CN103446055B - 三羟基异黄酮脂质纳米体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及三羟基异黄酮脂质纳米体的制备方法。该方法的操作步骤如下：(1)将胆甾醇-水合物和大豆卵磷脂溶于三氯甲烷，水浴恒温旋转蒸发，得均匀薄膜；(2)将三羟基异黄酮溶于无水乙醇，再加入PBS缓冲液，得三羟基异黄酮混合液；(3)将三羟基异黄酮混合液、三颗玻璃小珠和吐温-80加入到均匀薄膜，水浴恒温旋转洗膜；(4)水浴超声，过微孔滤膜；(5)冷冻干燥，得到三羟基异黄酮脂质纳米体固体。包封率大于59.5%，载药量大于17.45%，三羟基异黄酮脂质纳米体固体为颗粒均匀的粉状固体，颗粒的平均粒径为50～60nm，96％的脂质体粒径在100nm以内。三羟基异黄酮脂质纳米体提高了三羟基异黄酮在体内的生物利用率。
Description
技术领域
本发明涉及纳米体领域，具体涉及三羟基异黄酮脂质纳米体的制备方法。
背景技术
大豆异黄酮主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，但含量极少，并且提取极为困难，1吨大豆里也只能提取大约10公斤的大豆异黄酮，故有“植物软黄金”之称。目前发现的大豆中异黄酮共有12种，分为游离型的甙元和结合型的糖甙两类，甙元占总量的2％。—3％，包括3种异黄酮苷元，分别为5,7,4’-三羟基异黄酮(染料木素，Genistein,简称Gen)、7,4’-二羟基异黄酮(大豆黄素，Daidzein,简称Dai)和7,4’-二羟基-6-甲氧基异黄酮(黄豆黄素，Glycitein,简称Gly)，组成比例为5︰4︰1。其中，产生生理活性的组分主要是三羟基异黄酮和大豆黄素，三羟基异黄酮的生理活性高于大豆黄素。大豆异黄酮被称为“植物雌激素”，具有抗氧化、调节血脂、提高免疫力和抗辐射等诸多保健功效，在抗肿瘤、降血脂和对抗疾病方面有着重要的意义。但三羟基异黄酮难溶于水，机体内细胞很难吸收，故生物利用度低，影响其在体内的生物活性，并且其容易受外界环境（温度、湿度、氧气等）的影响，极大限制了它的活性和潜在的健康效益。
脂质纳米体（脂质小囊）是近年研究较多的一种剂型，它制备简单，应用方便，可多用途给药，是一种具有同生物膜性质类似的磷脂双份子层结构载体。普通脂质体（1～100μm）在应用中遇到一些局限性，原因在于其粒径太大，难以穿透细胞，而纳米尺寸的脂质体由于在穿透性能和体内被动靶向性等方面有特殊的性质，可以保护药物免受降解、直接达到靶向部位和减少毒副作用。
脂质体的膜材与哺乳动物细胞相似，无毒，具有良好的生物相容性。将三羟基异黄酮包裹进纳米脂质体中，可以增加其在体内的吸收，提高它的生物利用度。应用在保健食品和医药领域可以满足人们对高品质营养物质的需求社会效益和经济效益，应用前景广阔。
发明内容
为了提高三羟基异黄酮的稳定性以及其在人体内的吸收和生物利用度，本发明提供一种三羟基异黄酮脂质纳米体的制备方法。
三羟基异黄酮脂质纳米体的制备方法包括以下操作步骤：
(1) 按重量比0.1～0.2︰1取胆甾醇-水合物0.02g～0.04g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，在避光的条件下，用旋转蒸发器水浴恒温旋转蒸发，蒸发温度37℃；在容器内壁形成均匀薄膜，继续旋转10～15 分钟，除去残余溶剂备用；
(2) 按三羟基异黄酮和大豆卵磷脂的重量比0.015～0.025︰1，取三羟基异黄酮0.003～0.005g，溶于15 ml无水乙醇中混匀，再加入30 ml PBS缓冲液，PBS缓冲液的 pH值为7.0，充分混合，得到45ml三羟基异黄酮混合液；
(3) 将45ml三羟基异黄酮混合液、3～5颗玻璃小珠、0.05ml吐温-80加入到步骤（1）内壁有均匀薄膜的容器中，用旋转蒸发器水浴恒温旋转洗膜3小时，洗膜温度37℃；得到脂质体悬浮液；
(4) 将脂质体悬浮液在常温下超声10分钟，经过0.8μm的微孔滤膜，获得三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液；
(5) 将三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液冷冻干燥24小时，得到三羟基异黄酮脂质纳米体固体；所述三羟基异黄酮脂质纳米体固体的包封率分别为59.5～67.5%，载药量为17.45～22.12%，三羟基异黄酮脂质纳米体固体为颗粒均匀的粉状固体，且颗粒间彼此分散、独立，颗粒的平均粒径为50～60nm，96％的脂质体粒径在100nm以内。
所述PBS缓冲液由浓度0.2M的十二水磷酸氢二钠62ml、浓度0.2M的二水磷酸二氢钠38ml配制而成。
所述玻璃小珠的直径为5～6mm。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
本发明制备的产品以卵磷脂和胆固醇为包材，用旋转蒸发制膜的方法包裹三羟基异黄酮得到其脂质纳米体。该法制备的产品三羟基异黄酮的载药量和包封率较高，且脂质体的粒径达到纳米级。
本发明的工艺采取添加不同比值的胆固醇与卵磷脂、三羟基异黄酮与卵磷脂，改变制膜和洗膜的温度以及缓冲液pH值，分析产品的载药量、包封率、稳定性、粒径及其分布，从而得到较高载药量、包封率、稳定性和较小粒径的三羟基异黄酮脂质纳米体。即当温度为37℃，缓冲液pH值为7.0，胆固醇与卵磷脂之比为0.15︰1，三羟基异黄酮与卵磷脂之比为0.02︰1时，三羟基异黄酮脂质纳米体包封率为65.7％，且分布均匀、颗粒间彼此分散、独立，96％的脂质体粒径在100nm以下，透视电子显微镜下三羟基异黄酮脂质纳米体固体的结构见图1、激光粒度分析仪中三羟基异黄酮脂质纳米体固体的粒度分布见图2。
三羟基异黄酮脂质纳米体在4℃下贮藏十天，渗漏率、pH值、粒径平均范围为50～60nm，稳定性良好。
本发明所产生的三羟基异黄酮脂质纳米体固体将有利于生物体对三羟基异黄酮的吸收，动物实验两种饲喂对比，小鼠肝脏中三羟基异黄酮脂质纳米体的吸收率比单体三羟基异黄酮高出34.61%，提高了三羟基异黄酮在体内的生物利用率。
附图说明
图1为三羟基异黄酮脂质纳米体固体的透视电子显微镜图。
图2为激光粒度分析仪中三羟基异黄酮脂质纳米体固体粒度分布图。
图3为三羟基异黄酮脂质纳米体固体照片图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明。
以下实施例中所用主要原料的来源说明如下： 98%三羟基异黄酮购于西安飞达生物科技有限公司；大豆卵磷脂购于上海源聚生物科技有限公司；胆甾醇-水合物购于中国惠兴生化试剂；所述PBS缓冲液由浓度0.2M的十二水磷酸氢二钠62ml、浓度0.2M的二水磷酸二氢钠38ml配制而成；十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠均购自于国药集团化学试剂有限公司。
实施例1
(1) 按质量比0.1︰1取胆甾醇-水合物0.02g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，倒入圆底烧瓶中，在避光的条件下，用旋转蒸发器水浴恒温37℃旋转蒸发，在烧瓶内壁形成均匀薄膜，继续旋转约10分钟后，除去残余溶剂后备用；
(2) 按三羟基异黄酮和大豆卵磷脂的重量比0.015︰1，取三羟基异黄酮0.003g，溶于15 ml无水乙醇中混匀，再加入30 ml的 pH为7.0的PBS缓冲液，充分混合，得到45ml三羟基异黄酮混合液；
(3) 将45ml 三羟基异黄酮混合液、三颗玻璃小珠、0.05ml 吐温-80加入到形成薄膜的圆底烧瓶中，用旋转蒸发器水浴恒温37℃旋转洗膜3小时，得到脂质体悬浮液；
(4) 将脂质体悬浮液在常温下（25℃）超声10分钟，过0.8μm的微孔滤膜，得到三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液；
(5) 将三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液冷冻干燥24小时，得到包封率为59.5%、 载药量为20.23%的三羟基异黄酮脂质纳米体固体。三羟基异黄酮脂质纳米体固体为颗粒均匀的粉状固体，见图3，且颗粒间彼此分散、独立，颗粒的平均粒径为50～60nm，96％的脂质体粒径在100nm以内。
实施例2
(1) 按质量比0.15︰1取胆甾醇-水合物0.03g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，倒入圆底烧瓶中，在避光的条件下，用旋转蒸发器水浴恒温37℃旋转蒸发，在烧瓶内壁形成均匀薄膜，继续旋转约10分钟后，除去残余溶剂后备用；
(2) 按三羟基异黄酮和大豆卵磷脂的重量比0.02︰1，取三羟基异黄酮0.004g，溶于15 ml无水乙醇中混匀，再加入30 ml的 pH为7.0的PBS缓冲液，充分混合，得到45ml三羟基异黄酮混合液；
(3) 将45ml 三羟基异黄酮混合液、三颗玻璃小珠、0.05ml 吐温-80加入到形成薄膜的圆底烧瓶中，用旋转蒸发器水浴恒温37℃旋转洗膜3小时，得到脂质体悬浮液；
(4) 将脂质体悬浮液在常温下（25℃）超声10分钟，过0.8μm的微孔滤膜，得到三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液；
(5) 将三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液冷冻干燥24小时，得到包封率为65.7％、载药量为22.12%的三羟基异黄酮脂质纳米体固体。三羟基异黄酮脂质纳米体固体为颗粒均匀的粉状固体，且颗粒间彼此分散、独立，颗粒的平均粒径为50～60nm，96％的脂质体粒径在100nm以内。在4℃下密封保藏十天，其渗漏率、pH值、粒径的变化均不大，稳定性良好。
实施例3
(1) 按质量比0.2︰1取胆甾醇-水合物0.04g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，倒入圆底烧瓶中，在避光的条件下，用旋转蒸发器水浴恒温37℃旋转蒸发，在烧瓶内壁形成均匀薄膜，继续旋转约10分钟后除去残余溶剂后备用；
(2) 按三羟基异黄酮和大豆卵磷脂的重量比0.025︰1，取三羟基异黄酮0.005g，溶于15 ml无水乙醇中混匀，再加入30 ml的 pH为7.0的PBS缓冲液，充分混合，得到45ml三羟基异黄酮混合液；
(3) 将45ml 三羟基异黄酮混合液、三颗玻璃小珠、0.05ml 吐温-80加入到形成薄膜的圆底烧瓶中，用旋转蒸发器水浴恒温37℃旋转洗膜约3小时，得到脂质体悬浮液；
(4) 将脂质体悬浮液在常温下（25℃）超声10分钟，过0.8μm的微孔滤膜，得到三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液；
(5) 将三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液冷冻干燥24小时，得到包封率为67.5%、载药量为17.45%的三羟基异黄酮脂质纳米体固体。三羟基异黄酮脂质纳米体固体为颗粒均匀的粉状固体，且颗粒间彼此分散、独立，颗粒的平均粒径为50～60nm，96％的脂质体粒径在100nm以内。
最终产物表征特性：
向制备好的三羟基异黄酮脂质纳米体固体中加入乙酸乙酯，萃取游离的三羟基异黄酮，2000r/min离心5min，分离乙酸乙酯和脂质体。相同操作重复3次。上层有机层用旋转蒸发仪减压回收(34℃)，残留物用无水乙醇溶解定容为10ml，用紫外分光光度计法于260nm处测定吸光度并代入标准曲线方程，计算其所对应的三羟基异黄酮的量作为M游。按下式计算包封率：包封率=(M总一M游)/M总×100％。
1.随着大豆异黄酮与卵磷脂之比增加，包封率可增加，但是进一步增加其比例，导致包封率下降。这说明脂质体的囊泡空间有限，对药物的包埋具有饱和性。一旦药物用量超过脂质膜饱和限度，部分药物就有可能进入外面胶团中无法形成稳定的脂质体。
2.胆固醇使用量较低时能够增加脂质体双分子层膜的致密度，使芯材被更多的包埋于脂质中，但胆固醇比例过大时，双分子层结构刚性增强，形成的脂质体双分子层膜的总表面积减小，破坏了双分子组成，使包封率下降。
随着温度的升高，包封率有所增加，但是温度进一步升高，导致包封率降低，这可能是由于升高温度加速脂质氧化降解，使磷脂双分子层膜稳定性降低。
Claims (2)
1.三羟基异黄酮脂质纳米体的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)按重量比0.1～0.2：1取胆甾醇-水合物0.02g～0.04g和大豆卵磷脂0.2g，溶于20ml的三氯甲烷中，在避光的条件下，用旋转蒸发器水浴恒温旋转蒸发，蒸发温度37℃；在容器内
壁形成均匀薄膜，继续旋转10～15分钟，除去残余溶剂备用；
(2)按三羟基异黄酮和大豆卵磷脂的重量比0.015～0.025：1，取三羟基异黄酮0.003～0.005g，溶于15ml无水乙醇中混匀，再加入30ml PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.0，充分混合，得到45ml三羟基异黄酮混合液；
(3)将45ml三羟基异黄酮混合液、3～5颗玻璃小珠、0.05ml吐温-80加入到步骤(1)内壁有均匀薄膜的容器中，用旋转蒸发器水浴恒温旋转洗膜3小时，洗膜温度37℃；得到脂质体悬浮液；所述玻璃小珠的直径为5～6mm；
(4)将脂质体悬浮液在常温下超声10分钟，经过0.8μm的微孔滤膜，获得三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液；
(5)将三羟基异黄酮脂质纳米体膜过滤溶液冷冻干燥24小时，得到三羟基异黄酮脂质纳米
体固体；所述三羟基异黄酮脂质纳米体固体的包封率分别为59.5～67.5％，载药量为17.45～22.12％，三羟基异黄酮脂质纳米体固体为颗粒均匀的粉状固体，且颗粒间彼此分散、独立，颗粒的平均粒径为50～60nm，96％的脂质体粒径在100nm以内。
2.根据权利要求1所述的三羟基异黄酮脂质纳米体的制备方法，其特征在于：所述PBS缓冲液由浓度0.2M的十二水磷酸氢二钠62ml、浓度0.2M的二水磷酸二氢钠38ml配制而成。
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