CN103263408A

CN103263408A - 一种大蒜素纳米脂质体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103263408A
Application number: CN2013101964743A
Authority: CN
Inventors: 姜建国; 鲁群; 朴金花
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2013-08-28

Abstract

本发明属于脂质体制备技术领域，公开了一种大蒜素纳米脂质体及其制备方法与应用。该制备方法包括以下步骤：（1）壁材溶液的制备：将壁材溶解于氯仿，蒸发至薄膜，再加入乙醚，重新溶解，得到壁材溶液；（2）芯材溶液的制备：将大蒜素溶解于无水乙醇和磷酸缓冲液的混合溶液，得到芯材溶液；（3）逆向蒸发法制备大蒜素纳米脂质体：将步骤（1）制备得到的壁材溶液与步骤（2）制备得到的芯材溶液混合，超声至澄清，旋蒸除去溶剂，加入PBS溶液，静置，过滤，滤液冷冻干燥，得到大蒜素纳米脂质体。本方法制备得到的大蒜素纳米脂质体具有包埋率高、稳定性好，可长期贮存且释放过程均匀缓慢等优点及有益效果，可应用于食品、保健品及药品领域。

Description

一种大蒜素纳米脂质体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于脂质体制备技术领域，特别涉及一种大蒜素纳米脂质体及其制备方法与应用。

背景技术

大蒜素是一种天然化合物，具有来源广、结构简单、生物活性作用明显、不易产生耐药性、价格低廉等优点。大蒜素抗菌谱广，而大蒜素具有抗细菌、抗真菌和抗病毒的作用，作为抗菌剂在食品行业中广泛应用。并且大蒜素具有多种生物活性：抗肿瘤、降低胆固醇、抗血小板聚集、保肝、预防心血管疾病、降血压和血脂、抗衰老及记忆力下降、抗微生物活性等，其药用和保健作用已被广泛认可。

目前制约大蒜素产品开发应用的原因主要有：大蒜素特有的蒜臭味难以被接受、化学性质不稳定，在光、热及碱性条件下均易氧化失效、分离提取困难、化学试剂残留和其注射剂对血管有刺激性等因素影响了大蒜素的疗效和患者用药的依从性。

通过脂质材料对大蒜素进行包埋，制备大蒜素纳米脂质体，可以减小大蒜素的蒜臭味、提高大蒜素的稳定性，有利于贮存，没有毒副作用，可广泛用于食品、保健品和药品中。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种大蒜素纳米脂质体的制备方法。

本发明另一目的在于提供上述方法制备的大蒜素纳米脂质体。

本发明再一目的在于提供上述大蒜素纳米脂质体在制备药物、食品及保健品中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种大蒜素纳米脂质体的制备方法，包括以下具体步骤：

（1）壁材溶液的制备：将壁材溶解于氯仿，旋蒸为薄膜，再加入乙醚，重新溶解，得到壁材溶液。

（2）芯材溶液的制备：将大蒜素溶解于乙醇和磷酸缓冲液（PBS）的混合溶液，得到芯材溶液。

（3）逆向蒸发法制备大蒜素纳米脂质体：将步骤（1）制备得到的壁材溶液与步骤（2）制备得到的芯材溶液混合，超声至澄清，旋蒸除去溶剂，加入PBS溶液，静置，过滤，滤液冷冻干燥，得到大蒜素纳米脂质体。

步骤（1）所述的壁材指卵磷脂和胆固醇。

胆固醇起着膜流动性调节剂的作用，加入卵磷脂中可以改变卵磷脂的相变温度，使相变温度以下处于固态的磷脂转变为液晶态，防止类脂链结晶化达到增加膜的流动性，借此提高脂质体的包封率和稳定性。

步骤（1）所用卵磷脂和胆固醇的质量比为3～5:1，优选为3.7:1。

步骤（1）所用氯仿的量为每1g壁材使用30～40mL氯仿。

步骤（1）所用乙醚的量为每1g壁材使用22.5～30mL乙醚。

步骤（1）中乙醚与步骤（2）中乙醇的体积比为1:1。

所用乙醚和乙醇的总体积与步骤（2）所用PBS的体积比为2:1～4:1，优选为3.02:1。

步骤（2）所用大蒜素的量与步骤（1）中卵磷脂的质量比为1:3～5，优选为1:3.77。

步骤（3）所述的超声指在超声功率为频率为100Hz下，超声2～4min，优选为3.4min。

步骤（3）所述的过滤指依次过0.8μm滤纸和0.45μm滤膜。

步骤（3）所述PBS的pH值为6.6～7.0，优选6.8；所用PBS的量为每1g壁材使用60～100mL，优选80mL。

通过控制步骤（1）和步骤（2）中使用的乙醚、乙醇和PBS总体积比，即有机相和水相体积比，获得稳定的乳浊液，从而最终获得稳定的纳米脂质体悬浮液。

根据上述方法制备得到的大蒜素纳米脂质体。

上述大蒜素纳米脂质体在制备药物、食品及保健品中的应用。

本发明的机理为：

脂质体具有磷脂双分子层，结构类似生物膜，是以磷脂和胆固醇为膜材料，在水等物质的作用下自组装形成的稳定囊状结构。磷脂具有双亲性，有极性头和非极性尾部，能够形成稳定的双分子层结构，构成脂质体的骨架结构。胆固醇的作用主要是改变磷脂双分子层的流动性，具有缓冲剂的作用。而脂质体具有两亲性，既能携带亲水物质，也能携带亲油物质。一方面因为磷脂是膜结构的主要组成成分，磷脂为两性物质，具有亲水基团和疏水性基团；另一方面，脂质体内部包裹着水相，平衡状态的水相能溶解多种药物。将磷脂和胆固醇加入有机溶剂，在外力作用下，磷脂和胆固醇吸附在小水滴的表面上，形成一层单分子薄膜。此时，将油相加入水相后，有机溶剂中剩余的磷脂和胆固醇在油水界面迅速生成单分子薄膜，在外力作用下，油相中的小水滴透过油水界面形成，被包裹后形成具有双层膜结构的脂质体。

逆相蒸发法是按配方称取卵磷脂和胆固醇溶于氯仿或乙醚等有机溶剂中，再加入待包封的药物溶液进行短时超声，脂质形成稳定的的W/O型乳剂，然后减压蒸发除去有机溶剂，当绝大部分的有机溶剂被蒸发后，乳浊液会形成高粘度凝胶，加入缓冲溶液继续减压蒸发除去剩余有机溶剂，形成水性混悬液，最后超声水浴，即得脂质体混悬液。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

本发明包埋率高，制备工艺优化后大蒜素纳米脂质体的包埋率可到达75.20±0.62%，其粒径小，为145.27±15.19nm，且在贮存期间稳定性高，贮存30天后粒径没有明显变化，可用于食品行业中，提高大蒜素的稳定性及应用范围。大蒜素包裹在脂质体之中后，释放缓慢，释放量对时间呈依懒关系，在食品、保健品和药品的应用中有发展前景。

附图说明

图1是大蒜素标准曲线。

图2是大蒜素脂质体体外缓释曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1：大蒜素纳米脂质体的制备

（1）PBS（磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS）的配制：

甲液：0.05mol/L Na₂HPO₄溶液：称取磷酸氢二钠9.465g，加蒸馏水溶解得到1000ml溶液。

乙液：0.05mol/L KH₂P0₄溶液:称取磷酸二氢钾,9.070g，加蒸馏水溶解得到1000ml溶液。

将甲、乙液分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液。

将甲液、乙液按体积比1:1混合，即得到pH为6.8的PBS溶液。

（2）壁材溶液的制备：精密称量卵磷脂和胆固醇，质量比为5:1，于250ml圆底烧瓶中，按每1g壁材30mL的比例加入氯仿，振摇烧瓶使脂材充分溶解，置于旋转蒸发仪（RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂）上35℃水浴减压旋蒸至透明均匀的薄膜，再按每1g壁材22.5mL的比例加入乙醚，将透明薄膜重新溶解。

（3）芯材溶液的制备：称取大蒜素，大蒜素与步骤（1）中卵磷脂的质量比为1:3，用乙醇和PBS的混合溶液溶解（步骤（1）中乙醚与本步骤中乙醇的体积比为1:1，步骤（1）中的乙醚加上步骤（2）中的乙醇的体积与PBS溶液的体积之比称为有机相/水相比，比例为2:1）。

（4）逆向蒸发法制备大蒜素纳米脂质体：将步骤（1）的壁材溶液与步骤（2）的芯材溶液混合，在超声频率为100Hz下超声2min，使混合液变成澄清的单相，旋转蒸发除去有机溶剂至胶态，当凝胶塌陷且变为水混悬液时，按每1g壁材使用60mL pH为6.8的PBS比例加入PBS溶液，在室温静置2h后，依次过0.8μm滤纸，0.45μm滤膜，即得大蒜素纳米脂质体混悬液，放入4℃的冰箱内保存，或冷冻干燥成粉末，得到大蒜素纳米脂质体。

实施例2：大蒜素纳米脂质体的制备

（1）PBS的制备同实施例1。

（2）壁材溶液的制备：精密称量卵磷脂和胆固醇，质量比为3.70:1，于250ml圆底烧瓶中，按每1g壁材40mL的比例加入氯仿，振摇烧瓶使脂材充分溶解，置于旋转蒸发仪（RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂）上35℃水浴减压旋蒸至透明均匀的薄膜，再按每1g壁材30mL的比例加入乙醚，将透明薄膜重新溶解。

（3）芯材溶液的制备：称取大蒜素，大蒜素与步骤（1）中卵磷脂的质量比为1:3.77，用乙醇和PBS的混合溶液溶解（步骤（1）中乙醚与本步骤中乙醇的体积比为1:1，步骤（1）中的乙醚加上步骤（2）中的乙醇的体积与PBS溶液的体积之比称为有机相/水相比，比例为3.02:1）。PBS缓冲液配置同实施例1。

（4）逆向蒸发法制备大蒜素纳米脂质体：将步骤（1）的壁材溶液与步骤（2）的芯材溶液混合，在超声频率为100Hz下超声3.40min，使混合液变成澄清的单相，旋转蒸发除去有机溶剂至胶态，当凝胶塌陷且变为水混悬液时，按每1g壁材使用80mL pH为6.8的PBS比例加入PBS溶液，在室温静置2h后，依次过0.8μm滤纸，0.45μm滤膜，即得大蒜素纳米脂质体混悬液，放入4℃的冰箱内保存，或冷冻干燥成粉末，得到大蒜素纳米脂质体。

实施例3：大蒜素纳米脂质体的制备

（1）PBS的制备同实施例1。

（2）壁材溶液的制备：精密称量卵磷脂和胆固醇，质量比为3:1，于250ml圆底烧瓶中，按每1g壁材35mL的比例加入氯仿，振摇烧瓶使脂材充分溶解，置于旋转蒸发仪（RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂）上35℃水浴减压旋蒸至透明均匀的薄膜，再按每1g壁材27mL的比例加入乙醚，将透明薄膜重新溶解。

（2）芯材溶液的制备：称取大蒜素，大蒜素与步骤（1）中卵磷脂的质量比为1:5，用无水乙醇和PBS的混合溶液溶解（步骤（1）中乙醚与本步骤中乙醇的体积比为1:1，步骤（1）中的乙醚加上步骤（2）中的乙醇的体积与PBS溶液的体积之比称为有机相/水相比，比例为4:1）。PBS缓冲液配置同实施例1。

（3）逆向蒸发法制备大蒜素纳米脂质体：将步骤（1）的壁材溶液与步骤（2）的芯材溶液混合，在超声频率为100Hz下超声4min，使混合液变成澄清的单相，旋转蒸发除去有机溶剂至胶态，当凝胶塌陷且变为水混悬液时，按每1g壁材使用100mL pH为6.8的PBS比例加入PBS溶液，在室温静置2h后，依次过0.8μm滤纸，0.45μm滤膜，即得大蒜素纳米脂质体混悬液，放入4℃的冰箱内保存，或冷冻干燥成粉末，得到大蒜素纳米脂质体。

实施例4：大蒜素纳米脂质体包埋率的测定

（1）标准曲线的制备

精密称量20mg大蒜素对照品于100ml容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，超声若干分钟使其完全溶解，配制成200μg/ml的大蒜素对照品溶液。分别精确吸取大蒜素对照品溶液0.5、1.25、2.5、5、7.5、10、12.5ml于50ml容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，得到的溶液浓度分别为2、5、10、20、30、40、50μg/ml，以无水乙醇为空白，在紫外可见光分光光度计上在大蒜素最大吸收波长258nm处分别测定其吸光值。以吸光值（A）对浓度（C）进行线性回归，计算回归方程，并绘制大蒜素标准曲线。如图1，其大蒜素标准曲线回归方程为y=0.009x-0.008，R²=0.999。

（2）游离大蒜素的测定：分别移取0.3ml实施例1～3制备得到的的大蒜素纳米脂质体混悬液于2ml离心管中，在冷冻超速离心机温度4℃，转速13000rpm，离心30min，吸取上清液于25ml比色管中，用无水乙醇稀释至10ml，在波长为258nm处测定其吸光度。

（3）包埋率（%）按以下公式计算得到：

EE % = \frac{m_{1} - m_{2}}{m_{1}} \times 100 %

式中：m₁和m₂分别为总的大蒜素量以及游离大蒜素的量。结果见表1。

表1 大蒜素纳米脂质体包埋率的测定

	实施例1	实施例2	实施例3
				包埋率/%	70.25±0.75	75.20±0.62	69.37±0.48

由表1可知，本方法制备得到的大蒜素纳米脂质体包埋率可高达75.20%，实现高包埋。

实施例4：大蒜素纳米脂质体粒径和电位的测定

将实施例2制备得到的大蒜素纳米脂质体混悬液装入样品池中，用Nano-2S纳米粒度仪（英国马尔文公司）测定脂质体的粒径分布及Zeta电位，检测角度90°，温度25℃，取3次平均值，结果见表2。

表2 大蒜素纳米脂质体的粒径

	1	2	3	平均值
					粒径/nm	143.4	161.3	131.1	145.27±15.19
30天后粒径/nm	140.4	152.8	129.9	141.03±11.46
					电位/mV	40.5	39.0	40.8	-40.10±0.96

结果表明，脂质体的平均粒径为145.27±15.19nm，小于200nm，符合药物注射制剂的要求。并且静置30天后平均粒径为141.03±11.46nm，粒径变化不大，说明制备的大蒜素纳米脂质体稳定性高。脂质体的ζ-电位值为-40.10±0.96mV。一般认为，ζ-电位的绝对值大于30mV，体系是稳定的，因为在此电位下的脂质体混悬液体系是稳定存在的。

实施例5：大蒜素纳米脂质体体外释放行为的测定

移取6ml实施例2制备得到的大蒜素纳米脂质体混悬液于透析袋中，扎紧袋口，将透析袋放入装有250ml0.005mol/L的PBS溶液的烧杯中，水浴中恒温控释，控制释放条件：温度35℃，搅拌速度10rpm。分别在0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48h移取10ml烧杯中PBS溶液，同时补充等量的PBS溶液，在波长为258nm下测定移取液的紫外吸收光谱，计算大蒜素含量，进而计算脂质体的累积释放度（Q）。大蒜素PBS混合溶液作为对比，制备方法如下：称取与实施例2中相同量的大蒜素，加6mL PBS，混合均匀后加入到透析袋中，扎紧袋口，将透析袋放入装有250ml0.005mol/L的PBS溶液的烧杯中，水浴中恒温控释，释放条件与上面所述相同。

同样的方法测定其体外释放曲线（见图2，其中，A为对比，B为大蒜素纳米脂质体）。

释放度按下式计算：

Q = \frac{M_{n}}{M} \times 100 %

其中，M_n是第n次累积释放的大蒜素质量，M是初始包埋在脂质体中的总大蒜素质量。

由图2可见，本方法制备得到的大蒜素纳米脂质体在整个控释过程中缓慢释放大蒜素，每个时间点大蒜素纳米脂质体的释放度均低于对比，说明本发明的包埋方法取得了显著的缓释效果。分别用释放动力学零级方程、一级方程、Higuchi方程、Niebergull平方根定律、Hixcon-Crowell立方根定律对脂质体体外释放曲线进行拟合，证明大蒜素纳米脂质体的体外释放比较吻合一级方程模型。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种大蒜素纳米脂质体的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：

（1）壁材溶液的制备：将壁材溶解于氯仿，旋蒸为薄膜，再加入乙醚，重新溶解，得到壁材溶液；

（2）芯材溶液的制备：将大蒜素溶解于乙醇和磷酸缓冲液的混合溶液，得到芯材溶液；

（3）逆向蒸发法制备大蒜素纳米脂质体：将步骤（1）制备得到的壁材溶液与步骤（2）制备得到的芯材溶液混合，超声至澄清，旋蒸除去溶剂，加入磷酸缓冲液，静置，过滤，滤液冷冻干燥，得到大蒜素纳米脂质体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的壁材指卵磷脂和胆固醇。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所用卵磷脂和胆固醇的质量比为3～5:1；步骤（2）所用大蒜素的量与步骤（1）中卵磷脂的质量比为1:3～5。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所用卵磷脂和胆固醇的质量比为3.7:1；步骤（2）所用大蒜素的量与步骤（1）中卵磷脂的质量比为1:3.77。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所用氯仿的量为每1g壁材使用30～40mL氯仿；所用乙醚的量为每1g壁材使用22.5～30mL乙醚。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中乙醚与步骤（2）中乙醇的体积比为1:1；所用乙醚和乙醇的总体积与步骤（2）磷酸缓冲液的体积比为2:1～4:1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用乙醚和乙醇的总体积与步骤（2）磷酸缓冲液的体积比为3.02:1。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的超声指在超声功率为频率为100Hz下，超声2～4min；所用磷酸缓冲液的量为每1g脂质体使用60～100mL。

9.根据权利要求1～8任一项所述方法制备得到的大蒜素纳米脂质体。

10.根据权利要求9所述的大蒜素纳米脂质体在制备药物、食品及保健品中的应用。