CN104840430A - 一种绿原酸壳聚糖微球及其制备工艺和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绿原酸壳聚糖微球及其制备工艺和应用。所述绿原酸壳聚糖微球是以绿原酸为主药并以壳聚糖或三甲基壳聚糖为载体材料制备得到的微球。所述绿原酸的制备工艺包括乳化交联法、喷雾干燥法和胶凝法。所述绿原酸壳聚糖微球的应用为绿原酸壳聚糖微球在制备药物中的应用。本发明采用适宜的方法将壳聚糖和绿原酸制备成绿原酸壳聚糖微球，从而能够有效增加绿原酸对生物膜的通透性，提高绿原酸的口服生物利用度，帮助绿原酸在体内发挥药效，帮助改变了绿原酸理化性质上的不足并改善了绿原酸在口服生物利用度上的局限性，为绿原酸的开发应用提供更多的参考和思路。

Description

一种绿原酸壳聚糖微球及其制备工艺和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地讲，涉及一种绿原酸壳聚糖微球及其制备工艺和应用。

背景技术

绿原酸(chlorogenic acid CA)是植物体在有氧呼吸过程中合成的一种苯丙素类物质，分子式为C₁₆O₁₈O₉且分子量为345.30，是许多中草药如金银花、杜仲、茵陈等的主要有效成分，也是众多水果蔬菜中的重要活性成分。

绿原酸具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利胆等多种功效，近年来还发现，绿原酸具有抗癌、抗艾滋病等作用，可作用于开发抗癌、抗艾滋病的药物。同时，作为良好的抗氧化剂，绿原酸被广泛地应用于医药、食品等各个领域。

然而，绿原酸为活性小分子物质，亲水性好却亲脂性差，其与细胞的亲和力不足、半衰期较短，使得其口服时的生物利用度较低。为了实现绿原酸的有效口服利用并扩大其应用范围，有必要对其进行剂型改造以提高口服有效性。

壳聚糖是甲克素经脱乙酰化处理后所得到的产物，具有独特的生物学特征，它无毒、具有良好的生物相容性并且可生物降解、无抗原性，是一种优良的生物材料。并且，壳聚糖具有良好的成膜性，可以利用它制成包含药物的凝胶、膜或微球等，并作为药物环视、控释载体的材料。目前，以壳聚糖为材料制备制剂的研究，已经取得了巨大进展。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种绿原酸壳聚糖微球及其制备方法和应用，帮助改变绿原酸理化性质上的不足并改善绿原酸在口服生物利用度上的局限性，为绿原酸的开发应用提供更多的参考和思路。

本发明提供了一种绿原酸壳聚糖微球，所述绿原酸壳聚糖微球是以绿原酸为主药并以壳聚糖或三甲基壳聚糖为载体材料制备得到的微球。

根据本发明的绿原酸壳聚糖微球的一个实施例，所述绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1。。

根据本发明的绿原酸壳聚糖微球的一个实施例，所述绿原酸壳聚糖微球是通过乳化交联法、喷雾干燥法或胶凝法制备而成的。

本发明还提供了上述绿原酸壳聚糖微球的制备工艺，采用乳化交联法制备，具体包括以下步骤：

将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液，其中，所述绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1；

将乳化剂加入油相中均匀混合得到混合液；

将所述绿原酸壳聚糖溶液缓慢地滴加到所述混合液中并不断搅拌，得到W/O型乳剂；

向所述W/O型乳剂中滴加戊二醛，静置反应；反应结束后除去油相并抽滤，再洗去微球表面的油相并洗去未反应的戊二醛，脱水后收集微球；

将微球真空干燥，得到绿原酸壳聚糖微球。

根据本发明的绿原酸壳聚糖微球的制备工艺的一个实施例，所述绿原酸壳聚糖溶液为6～10份，所述乳化剂为0.5～2份，所述油相为3～7份。

根据本发明的绿原酸壳聚糖微球的制备工艺的一个实施例，所述乳化剂为司盘80或吐温80；所述油相为色拉油、大豆油或小麦胚芽油。

本发明还提供了上述绿原酸壳聚糖微球的制备工艺，采用喷雾干燥法制备，具体包括以下步骤：

将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液，其中，所述绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1；

将所述绿原酸壳聚糖溶液静置后进行喷雾干燥，得到绿原酸壳聚糖微球。

本发明还提供了上述绿原酸壳聚糖微球的制备工艺，采用胶凝法制备，具体包括以下步骤：

将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液，其中，所述绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1；

在持续搅拌的条件下，采用注射器将所述绿原酸壳聚糖溶液缓慢地加入阴离子胶凝剂的水溶液中，其中，所述阴离子胶凝剂为硫酸盐、三聚磷酸盐和海藻酸盐中的任意一种；

过滤并将所得微球洗净、干燥，得到绿原酸壳聚糖微球。

本发明又提供了上述绿原酸壳聚糖微球在制备药物中的应用。

根据本发明的绿原酸壳聚糖微球在制备药物中的应用的一个实施例，将所述绿原酸壳聚糖微球与医学上可接受的辅料或辅助性成分一起加工成胶囊剂、冻干粉针剂或口服剂。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明采用适宜的方法将壳聚糖和绿原酸制备成绿原酸壳聚糖微球，从而能够有效增加绿原酸对生物膜的通透性，提高绿原酸的口服生物利用度，帮助绿原酸在体内发挥药效，帮助改变了绿原酸理化性质上的不足并改善了绿原酸在口服生物利用度上的局限性，为绿原酸的开发应用提供更多的参考和思路。

附图说明

图1示出了实施例1中利用乳化交联法的不同处方制备得到的绿原酸壳聚糖微球的SEM图片(A、B、C、D分别对应于处方A、处方B、处方C、处方D)。

图2示出了实施例2中利用喷雾干燥法的不同处方制备得到的绿原酸壳聚糖微球的SEM图片(上图对应处方1，下图对应处方2)。

图3示出了实施例4中制备的绿原酸壳聚糖微球的体外释放曲线。

图4示出了实施例5中Caco-2细胞对绿原酸壳聚糖微球和绿原酸原料药的吸收百分率对比图。

具体实施方式

在下文中，将对本发明的绿原酸壳聚糖微球及其制备工艺和应用的示例性实施例进行详细说明。

绿原酸是属于多酚类的小分子单体，其存在广泛的生物活性和药用价值，然而其存在水溶性较高而脂溶性低和透膜吸收能力差的特点，这导致其与细胞的亲和性较差且口服生物利用度较低，在一定程度上限制了其应用。壳聚糖具有良好的成膜性，可以利用它制成包含药物的凝胶、膜或微球等，并作为药物环视、控释载体的材料。微球是指药物分散或被吸附在高分子、聚合物基质中而形成的微粒分散体系。本发明针对绿原酸亲水性强而亲脂性差且口服半衰期短、生物利用度差的特点进行了相应的研究，希望通过制备绿原酸壳聚糖微球并进而将其制备成各种制剂，从而增加绿原酸对生物膜的通透性，提高绿原酸的口服生物利用度，帮助绿原酸在体内发挥药效。

根据本发明的示例性实施例，所述绿原酸壳聚糖是以绿原酸为主药并以壳聚糖或三甲基壳聚糖为载体材料制备得到的微球。也即，本发明的绿原酸微乳是以绿原酸为主药，以壳聚糖或三甲基壳聚糖为载体材料，并可以根据制备方法的不同添加一定的辅料制成的微球，从而能够实现帮助改变绿原酸理化性质上的不足并改善绿原酸在口服生物利用度上的局限性的目的。

具体地，绿原酸可以为从植物中提取的或通过化学合成的绿原酸原料药。例如，可以从金银花、牛蒡子、杜仲叶等植物中进行绿原酸的提取。优选地，绿原酸原料药的纯度为98％以上。

根据本发明的示例性实施例，上述绿原酸壳聚糖微球可以采用如乳化交联法、喷雾干燥法或胶凝法等多种方法制备而成，只要能够制备得到上述的绿原酸壳聚糖微球即可。

为了更全面的公开和保护本发明的绿原酸壳聚糖微球，本发明还具体提供了几种制备上述绿原酸壳聚糖微球的工艺。

工艺一：采用乳化交联法

具体步骤为：

1)将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液。其中，绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1。

本发明中所述的绿原酸壳聚糖溶液是指绿原酸与壳聚糖混合后溶解于酸溶中形成的溶液。其中，由于壳聚糖的结构式显示其含有较多的氨基，为了使其更容易溶解，通常会将酸液与壳聚糖一起使用。根据本发明，所述酸液可以为乙酸、盐酸等。本发明选用了乙酸溶液进行制备，乙酸溶液可以选用适宜浓度的乙酸溶液，例如体积浓度为3％的乙酸溶液，但本发明不限于此。

2)将乳化剂加入油相中均匀混合得到混合液。其中，乳化剂可以为司盘80或吐温80，本发明中使用的乳化剂是指帮助水相在油相中扩散的表面活性剂；油相可以为色拉油、大豆油或小麦胚芽油，油相是为了在乳剂制备的过程中形成油包水(W/O)型的乳剂。

3)将绿原酸壳聚糖溶液缓慢地滴加到混合液中并不断搅拌，得到W/O型乳剂。

其中，绿原酸壳聚糖溶液、油相与乳化剂的配比是可以根据要求灵活调配的，因为不同的配比制备得到的微球的粒径、释放度都会不同，可以根据具体需求优化处方。根据本发明的一个实施例，绿原酸壳聚糖溶液为6～10份，所述乳化剂为0.5～2份，所述油相为3～7份。优选地，绿原酸壳聚糖溶液为8份，所述乳化剂为1份，所述油相为5份，在该处方配比之下能够制备得到粒径均一、大小适宜、形态圆整的微球。

4)向W/O型乳剂中滴加戊二醛，静置反应；反应结束后除去油相并抽滤，再洗去微球表面的油相并洗去未反应的戊二醛，脱水后收集微球。其中，戊二醛会与W/O型乳剂发生固化交联反应，待反应基本结束后则除去油相并抽滤；此外，可以采用石油醚洗去微球表面的油相，用亚硫酸氢钠溶液洗去未交联的戊二醛，用丙酮进行脱水处理，但本发明不限于此。

其中，戊二醛用于实现对壳聚糖的“交联”作用，从而能够使得壳聚糖稳定地联合在一起形成微球。戊二醛的浓度可以根据需求进行选择，例如，可以选择浓度为25％的戊二醛。

5)最后，将微球进行真空干燥就可以得到绿原酸壳聚糖微球。

工艺二：采用喷雾干燥法

具体步骤为：

1)将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液。其中，绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1。酸液也可以选择体积浓度为3％的乙酸溶液，但本发明不限于此。

2)将绿原酸壳聚糖溶液静置后并待气泡被除去后进行喷雾干燥，得到绿原酸壳聚糖微球。

工艺三：采用胶凝法

具体步骤为：

1)将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液。其中，绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1。酸液也可以选择体积浓度为3％的乙酸溶液，但本发明不限于此。

2)在持续搅拌的条件下，采用注射器将绿原酸壳聚糖溶液缓慢地加入阴离子胶凝剂的水溶液中。其中，阴离子胶凝剂可以为硫酸盐、三聚磷酸盐和海藻酸盐中的任意一种。阴离子胶凝剂的水溶液的浓度可以根据需要具体选择，例如可以选用1mg/mL左右的浓度值。

其中，阴离子凝胶剂的加入有助于壳聚糖形成凝胶。

3)过滤并将所得微球洗净、干燥，得到绿原酸壳聚糖微球。

根据本发明，上述绿原酸壳聚糖微球以及根据上述工艺制备得到的绿原酸壳聚糖微球能够增强细胞对于绿原酸的吸收，并且能够显著地提高绿原酸的口服生物利用度。

此外，本发明还提供了上述绿原酸壳聚糖微球在制备药物中的应用。具体地，将上述绿原酸壳聚糖微球与医学上可接受的辅料或辅助性成分一起加工成胶囊剂、冻干粉针剂、口服剂等，其可以改善绿原酸的理化性质，从而使绿原酸可以实现非注射途径发挥其已有的药效，从而改善绿原酸在应用上的局限性。

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1：利用乳化交联法制备绿原酸壳聚糖微球

1.实验材料和仪器

从杜仲叶中提取的纯度为98.9％的绿原酸、壳聚糖(210kDa，济南海得贝海洋生物工程有限公司)、三甲基壳聚糖(济南海得贝海洋生物工程有限公司)、戊二醛、司盘80和吐温80(均购自成都宝信试剂有限公司)、食用大豆油、色拉油、小麦胚芽油等。

日立高新扫描电子显微镜(日立)、高效液相色谱法(日本岛津)、磁力搅拌器、电子天平、真空干燥箱、激光粒度仪(马尔文)等。

2.制备处方和方法

不同绿原酸壳聚糖微球的制备处方如表1所示。

将处方量的绿原酸与处方量的壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于体积浓度为3％的乙酸溶液中得到绿原酸壳聚糖溶液，待用；将处方量的乳化剂加入到适宜的油相中，搅拌均匀后得到混合液，待用；将配制得到的绿原酸壳聚糖溶液缓慢地滴加到混合液中并不断搅拌，得到W/O型乳剂；随即向所得W/O型乳剂中滴加浓度为25％的戊二醛(5mL)，静置并固化交联反应2h，去掉油相，用加有0.45μm微孔滤膜的布氏漏斗抽滤并用石油醚洗去微球表面的油相、用质量浓度为2％的亚硫酸氢钠溶液洗去未交联的戊二醛，并用丙酮脱水后真空干燥2d，即可得绿原酸壳聚糖微球。

表1 利用乳化交联法制备绿原酸微球的不同处方

3.所制备的绿原酸壳聚糖微球的性质考察结果

3.1不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的性状考察

收集不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球，使用扫描电子显微镜对微球的形态进行考察，实验结果如图1所示。由图1可见，A、B、C、D四种处方均能制备大小较为均一的绿原酸壳聚糖微球，且微球形态较为圆整、均匀。

3.2不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的粒径考察

取不同处方制备的绿原酸壳聚糖微粒，以水为分散介质，分别用马尔文激光粒度仪对其粒径进行检测，结果如表2所示。由表2可知，采用A、B、C、D四种处方制备的绿原酸壳聚糖微粒的粒径较为均一，分散系数(PDI)均较小，且平均粒径均分布在1.5～3μm。

表2 不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的粒径分布

3.3不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率检测

为了检测不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率，本实施例选择酸溶液溶解的方法溶解绿原酸壳聚糖微球，使包裹在微球中的绿原酸释放到酸性介质中，并通过高效液相色谱方法检测并计算了不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率。包封率的计算公式为：包封率(％)＝微球中实际的绿原酸质量/制备微球时绿原酸的投药量×100％。表3列出了不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率，由表3数据可知采用乳化交联法制得的绿原酸微球的包封率较高。

表3 绿原酸壳聚糖微球的包封率

4.实验结论

本实施例采用乳化交联法制备了不同处方的绿原酸壳聚糖微球并且在制备过程中采用了不同的乳化剂和油相，还对所制得的绿原酸壳聚糖微球的性质进行考察。结果显示，不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球表现出较好的微球形态，粒径分布较为均一；其中，处方C和处方D在包封率方面高于其余处方，表现出更大的应用潜力。

实施例2：利用喷雾干燥法制备绿原酸壳聚糖微球

1.实验试药和仪器

从金银花中提取的纯度为99.9％的绿原酸、壳聚糖(210kDa，济南海得贝海洋生物工程有限公司)、三甲基壳聚糖(济南海得贝海洋生物工程有限公司)、盐酸、小型喷雾干燥机(瑞士Richi公司)、日立高新扫描电子显微镜(日立)、高效液相色谱法(日本岛津)、磁力搅拌器、电子天平、真空干燥箱、激光粒度仪(马尔文)等。

2.制备方法

具体处方如表4所示。

将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于0.1mol/L的盐酸中，形成绿原酸壳聚糖溶液。其中，绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1.5:1，将溶解后的溶液静置一段时间并待气泡被除去后进行喷雾干燥，即得到流动性较好的绿原酸壳聚糖微球。

表4 利用喷雾干燥法制备绿原酸壳聚糖微球的不同处方

处方	绿原酸(g)	壳聚糖或三甲基壳聚糖(g)
			处方1	绿原酸(1.5g)	壳聚糖(1g)
处方2	绿原酸(1.5g)	三甲基壳聚糖(1g)

3.喷雾干燥法制得的绿原酸壳聚糖微球的性质考察

3.1不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的性状和粒径考察

分别使用扫描电镜观察喷雾干燥法制得的两种绿原酸壳聚糖微球的形态，喷雾干燥能使绿原酸与壳聚糖形成球形的微粒。并且，使用激光粒度仪对处方1和处方2的绿原酸壳聚糖微球的粒径进行检测，实验结果如表5和图2所示。由表5和图2可知，绿原酸壳聚糖微球的平均粒径分布在10μm上下，不同处方的粒径分布情况略有差别，其中根据处方1制备的绿原酸壳聚糖微球的粒径分布较为均匀。

表5 不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的粒径分布

处方	粒径(μm)	粒径分布(PDI)
			处方1	9.38±0.79	0.18±0.11
处方2	10.29±3.66	0.65±0.23

3.2不同处方制备的的绿原酸壳聚糖微球的包封率检测

为了检测通过喷雾干燥法制备的不同处方的绿原酸壳聚糖微球的包封率，本实施例选择酸溶液溶解的方法溶解绿原酸壳聚糖微球，使包裹在微球中的绿原酸释放至酸性介质中，并通过高效液相色谱方法检测并计算了不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率。包封率的计算公式为：包封率(％)＝微球中实际的绿原酸质量/制备微球时绿原酸的投药量×100％。表6列出了不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率。

表6 不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率

4.实验结果

本实施例采用喷雾干燥的方法并利用绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖制备了绿原酸壳聚糖微球颗粒，并对其粒径和包封率等进行了检测。该工艺简单方便且未加入有机溶剂，对于制剂质量的控制更为有利，适合大规模生产；并且，制得的绿原酸壳聚糖微球的包封率较高，具有较大的应用潜力。

实施例3：凝胶法制备绿原酸壳聚糖微球的实验

1.实验材料和仪器

从牛蒡子中提取的纯度为99.2％的绿原酸、壳聚糖(210kDa，济南海得贝海洋生物工程有限公司)、高效液相色谱法(日本岛津)、磁力搅拌器、电子天平、真空干燥箱、激光粒度仪(马尔文)等。

2.制备方法

具体的处方分组如表7所示。

将绿原酸与壳聚糖混合后溶解于体积浓度为3％的乙酸溶液中，形成绿原酸壳聚糖溶液，其中，绿原酸与壳聚糖的质量比为1.5:1；在持续搅拌的条件下，用注射器将绿原酸壳聚糖溶液缓慢地加入浓度为1mg/mL的阴离子胶凝剂水溶液中，过滤后将所得的微球洗净干燥即得绿原酸壳聚糖微球。

表7 利用凝胶法制备绿原酸壳聚糖微球的不同处方

处方	绿原酸(g)	阴离子胶凝剂	壳聚糖(g)
				处方1	绿原酸(1.5g)	硫酸钠	壳聚糖(1g)
处方2	绿原酸(1.5g)	三聚磷酸钠	壳聚糖(1g)
				处方3	绿原酸(1.5g)	海藻酸钠	壳聚糖(1g)

3.不同处方制得的绿原酸壳聚糖微球的粒径检测

用激光粒度仪分别对凝胶法制备的不同处方的绿原酸壳聚糖微球进行检测，其粒径分布的结果如表8所示。由表8可知，使用海藻酸钠的处方3制备得到的绿原酸壳聚糖微球的粒径分布更为均匀。

表8 不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的粒径分布

处方	粒径(nm)	粒径分布(PDI)
			处方1	235±56.1	0.45±0.12
处方2	333±66.7	0.76±0.42
			处方3	212±12.7	0.28±0.14

4.不同处方制得的绿原酸壳聚糖微球的包封率

为了检测通过凝胶法制备的不同处方的绿原酸壳聚糖微球的包封率，本实施例选择酸溶液溶解的方法溶解绿原酸壳聚糖微球，使包裹在微球中的绿原酸释放至酸性介质中，并通过高效液相色谱方法检测并计算了不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率。包封率的计算公式为：包封率(％)＝微球中实际的绿原酸质量/制备微球时绿原酸的投药量×100％。表9列出了不同处方制备的绿原酸壳聚糖微球的包封率。其中，根据处方3所制得的绿原酸壳聚糖微球的包封率相对较高。

表9 绿原酸壳聚糖微球的包封率

实施例4：绿原酸壳聚糖微球的体外释放考察

1.实验材料和仪器

从牛蒡子中提取的纯度为99.2％的绿原酸、壳聚糖(210kDa，济南海得贝海洋生物工程有限公司)、高效液相色谱法(日本岛津)、磁力搅拌器、电子天平、真空干燥箱、节流分子量为1000的透析袋等。

2.绿原酸壳聚糖微球的制备

本实施例采用凝胶法制备绿原酸壳聚糖微球，称取绿原酸1g与壳聚糖1g混合后溶解于体积浓度为3％乙酸溶液中形成绿原酸壳聚糖溶液；在持续搅拌的条件下，用注射器将绿原酸壳聚糖溶液缓慢地加入浓度为1mg/mL的海藻酸钠凝胶水溶液中；过滤后将所得的微球洗净干燥，即得绿原酸壳聚糖微球。

3.绿原酸壳聚糖微球的体外释放实验

称取上述制得的绿原酸壳聚糖微球500mg并置于截留分子量为1000的透析袋中，加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液2mL，用透析夹夹紧后置于200mLpH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，以100rpm/min的速度搅拌并于37℃的条件下透析。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48h时分别精密吸取2.0mL的释放液，同时补加缓冲液。将所取的液体经过0.45μm的微孔滤膜过滤之后，采用高效液相色谱法对不同时间段的绿原酸浓度进行测定并绘制绿原酸释放度—时间的曲线，实验结果如图3所示。由图3可知，在实验的48h内，绿原酸壳聚糖微球有明显的缓释效果，且48h内释放接近完全。

实施例5：绿原酸壳聚糖微球的细胞吸收情况考察

1.实验材料和仪器

从杜仲叶中提取的纯度为98.2％的绿原酸、从杜仲叶中提取的纯度为98.9％的绿原酸、三甲基壳聚糖(济南海得贝海洋生物工程有限公司)、戊二醛和司盘80(均购自成都宝信试剂有限公司)、大豆油、甲醇、乙腈、四氢呋喃、冰醋酸、无水乙醇、HPLC系统、pH计等。

2.实验方法

2.1绿原酸壳聚糖微球的制备

称取壳聚糖300mg，用体积浓度为3％的乙酸溶液溶解形成壳聚糖溶液，将从杜仲叶中提取的纯度为98.2％的绿原酸300mg溶解于上述壳聚糖溶液中，形成绿原酸壳聚糖溶液。其中，绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1，将溶解后的溶液静置一段时间并待气泡被除去后进行喷雾干燥，即得到流动性较好的绿原酸壳聚糖微球。

2.2绿原酸壳聚糖微球的细胞吸收实验

取对数期生长的Caco-2细胞接种于12孔板内，常规培养24h后将绿原酸壳聚糖微球和绿原酸原料药分别用适宜的溶剂稀释到绿原酸的终浓度为5mg/mL。弃去细胞的培养基，将上述绿原酸壳聚糖微球和绿原酸原料药分别加入细胞内继续常规培养4h，4h后收集细胞并采用反复冻融的方式破碎细胞，并用二氯甲烷对混悬液进行萃取；离心处理后取上层的水溶液，利用微孔滤膜过滤后用高效液相色谱仪对其中的绿原酸含量进行测定，计算细胞对绿原酸的吸收百分比。

3.实验结果

绿原酸的吸收实验结果如图4所示。由图4可知，绿原酸壳聚糖微球系统相比于绿原酸原料药，能够显著地促进绿原酸被细胞所摄取，两者之间具有非常显著性差异(p<0.01)，这一现象可能是由于制剂提高了绿原酸的生物相容性，使其更易与细胞结合。

实施例6：绿原酸壳聚糖微球的体内生物利用度考察

1.实验材料和仪器

从杜仲叶中提取的纯度为98.2％的绿原酸、从杜仲叶中提取的纯度为98.9％的绿原酸、壳聚糖(210kDa，济南海得贝海洋生物工程有限公司)、戊二醛和司盘80(均购自成都宝信试剂有限公司)、色拉油、甲醇、乙腈、四氢呋喃、冰醋酸、无水乙醇、HPLC系统、pH计等。

2.实验方法

2.1绿原酸壳聚糖微球的制备

在无菌的条件下，将从杜仲叶中提取的纯度为98.2％的绿原酸500mg与壳聚糖250mg混合后，溶解于体积浓度为3％的乙酸溶液中，形成绿原酸壳聚糖水溶液；在持续搅拌的条件下，用注射器将绿原酸壳聚糖水溶液缓慢地加入浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠水溶液中，过滤后将所得的微球洗净干燥即得绿原酸壳聚糖微球，将得到的微球分散于适量的注射用水中，即得绿原酸壳聚糖微球的口服剂。

2.2动物分组和实验方法

取6周龄的SD大鼠共210只，随机分为三组，每组70只大鼠，分别命名为绿原酸原料药组(CGA组)、绿原酸壳聚糖微球组(CGA-MS组)和空白对照组(B组)。将所有大鼠禁食12h之后，分别对CGA组和CGA-MS组给予绿原酸原料药和绿原酸微乳灌胃，大鼠口服绿原酸的药物剂量为40mg/kg。将大鼠灌胃后，分别于5min、10min、15min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、8h和12h时分别对各组大鼠尾部取血2.0mL，以3000r/min的速率离心10min得上层血清，每个时间点分别取5只大鼠的样品。

2.3样品的检测

取300μL上述得到的血清并置于10mL的尖嘴玻璃管中，加入5mL的甲醇并采用电动混匀器混匀之后以10000r/min的速率离心20min；再取上层清液置于尖嘴玻璃管中，并置于37℃的水浴中用氮气流吹干，再用100μL的流动相溶解，再次使用10000r/min的速率离心20min，取上清液进样；采用HPLC系统对绿原酸含量进行测定，得到各组的大鼠血清绿原酸药时曲线并得出相应的药代动力学参数。

3.实验结果

本实施例研究了不同的形式的绿原酸，以口服给药的途径进入大鼠体内后的相对生物利用度。最终的实验结果显示，以CGA组作为参比，CGA-MS组的相对生物利用度分别为378.2％，即：绿原酸壳聚糖微球的形成使得绿原酸的口服生物利用度显著提高。

实施例7：绿原酸壳聚糖微球胶囊的制备

1.处方

合成的纯度为68.2％的绿原酸250mg、壳聚糖250mg、司盘80100mg、大豆油500mg。

2.制法

将250mg绿原酸与250mg三甲基壳聚糖混合后溶解于体积浓度为3％的乙酸溶液300mg中得到绿原酸壳聚糖溶液，待用；将100mg的司盘80加入到500mg大豆油中，搅拌均匀后得到混合液，待用；将配制的绿原酸壳聚糖溶液缓慢地滴加到混合液中，不断搅拌得到W/O型乳剂；随即向W/O型乳剂中滴加1mL质量浓度为25％的戊二醛，静置并固化交联2h后，去掉油相并采用加有0.45μm微孔滤膜的布氏漏斗抽滤，并用石油醚洗去微球表面的油相、用质量浓度为2％的亚硫酸氢钠溶液洗去未交联的戊二醛，再利用丙酮脱水并真空干燥2d后，得到绿原酸壳聚糖微球。将所得绿原酸壳聚糖微球封存于0号胶囊壳中，即得绿原酸壳聚糖微球胶囊剂。

实施例8：绿原酸壳聚糖微球冻干粉针剂的制备

1.处方

从杜仲叶中提取的绿原酸纯度为99.6％的绿原酸5g、壳聚糖10g。

2.制法

在严格无菌的条件下，称取壳聚糖10g，用体积浓度为3％的乙酸溶液溶解形成壳聚糖溶液，将从杜仲叶中提取的纯度为99.6％的绿原酸5g溶解于上述壳聚糖溶液中，形成绿原酸壳聚糖溶液。其中，绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为2:1，将溶解后的溶液静置一段时间并待气泡被除去后进行喷雾干燥，即得到流动性较好的绿原酸壳聚糖微球，将得到的绿原酸壳聚糖微球灌装成粉针剂，即得绿原酸壳聚糖微球的冻干粉针剂。

实施例9：绿原酸壳聚糖微球口服剂的制备

1.处方

从金银花中提取的纯度为98.7％的绿原酸2g、壳聚糖1g、1mg/mL的海藻酸钠溶液。

2.制备方法

在无菌的条件下，将绿原酸与壳聚糖混合后溶解于体积浓度为3％的乙酸溶液中，形成绿原酸壳聚糖水溶液；在持续搅拌的条件下，用注射器将绿原酸壳聚糖水溶液缓慢地加入浓度为1mg/mL的硫酸钠水溶液中，过滤后将所得的微球洗净干燥即得绿原酸壳聚糖微球，将得到的绿原酸壳聚糖微球分散于适量的注射用水中，即得绿原酸壳聚糖微球的口服剂。

由于绿原酸的亲水性较好而亲脂性差，其口服生物利用度较低且细胞吸收性较差。本发明针对这些特点对绿原酸进行剂型改造，以无毒且生物相容性良好的壳聚糖作为载体，分别使用乳化交联法、喷雾干燥法和凝胶法制备了不同的绿原酸壳聚糖微球，并对它们的性状、粒径分布、包封率和体外释放情况等进行了考察，最后将绿原酸壳聚糖微球延伸到了胶囊等剂型的制备。结果显示，绿原酸壳聚糖微球是一种包封率较高、释放持续时间较长且能够促进细胞吸收的新型绿原酸制剂。

综上所述，本发明有益于绿原酸改变其自身的理化性质，进而发挥更为广泛的疗效作用；有益于将绿原酸制成缓释制剂，以便提高患者使用绿原酸的顺应性；有益于通过口服给药途径发挥绿原酸的药理活性，对于绿原酸的深入开发和应用具有深远意义。

尽管上面已经结合示例性实施例描述了本发明的绿原酸壳聚糖微球及其制备工艺和应用，但是本领域普通技术人员应该清楚，在不脱离权利要求的精神和范围的情况下，可以对上述实施例进行各种修改和变化。

Claims (10)

1.一种绿原酸壳聚糖微球，其特征在于，所述绿原酸壳聚糖微球是以绿原酸为主药并以壳聚糖或三甲基壳聚糖为载体材料制备得到的微球。

2.根据权利要求1所述的绿原酸壳聚糖微球，其特征在于，所述绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1。

3.根据权利要求1所述的绿原酸壳聚糖微球，其特征在于，所述绿原酸壳聚糖微球是通过乳化交联法、喷雾干燥法或胶凝法制备而成的。

4.权利要求1至2中任一项所述的绿原酸壳聚糖微球的制备工艺，其特征在于，采用乳化交联法制备，具体包括以下步骤：

将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液，其中，所述绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1；

将乳化剂加入油相中均匀混合得到混合液；

将所述绿原酸壳聚糖溶液缓慢地滴加到所述混合液中并不断搅拌，得到W/O型乳剂；

向所述W/O型乳剂中滴加戊二醛，静置反应；反应结束后除去油相并抽滤，再洗去微球表面的油相并洗去未反应的戊二醛，脱水后收集微球；

将微球真空干燥，得到绿原酸壳聚糖微球。

5.根据权利要求4所述的绿原酸壳聚糖微球的制备工艺，其特征在于，以重量份计，所述绿原酸壳聚糖溶液为6～10份，所述乳化剂为0.5～2份，所述油相为3～7份。

6.根据权利要求4所述的绿原酸壳聚糖微球的制备工艺，其特征在于，所述乳化剂为司盘80或吐温80，所述油相为色拉油、大豆油或小麦胚芽油。

7.权利要求1至2中任一项所述的绿原酸壳聚糖微球的制备工艺，其特征在于，采用喷雾干燥法制备，具体包括以下步骤：

将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液，其中，所述绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1；

将所述绿原酸壳聚糖溶液静置后进行喷雾干燥，得到绿原酸壳聚糖微球。

8.权利要求1至2中任一项所述的绿原酸壳聚糖微球的制备工艺，其特征在于，采用胶凝法制备，具体包括以下步骤：

将绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖混合后溶解于酸液中，得到绿原酸壳聚糖溶液，其中，所述绿原酸与壳聚糖或三甲基壳聚糖的质量比为1:1～2:1；

在持续搅拌的条件下，采用注射器将所述绿原酸壳聚糖溶液缓慢地加入阴离子胶凝剂的水溶液中，其中，所述阴离子胶凝剂为硫酸盐、三聚磷酸盐和海藻酸盐中的任意一种；

过滤并将所得微球洗净、干燥，得到绿原酸壳聚糖微球。

9.权利要求1至3中任一项所述的绿原酸壳聚糖微球在制备药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的绿原酸壳聚糖微球在制备药物中的应用，其特征在于，将所述绿原酸壳聚糖微球与医学上可接受的辅料或辅助性成分一起加工成胶囊剂、冻干粉针剂或口服剂。