CN101012232A - 天然抗癌药物单体芫花酯甲及其注射剂的配方与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种天然抗癌药物单体芫花酯甲的提取纯化新方法以及用它配制注射剂的配方与工艺。将瑞香科植物芫花的干燥根皮粉末，经过提取、分离、纯化，可制得纯度大于95％的芫花酯甲(芫花萜)。纯化时为避免芫花酯甲的分解，通过pH 7～9的缓冲溶液处理，获得稳定性好纯度高的芫花酯甲。将它用有机醇潜溶剂和增溶剂及pH 7～9的缓冲盐溶液，可配制成水溶性纳米胶囊芫花酯甲注射剂，可静脉给药，用于癌症的治疗。将它用可生物降解的聚乳酸－羟乙酸共聚物(PLGA)作载体材料，以乳化－溶剂挥发法制成粒径为5～20μm注射用芫花酯甲PLGA微球，通过对家兔静脉注射，获得良好的肺靶向选择，可用于肺癌的靶向治疗，并首次用一种螺吡喃类光致变色荧光染料标记芫花酯甲PLGA微球，通过组织切片影像学法对肺靶向性进行验证。

Description

天然抗癌药物单体芫花酯甲及其注射剂的配方与制备方法

技术领域

本发明涉及制药领域中一种天然抗癌药物单体芫花酯甲的提取纯化方法及其注射剂的的配制与靶向性药物的控释应用。

药物及其制剂的制备方法，特别是涉及治疗癌症的药物，属于天然药物单体制备及其靶向药物控释系统领域。

技术背景

癌症是严重威胁人类健康和生命的主要疾病之一。据WHO统计结果，全世界现有肿瘤患者约7600万，新发病例为870万，并且数字还在逐年增加，2005年死于癌症的人有760万。其中肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤死亡率的首位，全球每年有100万名新发肺癌患者，5年存活率不到14％，发病率及死亡率增长极为迅速，并呈现出年轻化趋势。化疗在癌症的治疗中起仍占有重要地位。但是大多数化学合成抗癌药物对癌细胞和正常组织细胞均具有较强的杀伤作用，并且产生许多严重的不良反应，成为治疗癌症的“双刃剑”。而天然抗癌药物因其具有特殊的立体结构，对癌症细胞具有很强的选择性，对正常细胞毒副作用小，已占据抗癌药物的“半壁江山”。随着分子生物学的飞速发展，抗癌药物的作用机理逐渐被揭示，化学结构新颖作用机理独特的天然抗癌研究与开发成为重点。

芫花酯甲(Yuanhuacine，芫花萜)是从中国特有的瑞香科植物芫花Daphne genkw aSieb.et Zucc.中提取分离得到的一种瑞香烷型二萜原酸酯类化合物，国内最早用于中晚期妊娠引产。[医药工业1978，(1)：6]国外主要是关注的是其抗癌活性研究。芫花酯甲体内外对多种癌细胞有较强的抑制作用。[Pharm.Sci.1982，71：1263，1340；Eur.J.Cancer Clin.Oncol.，1986，22：45]，其中对肺癌有较强的选择性[Bioorg.Med.Chem.，2005，13：64]。本发明人首次报道了对芫花酯甲DNA拓扑异构酶I具有较强的抑制作用其抗癌作用的可能机理，并对其构效关系进行了研究。[Bioorg.Med.Chem.，2006，14：3888]因此，芫花酯甲有可能成为继紫杉醇和喜树碱后又一种发展前景良好的新结构类型天然抗癌药物。

注射液在全身给药的化疗中起到了非常重要的作用，但对实体肿瘤细胞选择性低。近年来以人工合成聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly dl-lactide-co-glycolide，PLGA)具有良好的生物相容性以及生物降解时间可控性成为近年来最常采用的控缓释给药系统的载体材料之一。[Adv.Drug Deliv.Rev.1997，28：5]PLGA与抗癌药物制成的微球注射剂为癌症的靶向化疗提供了的一条有效途径，显示了良好的应用前景。美国肿瘤研究院(NCI)和Theodora统计结果显示，抗肺癌药物体外细胞试验、人癌移植模型与临床疗效之间有良好相关性。[British J.Cancer，2001，84：1424；Clinical Cancer Research，2003，15：4227]依据肺部毛细血管的生理特征，静脉注射7～20μm的微粒，可被肺组织毛细血管机械性滤阻而捕获。[J.Controlled Release，1997，49：157；Int.J.Pharm.，2003，265：1]据此我们设计出芫花酯甲PLGA微球注射剂，通过经静脉注射给药达到肺靶向给药治疗肺癌的目的。

目前国内外文献关于芫花酯甲报道有原料提取方法，注射剂，膜剂用于引产，体内外抗癌活性等。尚未见有作为抗癌用药方面的报道。主要存在以下不足：

1.芫花萜原料提取的纯度规定不少于85％，存在大量杂质，尚不适用于作为静脉注射用抗癌药物原料。尚未见有用C-18反相制备色谱联合使用缓冲盐用于制备纯化芫花萜的文献报道。

2.已有的芫花萜注射液为小剂量无水乙醇的灭菌溶液(2ml：0.08mg)，遇水后立即浑浊，不稳定，仅限于子宫腔内注射用于引产，不能作为抗癌药物直接用于静脉注射给药。

3.尚未见有芫花酯甲肺癌靶向制剂的文献报道。

本发明的目的是提供一种天然抗癌药物单体芫花酯甲(纯度＞95％)的提取方法，以及注射用癌症制剂的配制方法，特别是设计出注射用芫花酯甲PLGA微球用于肺癌的靶向治疗。

发明内容

本发明是用瑞香科植物芫花Daphne genkwa Sieb.et Zucc的干燥根皮粉末，经过提取、分离、纯化，制得纯度大于95％的天然抗癌药物单体芫花酯甲(芫花萜)。然后将它作为原料，配制出稳定性好的芫花酯甲水溶性纳米胶束注射液和注射用肺靶向芫花酯甲PLGA微球。

本发明的具体实施技术方案是：

天然抗癌药物单体芫花酯甲的制备方法：

首先将干燥的芫花根皮粉末，用90号或120号汽油作溶剂，加热回流，得到提取液，回收溶剂后，残渣用用石油醚-乙酸乙酯溶解；然后，把提取液加到硅胶(100～200目)柱中，用60～90℃石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集芫花酯甲组分，回收溶剂，残渣用甲醇溶解；再用C-18反相制备色谱纯化，用85％甲醇溶液作为洗脱液，在230nm波长处检测，收集芫花酯甲洗脱组分，加入磷酸钠缓冲盐调节pH值7～9，回收溶剂，残渣用无水乙醇加热溶解，过滤，除去磷酸钠不溶性缓冲盐，浓缩，析出结晶，100℃干燥，得纯度大于95.0％芫花酯甲。

芫花酯甲注射液的配方中有：

芫花酯甲      0.001～10％(重量百分数)

有机醇潜溶剂  1～99％(重量百分数)

增溶剂        0.005～5％(重量百分数)

缓冲盐        0～10％(重量百分数)

注射用水      0～95％(重量百分数)

总量为        100％(重量百分数)

芫花酯甲注射液的配制工艺为：

将芫花酯甲用有机醇潜溶剂溶解，再加入增溶剂，摇匀，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，分装，充氮气，熔封。100℃煮沸灭菌30分钟，得到芫花酯甲非水溶媒注射液。或将芫花酯甲用有机醇潜溶剂溶解，再加入增溶剂，再加入缓冲盐溶液，用氢氧化钠溶液调节溶液的pH值7～9，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，分装，充氮气，熔封。100℃煮沸灭菌30分钟，得到芫花酯甲水溶性纳米胶束注射液。

芫花酯甲注射液配方中所述的有机醇潜溶剂选自无水乙醇、丙二醇、丙三醇或聚乙二醇400-600，或2种有机醇潜溶剂的混合物；芫花酯甲注射液配方中所述的增溶剂选自吐温-80、吐温-60、吐温-40或吐温-20。芫花酯甲注射液配方中所述的缓冲盐选自磷酸钠、碳酸钠、醋酸钠、酒石酸钠或柠檬酸钠。

注射用芫花酯甲PLGA微球的制备配方之一中含有：

芫花酯甲PLGA微球1～50％(重量百分数)

助悬剂50-90％(重量百分数)

芫花酯甲PLGA微球的制备配方之二中含有：

芫花酯甲1-40％(重量百分数)

PLGA 60-99％；(重量百分数)

二氯甲烷：0.5～5ml

0.5～20％PVA水溶液5～100ml

注射用芫花酯甲PLGA微球的制备工艺为：

将可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(简称PLGA，50∶50，0.15dl/g)作为载体材料与芫花酯甲共溶于二氯甲烷中，超声溶解后，液面下1cm处匀速加到0.5-10％PVA溶液中，800rpm搅拌乳化，形成水/油乳剂，加入同体积的纯净水，持续搅拌10min，再将上述溶液加入到分散水相中，转速降至400rpm，室温搅拌6小时，使二氯甲烷充分挥发，形成5-20μm的固化微球，载药量20％；8000rpm离心5分钟，收集微球，再用纯净水洗涤三次，常温真空干燥24h，产率可达76.5％；最后加入助悬剂注射用右旋糖70混合制成无菌注射用芫花酯甲PLGA微球。

注射用芫花酯甲PLGA微球配方中所述的芫花酯甲PLGA微球平均粒径为5-20μm，用注射用水制成混悬液，静脉注射可选择性用于肺癌的靶向治疗。注射用芫花酯甲PLGA微球配方中所述的助悬剂选自注射用右旋糖苷70、右旋糖苷40、右旋糖苷20或甘露醇。芫花酯甲PLGA微球所述的PLGA选自共聚物的比例为40∶60～60∶40，分子量5000～30000，黏度0.10～0.30dl/g。

含量测定方法：

高效液相色谱法色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水-冰醋酸(65∶20∶15∶0.5)为流动相；检测波长为232nm，进样量20μl，理论板数按芫花酯甲峰计，不少于2000。芫花酯甲对照品甲醇溶液，在0.1562～40.00μg/ml浓度范围内线性关系良好。以峰面积(Area)与浓度(C)进行线性回归，回归方程为：C(μg/ml)＝2.3728×10^-5×Area-0.1611(r＝0.9998，n＝9)。(1)芫花酯甲原料测定：精密称取芫花酯甲，用甲醇溶解制成每1ml含20μg的溶液，依上述方法测定。(2)芫花酯甲注射液测定：精密量取芫花酯甲注射液，用甲醇稀释制成每1ml含20μg的溶液，依上述方法测定。(3)芫花酯甲PLGA微球注射剂测定：精密称取芫花酯甲PLGA微球，用乙腈溶解制成每1ml含20μg的溶液，依上述方法测定。(4)芫花酯甲PLGA微球体外释放度测定：取体外释放液，依上述方法测定。(5)血液中芫花酯甲浓度测定：精密量取肝素抗凝全血1ml，用乙醚-甲醇(9∶1)3ml萃取2次，吹干，精密加入甲醇0.1ml溶解，依上述方法测定。(6)组织中芫花酯甲浓度测定：精密称取各组织1.0g，置组织捣碎机中捣碎，精密加入乙腈5ml，超声3分钟，离心，取上清液3ml，吹干，精密加入乙腈0.1溶解，依上述方法测定。

回收溶剂方法对芫花酯甲稳定性的影响：

方法1：用85％甲醇溶液洗脱芫花酯甲组分，常压回收溶剂，芫花酯甲的纯度为76％；

方法2：用85％甲醇溶液洗脱芫花酯甲组分，减压回收溶剂，芫花酯甲的纯度为86％；

方法3：用85％甲醇溶液洗脱芫花酯甲组分，加1倍水稀释后，用氯仿提取，无水硫酸钠脱水后回收溶剂，芫花酯甲的纯度为95％；

方法4：用85％甲醇溶液洗脱芫花酯甲组分，加1倍水稀释后，用磷酸二氢钠调节pH 7.4用氯仿提取，无水硫酸钠脱水后回收溶剂，芫花酯甲的纯度为100％；

方法5：用85％甲醇溶液洗脱芫花酯甲组分，用磷酸二氢钠调节pH 7.4，减压回收溶剂，芫花酯甲的纯度为100％；

方法6：用甲醇：0.1％加入磷酸钠缓冲液(pH 7.4)溶液洗脱芫花酯甲组分，减压回收溶剂，芫花酯甲的纯度为100％。

上述方法得到芫花酯甲原料用HPLC峰面积归一化法测定结果。

从芫花根皮中提取3批芫花酯甲原料中试结果见表1。通过UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR的测试对其化学结构进行表征，与文献一致。[Bioorg.Med.Chem.，2006，14：3888；化学学报，1978，35：10]。

表1从芫花根皮中提取芫花酯甲原料中试结果

批号	20041001	20050501	20050602
				芫花根皮投料量kg	4.00	5.00	4.68
芫花萜g	0.684	0.872	0.820
				收率(％)	0.0171	0.0174	1.75
芫花萜(％)	98.6	99.2	99.5

芫花酯甲注射液抗癌癌活与作用机理研究：

芫花酯甲抗癌活性见表2。DNA拓扑酶I是存在于生物体内一种重要的酶，参与细胞内DNA复制，转录，重组，修复等细胞代谢过程，已经被美国国家癌症研究所确定为抗肿瘤药物重要靶点之一。DNA拓扑酶I活力的测定是以pBR322DNA为底物测定酶催化的松弛反应。按试剂盒说明用琼脂糖电泳法测定芫花酯甲对DNA拓扑酶I抑制作用，IC₅₀为40μM。构效关系分析结果芫花酯甲结构中原酸酯环部分是抑制DNA拓扑酶I活性的必须基团，对DNA拓扑酶I活性可能是其抗肿瘤作用机理之一。(见附图1)

表2芫花酯甲体外抗癌活性

细胞系或酶	IC50(μM)
		P-388	30.0
L-1210	10.1
		人鼻咽癌KB	1.95
人肺癌A549	0.15
		人黑色素A375	5.50
DNA拓扑异构酶I	40.0

不同pH值对芫花酯甲稳定性的影响：

不同pH值芫花酯甲注射液100℃加热1小时后稳定性的变化测定结果见表3。LC-MS测定结果表明：芫花酯甲在pH值低于6时加热其原酸酯环被水合开环为分子量均为666的3种同分异构体，而、在pH值7.0～9.0范围内芫花酯甲几乎无变化。

表3不同pH值对芫花酯甲注射液稳定性的影响

Rp	1	2	3	4	5	6	7
								pH值	2.5	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	9.0
芫花酯甲(％)	93.7	92.8	95.1	98.6	100.0	100.0	100.0
								新增分解物(％)	6.3	7.2	4.9	1.4	0.0	0.0	0.0

芫花酯甲注射液的溶血性：

芫花酯甲注射液1ml，用0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液40ml稀释后，为无色澄名明溶液。按国家食品药品监督管理局《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(2005[H]GPT4-1)依法测定，芫花酯甲注射液无溶血和红细胞粘集作用。

芫花酯甲注射液在家兔体内的药代动力学研究：

按国家食品药品监督管理局《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》(005[H]GPT5-1)依法测定，家兔耳缘静脉注射0.3mg/kg，给药后0.75、1.5、3、6、12、24、48、72小时采血，测定血药浓度，以血药浓度的对数-时间作图(附图2)，经Topfit药动学软件处理结果显示芫花酯甲静脉注射给药符合双室开放模型，消除相半衰期为10.6小时。

C＝2071.1e^-0.632t+341.1e^-0.0652t

表4芫花酯甲药动力学参数

α/h-1	β/h-1	t1/2(α)/h	t1/2(β)/h	MRT/h	Vss/L/kg	Cl/mL/min	AUC/μg·h/L
								0.632	0.0652	1.10	10.6	11.5	0.464	0.710	6500

家兔血液和尿液HPLC-UV与LC-MA分析结果表明：芫花酯甲在体内酯酶和氧化酶的作用下，生成代谢产物M-II(m/z390)。M-II在体内还原酶的作用下生成代谢产物M-I(m/z392)，经烯醇互变为极性更大的异构体M-III(m/z392)由尿液排出体外。尿中排泄物：M-I和M-III为82％，M-II为7％，芫花酯甲原型小于1％。

芫花酯甲PLGA微球质量评价：

芫花酯甲PLGA微球扫描电镜(JSM-5600LV，SEM，日本)照片见附图3。粒径分布(SA-CP3，SHIMADZA，日本)结果见附图4，平均粒径为9.0μm，5～20μm占86.3％。载药量20.0％，包封率91.5％。玻璃化温度为37℃。荧光标记芫花酯甲PLGA微球在紫外光365nm下呈红色(附黑白图中白点部分)，荧光显微照片见附图5。

芫花酯甲PLGA微球体外释放度评价：

在37℃磷酸盐缓冲液pH7.4中体外释放曲线见附图6。以芫花酯甲累计释放量(Q)对时间(t^1/2)进行拟合，符合Higuchi方程：Q＝22.334+5.802 (r＝0.9942，n＝10)，表明芫花酯甲从微球中释放方式为扩散模式。0.5小时突释量为26.4％，大部分是由微球表层吸附药物所引起的。随着PLGA的溶胀和逐步降解，药物扩散到释放介质中，累计释放量第1天达50.8％，第5天已达85.9％。微球体外降解过程中用扫描电子显微镜观察的形态变化，随着PLGA吸水软化和逐步降解以及芫花酯甲的释放，微球表面先是溶胀，然后逐渐向内部塌陷，并粘连在一起，最终降解为碎片。

芫花酯甲PLGA微球家兔体内肺靶向性定量评价：

芫花酯甲PLGA微球静脉注射家兔6h小时后，用HPLC法测定家兔体内药物分布结果见表5。肺部药物浓度高达14.0μg/g，肺靶向选择性相对浓度分布为81.8％。相对血摄取率肺为16.7倍，而肝约为2倍，脾，肾和心约为0.2-0.3倍。

首次采用一种螺吡喃类光致变色荧光染料标记芫花酯甲PLGA微球，家兔静脉注射6h制作各组织切片(CRYOTOME，英国)，通过荧光显微镜(Nikon，E07026)观察微球在组织中的分布，图象清晰，结果直观。在可见光下和365nm波长下用荧光显微镜观察家兔肺组织切片荧光成像照片可见光成像照片结果见附图7。随机观察10个视野中荧光微球分布观察结果见表5，显示约有80％的微球在肺部毛细血管中浓集，与家兔静脉注射芫花酯甲微球6h HPLC法测量比较结果见附图8。两种方法检测结果相关性分析结果(R²＝0.9952)基本一致，显示了良好的肺靶向选择性。

表5家兔静脉注射芫花酯甲/PLGA 6h组织药物浓度分布HPLC与荧光标记芫花酯甲微球6h组织分布结果测定结果

组织	芫花酯甲(μg/g)	相对浓度分布(％)	荧光微球(个)	荧光微球相对分布(％)
					肺	14.01	81.8	180	79.3
肝	1.63	9.5	23	10.1
					脾	0.18	1.1	10	4.4
肾	0.26	1.5	2	0.9
					心	0.20	1.2	2	0.9
血	0.84	4.9	10	4.4

附图说明

图1.为芫花酯甲对DNA拓扑酶I抑制作用琼脂糖电泳图；

第1列单独加入DNA pBR322质粒，绝大部分质粒以超螺旋状态存在；第2列中DNA质粒与Topo I共同存在于电泳体系中，此时Topo I发挥解旋作用，DNA质粒以解螺旋状态存在；第3列DNA质粒与芫花酯甲(0.78mM)共同存在于电泳体系中，无Topo I，DNA的存在状态不变，仍然保持超螺旋状态；4-11列为不同浓度的芫花酯甲，DNA和Topo I共同存在于电泳体系，当小于某个临界浓度时(0.32mM)，芫花酯甲不能抑制Topo I的活性，DNA以结螺旋状态存在。

图2.为静脉注射芫花酯甲血药浓度-时间曲线，横坐标为给药时间(h)，纵坐标为血药浓度(μg/L)

图3.为芫花酯甲PLGA微扫描电镜照片；

图4.为芫花酯甲PLGA微球粒径分布图，纵坐标为百分数(％)，横坐标为粒径(μm)；

图5.为紫外光365nm下荧光标记芫花酯甲PLGA微球荧光显微照片，紫外光365nm下荧光标记芫花酯甲PLGA微球荧光显微照片，其中红点紫外光365nm下荧光标记芫花酯甲PLGA微球红点(黑白图为白点)为荧光标记芫花酯甲PLGA微球；

图6.为芫花酯甲PLGA微球体外释放曲线，纵坐标为累计释放百分数(％)，横坐标为时间(小时)；

图7.为家兔静脉注射荧光标记芫花酯甲PLGA微球6h肺组织切片显微照片，图7-1为紫外光365nm下荧光照片，红点(黑白图中为白点)为荧光标记微球，图7-2为可见光下肺照片。

图8.为家兔静脉注射芫花酯甲PLGA微球6h与荧光标记测定组织器官分布比较，纵坐标为相对分布百分数(％)，横坐标为组织器官，1～6分别为肺、肝、脾、肾、心和血(均为1g或1ml)，左列：表示HPLC-UV，右列：表示荧光标记法。

本发明最大的特点与效果：

1.本发明制得了含量大于95％的高纯度芫花酯甲，制备提纯过程中为避免它的分解，特别加入了缓冲盐(pH值7～9)，以确保芫花酯甲稳定。

2.本发明选择了低分子有机醇潜溶剂与增溶剂和缓冲盐溶液(pH值7～9)将不溶于水的芫花酯甲制成稳定性良好的水溶性性纳米胶束注射液，可静脉给药用于抗癌症的治疗。

3.本发明选择了可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA作为载体与芫花酯甲共溶于二氯甲烷中，用复乳溶剂挥发法制成了5-20μm的芫花酯甲PLGA微球，载药量20％，静脉注射后，能选择性的富集在肺部，用于肺癌的靶向治疗。并首次用一种螺吡喃类光致变色荧光染料标记芫花酯甲PLGA微球的肺靶向选择性通过组织切片进行了影像学表征与验证。

具体实施方式

实施例1

芫花酯甲的制备

药材：鉴定为为瑞香科植物芫花Daphne genkwa Sieb.et Zucc的干燥根皮。芫花根皮粉5.0kg，用溶剂汽油(90号)25L提取1次，再用10L提取5次，每次1小时，过滤。合并6次提取液，减压回收溶剂，得黄色浸膏158g。将黄色浸膏进行硅胶柱(10*100mm，硅胶100-200目，1kg)粗分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到组分A、B、C、D和E五个组分。将组分C减压回收溶剂，得淡黄色浸膏12.5g。将淡黄色浸加无水乙醇至50ml溶解，用制备型HPLC(C-18柱，10μm，250×30mm，)分离，用85％甲醇溶液作为洗脱液，在230nm波长处检测，收集芫花酯甲组分，按0.7％加入磷酸缓冲盐(磷酸氢二钠∶-磷酸二氢钠26∶1)，减压回收溶剂，残渣用无水乙醇加热溶解，过滤，除去不溶性磷酸缓冲盐，浓缩，析出结晶，100℃干燥，得芫花酯甲原料0.872g，纯度为99.2％。

实施例2

芫花酯甲注射液(水溶性纳米胶束)制备

将芫花酯甲1g，用乙醇100ml溶解，再加10g吐温-80，摇匀，加入0.7％磷酸缓冲盐(磷酸氢二钠∶-磷酸二氢钠26∶1)至500ml，搅匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装，充氮气，熔封，100℃煮沸灭菌30分钟，即得。

实施例3

芫花酯甲注射液(非水溶媒)制备

将芫花酯甲1g，用乙醇245ml和丙二醇244ml溶解，再加10g吐温-80，摇匀，搅匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装，充氮气，熔封，100℃煮沸灭菌30分钟，即得。本品临用前用0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液稀释后即可自组装为水溶性纳米胶束芫花酯甲水溶性注射液。

实施例4

注射用芫花酯甲PLGA微球(肺靶向)制备

称取芫花酯甲1g，将其溶解在50ml含有8％(w/v)PLGA(50∶50；Mw15,000，粘度0.15dl/g)的二氯甲烷中，超声溶解，液面下1cm处匀速加到一定浓度的PVA溶液中，800rpm的转速机械搅拌乳化，形成水/油(W/O)的乳剂，加入同体积的纯净水，持续搅拌10min，再将上述溶液加入到5000ml分散水相中，转速降至400rpm，室温搅拌6小时，使CH₂Cl₂充分挥发，微球固化。8000rpm离心5min收集微球，再用纯净水洗涤3次，常温真空干燥24h。产率76.5％。取芫花酯甲PLGA微球按1∶9入适量右旋糖酐70混合，用环氧乙烷灭菌，分装置西林瓶中，每瓶含微球10mg，相当于含芫花酯甲2mg，即为注射用芫花酯甲PLGA微球。

实施例5

荧光标记芫花酯甲PLGA微球(肺靶向)制备

称取芫花酯甲0.5g，螺吡喃类光致变色荧光染料0.5g，将其共溶解在50ml含有8％(w/v)PLGA的二氯甲烷中，超声溶解，液面下1cm处匀速加到一定浓度的PVA溶液中，800rpm的转速机械搅拌乳化，形成水/油(W/O)的乳剂，加入同体积的纯净水，持续搅拌10min，再将上述溶液加入到5000ml分散水相中，转速降至400rpm，室温搅拌6小时，使CH₂Cl₂充分挥发，微球固化。8000rpm离心5min收集微球，再用纯净水洗涤3次，常温真空干燥24h。得荧光标记芫花酯甲PLGA微球。

Claims (9)

1.一种用于治疗癌症的天然抗癌药物单体芫花酯甲的制备方法，其特征在于首先将干燥的芫花根皮粉末，用溶剂汽油回流提取，硅胶柱粗分离，收集芫花酯甲组分，回收溶剂，残渣用甲醇溶解，再用C-18反相制备色谱纯化，用85％甲醇溶液作为洗脱液，在230nm波长处检测，收集芫花酯甲组分，加入磷酸钠缓冲盐调节pH值7～9，减压回收溶剂，残渣用无水乙醇加热溶解，过滤，除去磷酸钠不溶性缓冲盐，浓缩，析出结晶，100℃干燥，得纯度大于95.0％的芫花酯甲。

2.按照权利要求1所述芫花酯甲的用途，其特征在于作为抗癌药物芫花酯甲注射液的配方中含有：

芫花酯甲      0.001～20％(重量百分数)

有机醇潜溶剂  1～99％(重量百分数)

增溶剂        0.008～20％(重量百分数)

缓冲盐        0～10％(重量百分数)

注射用水      0～95％(重量百分数)

总量为        100％(重量百分数)

上述芫花酯甲注射液的配制工艺为：

将芫花酯甲用有机醇潜溶剂溶解，再加入增溶剂，摇匀，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，分装，充氮气，熔封，100℃煮沸灭菌30分钟，得到芫花酯甲非水溶媒注射液；或将芫花酯甲用有机醇潜溶剂溶解，再加入增溶剂，再加入缓冲盐溶液，用氢氧化钠溶液调节溶液的pH值7～9，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，分装，充氮气，熔封，100℃煮沸灭菌30分钟，得到芫花酯甲水溶性纳米胶束注射液。

3.按照权利要求2所述芫花酯甲的用途，其特征在于芫花酯甲注射液配方中所述的有机醇潜溶剂选自无水乙醇、丙二醇、丙三醇或聚乙二醇400～600，或2种有机醇潜溶剂的混合物。

4.按照权利要求2所述芫花酯甲的用途，其特征在于芫花酯甲注射液配方中所述的增溶剂选自吐温-80、吐温-60、吐温-40或吐温-20。

5.按照权利要求2所述芫花酯甲的用途，其特征在于芫花酯甲注射液配方中所述的缓冲盐除磷酸钠外，还选自碳酸钠、醋酸钠、乳酸钠、酒石酸钠或柠檬酸钠。

6.按照权利要求1所述芫花酯甲的用途，其特征在于作为抗癌药物注射用芫花酯甲PLGA微球的制备配方之一中含有：

芫花酯甲PLGA微球    1～50％(重量百分数)

助悬剂              50-90％(重量百分数)

芫花酯甲PLGA微球的制备配方之二中含有：

芫花酯甲            1-40％；(重量百分数)

PLGA                60-99％；(重量百分数)

二氯甲烷：          0.5～5ml

0.5～20％PVA水溶液  5～100ml

7.按照权利要求6所述芫花酯甲的用途，其特征在于作为芫花酯甲PLGA微球所述的PLGA选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物的比例为40∶60～60∶40，分子量5000～30000，黏度0.10～0.30dl/g。

8.按照权利要求书6所述芫花酯甲的用途，其特征在于作为注射用芫花酯甲PLGA微球所述的芫花酯甲PLGA微球平均粒径为5-20μm，将注射用水与它制成混悬液，静脉注射可选择性用于肺癌的靶向治疗。

9.按照权利要求6所述芫花酯甲的用途，其特征在于作为注射用芫花酯甲PLGA微球的配方中的助悬剂选自注射用右旋糖苷70、右旋糖苷40、右旋糖苷20或甘露醇。

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