网状结构，大叶茜草素以分子形式固定其中，大叶茜草素的包封率为4.58～14.64％，纳米微球的平均粒径为96～467nm，纳米微球粒径的多分散系数为0.25～0.27，载药量为5.73～28.153μg/mg，Zeta电位为45.07～48.73mV。
本发明还提供了上述大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法，步骤如下：
(1)将壳聚糖溶于含有0.1～0.5wt％泊洛沙姆188和1.0～1.5％(V/V)醋酸的水溶液中，配成1.0～3.0mg/mL的壳聚糖水溶液，然后用微孔滤膜过滤，所得滤液经NaOH溶液调节pH值为3.5～4.5，得到壳聚糖组分液；
(2)将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为1.0～5.0mg/mL的大叶茜草素乙醇溶液，采用微孔滤膜过滤，得到大叶茜草素组分液；
(3)将步骤(2)所得大叶茜草素组分液逐滴加入步骤(1)所得壳聚糖组分液中，充分搅拌，并逐滴加入1.0～3.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，其中大叶茜草素组分液、壳聚糖组分液和三聚磷酸钠溶液的体积比为1:5:2，在30～40℃持续搅拌反应10～60min，所得微乳液静置陈化10～15h，再后处理即得大叶茜草素/壳聚糖纳米微球。本发明以壳聚糖为载体，三聚磷酸钠为交联剂，泊洛沙姆188为稳定剂，将大叶茜草素负载到壳聚糖上制备得到粒径较小、分散性好的纳米微球。
按上述方案，步骤(1)所述壳聚糖脱乙酰度为82～97％，分子量为10～50万。
按上述方案，步骤(1)和步骤(2)所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
按上述方案，步骤(1)所述NaOH溶液浓度为1mol/L。
按上述方案，步骤(3)所述搅拌速率为800～1600r/min。
按上述方案，步骤(3)所述后处理包括过滤、透析、真空冷冻干燥。
本发明还提供了上述大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的应用，具体为在制备抗氧化剂方面的应用，在制备人肝癌细胞抑制剂方面的应用，及在制备人宫颈癌细胞抑制剂方面的应用。
本发明的有益效果在于：1、本发明以壳聚糖为载体，三聚磷酸钠为交联剂，泊洛沙姆188为稳定剂，将大叶茜草素负载到壳聚糖上制备得到粒径较小、分散性好的纳米微球，解决了现有制备技术中存在的有毒物质残留和载药微球粒径偏大、粒度分布广、生物活性低的问题，对提高药物的疗效和有效性、丰富药物剂型有着重要意义。2、大叶茜草素/壳聚糖纳米微球具有显著地抗氧化和抑制癌细胞活性，将大叶茜草素制备成纳米微球，增强了药物的稳定性，改善了药物的水溶性，提高了药物的生物利用率，为开发治疗和预防由体内氧化反应引起的心脑血管、糖尿病、癌症等疾病的新制剂提供了新途径，并对开发中药新剂型和实现中药现代化具有积极促进作用。3、本发明提供的制备方法操作简单，条件温和，重复性好。以壳聚糖为药物载体，利用壳聚糖的生物相容和可体内生物降解性能，可实现药物的控释缓释。
附图说明
图1为本发明实施例1所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的原子力显微镜(AFM)图；
图2为实施例2所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的原子力显微镜(AFM)图；
图3为实施例3所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的扫描电子显微镜(SEM)图；
图4为实例1-3所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球清除自由基活性图；
图5为实例1-3所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人肝癌细胞(HepG2)存活率关系图；
图6为实例1-3所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人宫颈癌细胞(HeLa)存活率关系图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
实施例1
本实施例大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法如下：
(1)将壳聚糖(脱乙酰度82％，分子量50万)溶于含有0.1wt％泊洛沙姆188和1.5％(V/V)醋酸的水溶液中，配成1.0mg/mL的壳聚糖水溶液，然后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，所得滤液经浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH值为4.0，得到壳聚糖组分液；
(2)将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为1.0mg/mL的大叶茜草素乙醇溶液，采用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，得到大叶茜草素组分液；
(3)将1mL步骤(2)所得大叶茜草素组分液逐滴加入5mL步骤(1)所得壳聚糖组分液中，充分搅拌(搅拌速率为800r/min)，并逐滴加入2mL1.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，在33℃持续搅拌反应10min，所得微乳液静置10h，采用中速定量滤纸抽滤，再将滤液放入8000～14000截留分子量的透析袋中并在室温下于超纯水中透析3h；将透析后的微乳液倒入培养皿中，在-20℃预冻12h，然后在-50℃真空冷冻干燥24h，即得大叶茜草素/壳聚糖纳米微球。
本实施例所制备的纳米微球平均粒径约为96nm，载药量为5.73μg/mg，包封率为4.58％，PDI值为0.26，Zeta电位为45.07mV。
附图1为采用MultiModeTM型原子力显微镜所观察到的本实施例所得大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的AFM图。由AFM图可以看出，制备得到的纳米微球球形规则，粒径均一，分散良好，微球平均粒径约为96nm。
实施例2
本实施例大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法如下：
(1)将壳聚糖(脱乙酰度97％，分子量10万)溶于含有0.3wt％泊洛沙姆188和1.0％(V/V)醋酸的水溶液中，配成1.2mg/mL的壳聚糖水溶液，然后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，所得滤液经浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH值为3.5，得到壳聚糖组分液；
(2)将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为3.0mg/mL的大叶茜草素乙醇溶液，采用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，得到大叶茜草素组分液；
(3)将1mL步骤(2)所得大叶茜草素组分液逐滴加入5mL步骤(1)所得壳聚糖组分液中，充分搅拌(搅拌速率为1200r/min)，并逐滴加入2mL1.5mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，在30℃持续搅拌反应30min，所得微乳液采用与实施例1相同的方法后处理得大叶茜草素/壳聚糖纳米微球。
本实施例所制备的纳米微球平均粒径约为107nm，载药量为14.67μg/mg，包封率为5.87％，PDI值为0.25，Zeta电位为47.7mV。
附图2是本实施例所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的AFM图。由AFM图可以看出，制备得到的载药微球球形规则，粒径均一，分散良好，微球平均粒径约为107nm。
实施例3
本实施例大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法如下：
(1)将壳聚糖(脱乙酰度90％，分子量30万)溶于含有0.5wt％泊洛沙姆188和1.2％(V/V)醋酸的水溶液中，配成3.0mg/mL的壳聚糖水溶液，然后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，所得滤液经浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH值为4.5，得到壳聚糖组分液；
(2)将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为5.0mg/mL的大叶茜草素乙醇溶液，采用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，得到大叶茜草素组分液；
(3)将1mL步骤(2)所得大叶茜草素组分液逐滴加入5mL步骤(1)所得壳聚糖组分液中，充分搅拌(搅拌速率为1600r/min)，并逐滴加入2mL3.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，在40℃持续搅拌反应60min，所得微乳液采用与实施例1相同的方法后处理即得大叶茜草素/壳聚糖纳米微球。
本实施例所制备的纳米微球平均粒径约为467nm，载药量为28.153μg/mg，包封率为14.64％，PDI值为0.27，Zeta电位为48.73mV。
附图3是采用LEO1530型扫描电子显微镜所观察到的本实施例所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的SEM图。由SEM图可以看出，制备得到的载药纳米微球球形圆整，表面光滑，分散良好，粒径均一，微球平均粒径约为467nm。
实施例4
大叶茜草素/壳聚糖纳米微球清除自由基活性测试
将二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)用无水乙醇配置成1mmol/L的工作液，实施例1、实施例2和实施例3所制备的纳米微球亦分别用无水乙醇配成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/mL的悬浊液，待用。实验时将3.5mL无水乙醇，400μL DPPH·溶液分别和100μL各悬浊液样品混合均匀，37℃于暗处振荡反应1h；3000r/min离心5min，使用UV4500紫外/可见分光光度计(美国PerkinElmer公司)检测上清液在517nm处吸光值，以无水乙醇调零。结果表示为各悬浊液样品对DPPH·自由基的清除率(％)＝(Ac－Ai)/Ac×100％(Ac为未加样品的吸光值，Ai为加入样品的吸光值)。实验均重复三次，取平均值。
附图4是实例1-3所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球清除自由基活性图。结果表明，载药纳米微球能清除自由基，而且载药纳米微球对自由基的清除率随着浓度增加呈增强趋势。
实施例5
大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人肝癌细胞(HepG2)的细胞毒性测试
将实施例1、实施例2和实施例3所制备的纳米微球用高糖型DMEM细胞培养液配成1mg/mL溶液，超声分散，现配现用；大叶茜草素用二甲基亚砜配置成5mg/mL溶液，然后用高糖型DMEM稀释至5、15、30μg/mL，现配现用。收集对数期HepG2细胞，以1×105个/mL接种至96孔板中，每孔接种100μL；细胞培养至对数生长期，100μL/孔加入纳米微球溶液和大叶茜草素溶液，每个浓度5孔，连续培养48h后，每孔避光加入20μL噻唑蓝(5mg/mL)溶液，37℃培养4h；弃去孔内培养液，每孔加入100μL DMSO，37℃恒温低速振荡30min，使用酶标仪在490nm处检测吸光值。结果表示为细胞存活率(％)＝(A1–Ai)/(A0–Ai)×100％(A0为对照孔的吸光值；A1为加药孔的吸光值；Ai为调零孔的吸光值)。对比纳米微球和裸药(即大叶茜草素)对HepG2细胞生长的抑制作用。
附图5是实例1-3所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人肝癌细胞(HepG2)存活率关系图。由图可知，所制备的纳米微球能有效抑制HepG2细胞的生长，且实施例1、实施例2和实施例3所制备的载药纳米微球对HepG2细胞的细胞毒性均优于裸药。
实施例6
大叶茜草素/壳聚糖载药纳米微球及大叶茜草素对人宫颈癌细胞(HeLa)的细胞毒性测试：
将实施例1、实施例2和实施例3所制备的纳米微球用高糖型DMEM细胞培养液配成1mg/mL溶液，超声分散，现配现用；大叶茜草素用二甲基亚砜配置成5mg/mL溶液，然后用高糖型DMEM稀释至5、15、30μg/mL，现配现用。收集对数期HeLa细胞，以1×105个/mL接种至96孔板中，每孔接种100μL；细胞培养至对数生长期，100μL/孔加入纳米微球溶液和大叶茜草素溶液，每个浓度5孔，连续培养48h后，每孔避光加入20μL噻唑蓝(5mg/mL)溶液，37℃培养4h；弃去孔内培养液，每孔加入100μL DMSO，37℃恒温低速振荡30min，使用酶标仪在490nm处检测吸光值。结果表示为细胞存活率(％)＝(A1–Ai)/(A0–Ai)×100％(A0为对照孔的吸光值；A1为加药孔的吸光值；Ai为调零孔的吸光值)。对比纳米载药微球和裸药对HeLa细胞生长的抑制作用。
附图6是实例1-3所制备的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球及大叶茜草素对人宫颈癌细胞(HeLa)存活率关系图。由图可知，所制备的纳米载药微球能有效抑制HeLa细胞的生长，而且实施例1和实施例2所制备的载药纳米微球对HeLa细胞的细胞毒性优于裸药。

Claims (10)

1.一种大叶茜草素/壳聚糖纳米微球，其特征在于：该纳米微球为壳聚糖与三聚磷酸钠交联形成的三维网状结构，大叶茜草素以分子形式固定其中，大叶茜草素的包封率为4.58～14.64％，纳米微球的平均粒径为96～467nm，纳米微球粒径的多分散系数为0.25～0.27，载药量为5.73～28.153μg/mg，Zeta电位为45.07～48.73mV。
2.一种大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)将壳聚糖溶于含有0.1～0.5wt％泊洛沙姆188和1.0～1.5％(V/V)醋酸的水溶液中，配成1.0～3.0mg/mL的壳聚糖水溶液，然后用微孔滤膜过滤，所得滤液经NaOH溶液调节pH值为3.5～4.5，得到壳聚糖组分液；
(2)将大叶茜草素溶于无水乙醇中配成浓度为1.0～5.0mg/mL的大叶茜草素乙醇溶液，采用微孔滤膜过滤，得到大叶茜草素组分液；
(3)将步骤(2)所得大叶茜草素组分液逐滴加入步骤(1)所得壳聚糖组分液中，充分搅拌，并逐滴加入1.0～3.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液,其中大叶茜草素组分液、壳聚糖组分液和三聚磷酸钠水溶液的体积比为1:5:2，在30～40℃持续搅拌反应10～60min，所得微乳液静置陈化10～15h，再后处理即得大叶茜草素/壳聚糖纳米微球。
3.根据权利要求2所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法，其特征在于步骤(1)所述壳聚糖脱乙酰度为82～97％，分子量为10～50万。
4.根据权利要求2所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
5.根据权利要求2所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法，其特征在于步骤(1)所述NaOH溶液浓度为1mol/L。
6.根据权利要求2所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法，其特征在于步骤(3)所述搅拌速率为800～1600r/min。
7.根据权利要求2所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球的制备方法，其特征在于步骤(3)所述后处理包括过滤、透析、真空冷冻干燥。
8.一种权利要求1所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球在制备抗氧化剂方面的应用。
9.一种权利要求1所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球在制备人肝癌细胞抑制剂方面的应用。
10.一种权利要求1所述的大叶茜草素/壳聚糖纳米微球在制备人宫颈癌细胞抑制剂方面的应用。
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