CN102293752A - 壳聚糖载辣椒素微球制备方法及微球和减肥降脂以及降糖应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了壳聚糖载辣椒素微球制备方法及微球和减肥降脂以及降糖应用。以壳聚糖溶液和辣椒素溶液为主要原料，通过离子交联法联合喷雾干燥法制备得到，壳聚糖和三聚磷酸钠通过化学键牢固的结合并通过二次包覆将辣椒素包载其中。所述微球粒径分布在0.8μm～4.5μm。本发明确定了壳聚糖和辣椒素的包载比例、提供优选的制备工艺条件，对辣椒素实现离子交联和喷雾干燥过程中的二次包裹作用。所述微球具有良好的缓释性能，实现壳聚糖和辣椒素的协同增效的减肥、降血脂以及降血糖作用，成功的二次包覆显著减小辣椒素刺激性；克服了传统制备载药微球产量不足、使用有机溶剂、包封率和载药量不佳等缺陷，具有良好的工业应用意义。

Description

壳聚糖载辣椒素微球制备方法及微球和减肥降脂以及降糖应用

技术领域

本发明属于医药和保健品食品技术领域，具体涉及一种壳聚糖载辣椒素微球(CTS-CAP-MP)的制备方法及微球和在减肥、降血脂以及降血糖方面的应用。

背景技术

壳聚糖(Chitosan，CTS)是一种天然聚阳离子多糖衍生物，大量存在于海洋节肢动物(虾、蟹等)的甲壳中，也存在于低等动物菌类、昆虫、藻类细胞膜中，资源十分丰富，目前CTS通常都是作为制备其他药物微粒的壁材或者辅料使用。

辣椒素(Capsaicin，CAP)是一种天然的植物碱，是由茄科植物辣椒的成熟果实中提取得到的有效成分，主要用于镇痛、止痒，其镇痛作用与吗啡等同，但较吗啡作用持久。

目前对辣椒碱的应用研究均为直接应用，但是CAP的强烈刺激性影响了其应用，未见利用CTS作为负载辣椒素的壁材或者辅料的技术报道，也未见采用CTS载CAP达到相关协同增效作用的技术报道。

发明内容

本发明的一个目的是填补现有技术的不足，提供一种CTS-CAP-MP的制备方法，成功实现CTS载CAP，制备得到包封率和载药量俱佳的微球。

本发明的另一个目的是提供所述方法制备得到的CTS-CAP-MP，本发明通过采用适宜的制备技术方案和工艺条件，所述微球成功利用CTS的载体作用，实现对CAP的二次包覆，很好地掩盖CAP的刺激性，并克服单一物质效果有限、使用剂量大的局限性。

本发明还有一个目的是提供所述微球的应用，发挥CTS和CAP协同增效作用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种CTS-CAP-MP的制备方法，通过离子交联法联合喷雾干燥法制备得到，具体包括以下步骤：

(1)采用醋酸溶液充分溶解CTS，配制成1.0mg/ml的CTS溶液；采用吐温-80(Tween-80)溶液溶解CAP，配制成1.5mg/ml的CAP溶液；

(2)将步骤(1)所述CTS溶液和CAP溶液按照10∶1的体积比混匀得混合溶液；

(3)将三聚磷酸钠(TPP)水溶液加入步骤(2)所述混合溶液中得CTS-CAP-MP混悬溶液；所述TPP水溶液的用量优选按照CTS和TPP的质量比为4∶1确定；

(4)将步骤(3)所述CTS-CAP-MP混悬溶液，放置至无气泡，用喷雾干燥机进行喷雾干燥。

优选地，本发明方法包括以下步骤：

(1)采用1％(体积比浓度)的醋酸溶液充分溶解CTS，配制成1.0mg/ml的CTS溶液；

采用0.5％的Tween-80溶液(Tween-80与水的质量体积比为0.5g/100ml)溶解CAP，配制成1.5mg/ml的CAP溶液；

(2)将步骤(1)所述CTS溶液和CAP溶液按照10∶1的体积比混匀得混合溶液；调节混合溶液pH值为4.5；

(3)在搅拌下，将浓度为1％的TPP水溶液(TPP和水的质量体积比为1g∶100ml)恒速滴入步骤(2)所述混合溶液中，至蓝色乳光出现，继续搅拌即得CTS-CAP-MP混悬溶液；所述TPP水溶液的用量按照CTS和TPP的质量比为4∶1确定(指的是CTS溶液和TPP中的化合物CTS和化合物TPP的质量比为4∶1，下同)；

(4)将步骤(3)所述CTS-CAP-MP混悬溶液，放置至无气泡，用喷雾干燥机进行喷雾干燥；

步骤(4)所述喷雾干燥的工艺条件优选为：热风量32m³/h，进样速率400ml/h，压缩空气压力10l/min，进风口的温度为160℃，进样速率为600ml/h。

本发明经过长期大量的实验结合创造性的分析和总结，综合考虑多种因素及因素之间的相互影响，对离子交联法和喷雾干燥工艺条件进行优化，通过确定CTS溶液和CAP溶液浓度、二者混合溶液的体积比和酸碱度、喷雾干燥的工艺条件等，成功实现CTS载CAP，制备得到包封率和载药量俱佳的微球。

本发明提供采用上述方法制备得到的CTS-CAP-MP，所述微球外观呈球形，粒径分布在0.8μm～4.5μm，平均包封率和载药量分别为85.17％和8.87％，技术效果稳定。

本发明创造性地采用高效液相色谱法测定CTS-CAP-MP中的CAP包载量，具有较好的重复性、稳定性和良好的进样精密度，为CTS-CAP-MP的制备提供了针对性的检测技术方案，控制稳定的产品质量。本方法CAP的检测限(S/N≥3)为0.08μg，定量限(S/N≥10)为0.24μg。

所述检测方法包括以下步骤：

(A)制备CTS-CAP-MP混悬溶液(参见前述步骤(1)～步骤(3))；

(B)将步骤(A)所述混悬溶液离心取上清液，调pH值至7.0后沉淀未被包载的CTS；离心取上清液水浴蒸干，加入甲醇复溶后采用0.22μm滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱法测定。

其中，所述高效液相色谱法的条件是：

色谱柱为DiamonsilC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为体积比68∶32的甲醇-水，紫外检测波长为281nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为20μl。

本发明提供了所述微球以下相关应用：

所述微球具有优良的缓释性能，在pH值为7.4的中性介质中，CTS-CAP-MP的药物释放较慢，且在24h基本释放完全，可很好地应用于制备缓释制剂方面。本发明制备得到的微球，CTS不仅仅作为CAP的有效载体，制备得到的微球在制备减肥、控制体重和降血脂、降血糖方面的药物及保健品方面具有很好的新应用，尤其是在减肥、控制体重和降血糖方面，CTS与CAP共同发挥有效的协同增效作用。

本发明的有益效果是：

(1)现有技术未见采用CTS作为CAP载体制备CAP微球的技术报道。本发明克服了技术难题，应用CTS作为载体，成功负载CAP，实现对CAP的二次包裹，使得CTS和TPP通过化学键牢固地结合并通过二次包裹作用将CAP包载其中，平均包封率和载药量分别为85.17％和8.87％。显著减小CAP刺激性，提高了其顺应性。

(2)本发明在成功应用CTS作为CAP的载体的基础上，在成功完成负载并实现二次包覆的同时，进一步对CTS溶液和CAP溶液浓度、二者混合溶液的体积比和酸碱度、具体的工艺条件等进行探索和优化，实现了微球良好的缓释机制和两种药物的协同增效作用，所述微球在制备缓释制剂、在制备减肥、控制体重和降血脂、降血糖方面的药物及保健品方面具有良好的应用前景。

(3)现有的载药微球的制备，存在着制备过程中使用有机溶剂且制备产出量太少，包封率和载药量不佳等缺陷，不具有实际应用意义。本发明寻找适宜的制备方法和工艺条件，克服传统制备载药微球的技术不足，尤其是产量不足和制备过程中使用有机溶剂、包封率和载药量不佳等不足，通过针对性改进离子交联法联合喷雾干燥技术，对CAP实现离子交联和喷雾干燥过程中的二次包裹作用，实现大量生产，解决了CTS和CAP实际应用的技术难题。

(4)本发明创造性地采用高效液相色谱法测定CTS-CAP-MP中的CAP包载量，具有较好的重复性、稳定性和良好的进样精密度，CAP的检测限(S/N≥3)为0.08μg，定量限(S/N≥10)为0.24μg。本方法为微球的制备提供了一种可行的检测方法，并有望成为有效的微球制备的质量控制方法，保证了本发明技术方案的完整及科学性，填补了本技术领域的空白，为微球制备技术的发展提供技术基础。

(5)本发明的制备方法简单有效，工艺条件确定，具有很好的工业推广实用性和价值。

附图说明

图1 CAP、CTS和TPP的紫外全波长扫描图；

图2 CAP标准品HPLC色谱图；

图3 CAP样品HPLC色谱图；

图4 专属性HPLC色谱图(1.阴性对照、2.CAP样品、3.CAP标准品)；

图5 CAP的标准曲线；

图6 CTS浓度对包封率的影响；

图7 TPP浓度对包封率的影响；

图8 CAP浓度对包封率的影响；

图9 CTS/TPP质量比对包封率的影响；

图10 pH值对药物包封率的影响；

图11 TPP、CTS、CAP、CTS+CAP+TPP物理混合物、CTS-MP(壳聚糖微球)和CTS-CAP-MP的DTA分析图；

图12 CTS-CAP-MP的粒径分布图；

图13 CTS-CAP-MP的Zata电位分布图；

图14 CTS-CAP-MP的SEM图(1000倍)；

图15 CAP在不同介质中的累积释放率；

图16 体外吸附油脂实验结果；

图17 体外吸附胆固醇实验结果；

图18 体外吸附胆酸盐实验结果；

图19 体外吸附游离脂肪酸实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明，本发明实施例中使用以下试剂和仪器，常规的物质或仪器的简单替代也不能在此一一赘述，不能将本发明长期所做的大量实验全部在此一一列举，但并不因此限定本发明的范围。

JB-3型定时磁力搅拌器(上海智光仪器仪表有限公司)，十万分之一电子分析天平(BT125D，德国赛多利斯)，ZetasizerNanoZS90粒度分析仪(英国马尔文公司)，高效液相色谱仪(Ultimae 3000，美国戴安公司)，C₁₈色谱柱(Diamonsil，北京迪马科技有限公司)，保护预柱(KJO-4282，广州菲罗门科学仪器有限公司)，ELGA超纯水机(法国威立雅水处理技术有限公司)，钨丝灯扫描电镜(S3700N，日本日立公司)，差热分析仪(ZR-2CR，南京多助科技有限公司)，高速离心机(TGL-16C，上海安亭科学仪器厂)，紫外可见分光光度计(SPECORD S600，德国耶拿分析仪器股份公司)，pH计(Starter3C，美国奥豪斯仪器公司)，0.22有机相滤膜(天津津腾实验设备有限公司)，0.22水相滤膜(天津津腾实验设备有限公司)，双频数控超声波清洗器(KQ-500VDE，昆山市超声仪器有限公司)，Thermo超低温冰箱(702，美国赛默飞世尔科技公司)，喷雾干燥机(L-117，北京来亨科贸有限责任公司)，低速离心机(SC-3160，科大创新股份有限公司中佳分公司)，旋转蒸发器(RE-5205，上海亚荣生化仪器厂)，电热恒温水槽(DK-8D，上海一恒科技有限公司)，鼓风干燥箱(DHG-9246A，上海精密实验设备有限公司)。

辣椒素原料药(纯度＞95％，批号：20100820，武汉圣天宇科技有限公司)，辣椒素对照品(纯度＞98.0％，批号：10031121，上海同田生物技术有限公司)，吐温-80(批号：20090201，广州试剂厂)，色谱甲醇(美国霍尼韦尔公司)，甲醇(AR，天津百世化工有限公司)，壳聚糖(批号：090320A，山东奥康生物科技有限公司)，多聚磷酸钠(批号：20100302，天津福晨化学试剂厂)，冰醋酸(批号：20090820，天津福晨化学试剂厂)。

实施例1 CTS-CAP-MP的制备和检测实验

1.CAP最大吸收波长的确定

在190～800nm波长范围内对CAP、CTS和TPP进行全波长扫描，选择测定CAP的最佳吸收波长以减小辅料的干扰。附图1为CAP、CTS和TPP的紫外全波长扫描图，其中曲线1、2和3分别代表CAP、TPP和CTS的紫外全波长扫描图。从附图1中发现CAP在239nm和281nm具有较强的紫外吸收且CTS和TPP在该波长处紫外吸收很小，经过分析和总结，同时为了避免末端吸收的影响，故选择CAP的紫外吸收测定波长为281nm。

2.离子交联法制备CTS-CAP-MP

称取CTS 0.10g用体积比浓度为1％的醋酸溶液充分溶解，配制成1.0mg/ml的CTS溶液。称取CAP 0.15g用0.5％的Tween-80水溶液(Tween-80∶水＝0.5g∶100ml)超声8min增溶CAP，配制成1.5mg/ml的CAP溶液。量取10ml CTS溶液于烧杯中，加入1ml CAP溶液，磁力搅拌15min混匀，加入4mol/l的NaOH调节混合溶液的pH值为4.5；用注射器吸取浓度为1％的TPP溶液，在不断搅拌(600r/min)的情况下，用4号针头、以2ml/min的恒速滴入CTS和CAP的混合溶液中，直至蓝色乳光，继续搅拌30min，即得CTS-CAP-MP混悬液。

将上述CTS-CAP-MP混悬液在15000r/min的条件下离心20min，取上清液A用4mol/l的NaOH调pH值至7.0，使未形成MP的CTS沉淀；然后在15000rpm/min条件下离心5min得上清液B，取5ml上清液B置于蒸发皿中，55℃水浴蒸干，加入适量甲醇复溶后定容于2ml容量瓶中，0.22μm滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定未被包载的游离CAP含量。

3.色谱条件与系统适应性实验

色谱柱为DiamonsilC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(68∶32，体积比)，紫外检测波长为281nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为20μl。CAP和样品中相邻色谱峰的分离度大于1.5；CAP保留时间为16.55min，理论塔板数以CAP峰计算不低于6000，拖尾因子1.01，峰形对称，色谱图见附图2和附图3所示。

4.专属性考察实验

分别制备标准品溶液、CTS-CAP-MP供试品溶液和不含CAP的CTS-MP阴性样品溶液，在选定的色谱条件下测定，考察辅料对CAP含量测定的干扰情况。实验结果见附图4所示的专属性HPLC色谱图，其中1为阴性对照，2为CAP样品，3为CAP标准品。由附图4可见，通过对空白辅料阴性对照溶液、CAP对照品溶液和CAP样品溶液在相同色谱条件下分析发现，辅料对CAP的测定无干扰，专属性良好。

5.标准曲线

精密称取CAP标准品15.75mg(五氧化二磷干燥)，适量甲醇溶解，定容于100ml容量瓶中，制成标准品储备液。分别量取不同体积标准储备液，定容于10ml容量瓶中配制成浓度分别为10.50μg/ml、21.00μg/ml、42.00μg/ml、63.00μg/ml、84.00μg/ml、131.25μg/ml、157.50μg/ml的标准溶液。在所述的色谱条件下，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。CAP的标准曲线见附图5所示，以峰面积对浓度进行线性回归，得回归方程y＝0.1770x+0.0027，R²＝0.9999。结果表明CAP的检测浓度在10.5～157.5μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

6.精密度试验

选取高中低三个不同浓度的标准品溶液，进样20μl，按照选定色谱条件每个标准品溶液测定6次，统计峰面积并计算相对标准偏差(RSD)。实验结果见表1，表中数据显示在21.00μg/ml、63.00μg/ml和131.25μg/ml高中低三个浓度下RSD分别为0.23％、0.33％和0.19％，且均小于0.5％，表明本方法具有好的进样精密度。

表1 精密度试验结果(n＝6)

7.重复性实验

取同一样品，平行配制供试品溶液6份，按照含量测定方法，分别进样20μl并统计峰面积，计算RSD。实验结果见表2，表中数据可看出6个平行样品之间含量测定结果的RSD为0.88％，表明本测定方法的重复性良好，测定结果具有较好的重现性。

表2 重复性实验结果(n＝6)

8.稳定性试验

取供试品溶液20μl，分别于0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h进样，统计峰面积并计算RSD，在12h内考察了样品的稳定性，结果见表3。结果发现，在12h内，样品中CAP能保持稳定，不会因为时间而影响含量的测定，不同时间点的测定值间的RSD为0.20％。故本方法具有好的稳定性。

表3 稳定性实验结果

9.检测限和定量限

以信噪比为3∶1(S/N＝3∶1)的浓度相应注入仪器的量确定检测限，以信噪比为10∶1(S/N＝10∶1)时相应注入仪器的量确定定量限。实验结果表明：本方法CAP的检测限(S/N≥3)为0.08μg，定量限(S/N≥10)为0.24μg。

10.回收率实验

取高速离心后空白微球的上清液2ml，分别加入高中低三个浓度的标准品溶液，每个浓度样品平行3份，蒸干复溶且过滤后进样20μl，统计峰面积并计算RSD。实验结果如表4所示，从表中可以看出：高、中、低三个浓度的CAP在空白微球的上清液中的加标回收率介于87.85％～101.59％之间，符合药典要求，表明空白微球上清液对CAP的吸收不影响含量测定。

表4 回收率实验结果(n＝3)

实施例2 CTS-CAP-MP处方优化实验

1.CTS浓度单因素实验

在固定CAP加入质量为1.5mg、TPP浓度为1mg/ml、pH值为4.5和CTS/TPP质量比为5∶1的条件下，选取CTS浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml和3.0mg/ml，通过测定包封率大小为评价指标，考察CTS浓度对药物包载的影响。CTS浓度对包封率的影响的实验结果见附图6所示。由附图6可知，随着CTS浓度的增加，对溶液中CAP的包封率亦会相应增加。但是，本发明分析，如果CTS浓度过高，粘度高，容易发生粘壁现象，增加后期喷雾干燥工艺成功进行的难度，最终将降低产率和影响CTS-CAP-MP的质量。在综合分析的基础上，经过不断实验，确定了1.0mg/ml、1.5mg/ml和2.0mg/ml作为正交实验的三个水平。

2.TPP浓度单因素实验

在固定CAP加入质量为1.5mg、CTS浓度为1.5mg/ml、pH值为4.5和CTS/TPP质量比为5∶1的条件下，选取TPP浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml和2.5mg/ml的水溶液，通过测定包封率大小为评价指标，考察TPP浓度对药物包载的影响。TPP浓度对包封率影响的实验结果见附图7。由附图7可看出，TPP浓度对包封率的影响差别很小，故该影响因素不列入正交考察因素中。但是，从整体技术方案和效果分析，发现当TPP浓度过高时会升高溶液pH值，而过低会导致CTS-CAP-MP混悬溶液体积过大，增大成功喷雾干燥制备微球的难度，经过不断实验、对比、总结，确定以1.0mg/ml的TPP浓度作为CTS-CAP-MP微球制备的适宜浓度。

3.CAP浓度单因素实验

在固定CTS浓度为1.5mg/ml、TPP浓度为1mg/ml、pH值为4.5和CTS/TPP质量比为4∶1的条件下，选取CAP浓度分别为0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml、2.5mg/ml和3.0mg/ml。通过测定包封率大小为评价指标，考察CAP浓度对药物包载的影响。CAP浓度的单因素实验结果见附图8所示。附图8表明，随着CAP浓度的升高，CTS-CAP-MP的包封率亦会增加。但是经本发明进一步的动物实验结果总结，当CTS-CAP-MP包载药物过多，就不能很好地掩盖CAP的刺激性。经过多次多因素对比分析和总结，确定以1.5mg/ml作为CAP药物浓度来制备CTS-CAP-MP。此因素亦不纳入正交考察因素范围中。

4.CTS/TPP配比单因素实验

在固定CTS浓度为1.5mg/ml、TPP浓度为1mg/ml、CAP的加入质量为1.5mg、pH值为4.5的条件下，选取CTS/TPP质量比分别为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1和8∶1。通过测定包封率大小为评价指标，考察CTS/TPP质量比对药物包载的影响。CTS/TPP质量比对包封率的单因素影响实验结果见附图9所示，数据显示随着CTS/TPP质量比增大，包封率相应的减小，CTS/TPP质量比增大会导致CTS-CAP-MP混悬液蓝色乳光不会出现，也就是说，当TPP质量减少时与CTS的交联效果降低从而不能很好的包载药物。

5.pH值单因素实验

在固定CTS浓度为1.5mg/ml、TPP浓度为1mg/ml、CAP的加入质量为1.5mg和CTS/TPP化合物的质量比为4∶1的条件下，选取CTS和CAP混合溶液的pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0和5.5。通过测定包封率大小为评价指标，考察pH值对药物包载的影响。pH值对药物包封率的影响见附图10所示，在溶液pH值过低(pH值为3.5)或过高(pH值为5.5)时导致TPP中的负电荷不能很好的与CTS中的正电荷结合，从而影响药物的包封率。根据单因素实验结果分析后选择pH值为4.0、4.5和5.0三个水平来考察pH值对药物包封率的影响。

6.正交实验优选处方

根据单因素实验结果和文献资料综合考虑，选取对药物包封率影响较大的因素进行正交实验，以包封率和载药量作为综合考察指标优化载药处方。

表5 正交设计因素水平表

表6 L₉(3⁴)正交试验安排和实验结果。

注：K₁、K₂、K₃分别为三个水平的平均值，R为极差。

由表6所示的正交实验分析可知，极差R反映各因素对指标的影响的程度。R越大，影响程度越大，本实验三个因素R值排列顺序为B＞A＞C，即溶液pH值对药物包封率的影响较大，合适的pH值可保证CTS和TPP的正负电荷获得高的结合率，能更好地形成微球，包载药物效果良好。其中各因素水平分析结果为：A：1＞2＞3；B：2＞1＞3；C：2＞3＞1，最佳处方为A1B2C2，即CTS浓度为1mg/ml，溶液pH值为4.5，CTS和TPP的质量比为4∶1。正交分析的方差分析结果见表7所示，表中方差分析数据和直观分析数据一致，表明此次正交实验数据可靠。

表7 方差分析

7.最佳配方验证试验

在正交实验优选出最优CTS-CAP-MP微球处方后，再平行制备出三个样品并分别测定包封率，以验证正交优化后的处方是否合理。验证试验结果见表8所示。

表8 验证实验结果

由表8验证试验数据可知，三次验证试验结果均符合要求，表明优化处方组成合理，制备工艺稳定。

实施例3 CTS-CAP-MP微球的制备工艺优化实验

1.进风温度的选择

在热风量36m³/h，进样速率400ml/h，压缩空气压力10l/min，将仪器进口温度分别设定在140℃、160℃、180℃进行单因素对比实验，实验结果以产率和粒径为评价指标，考察不同进口温度的实验效果，选择合适的进口温度范围。综合考察和分析进风温度对CTS-CAP-MP的粒径和产率的影响，实验结果见表9。数据显示，进风温度对粒径差异的影响很小，但对产率有影响。160℃(59.6％)和180℃(59.8％)时的产率相差亦不大，但是综合考虑温度越高对CAP影响较大等因素，确定以160℃作为最佳进风口的温度。

表9 进风温度对粒径和产率的影响(n＝3)

2.进样速率的选择

在进口温度170℃，热风量36m³/h，压缩空气压力10l/min，将进样速率分别控制在200ml/h、400ml/h和600ml/h进行单因素对比试验，实验结果以产率和粒径作为评价指标，考察不同进样速率的影响，选择合适的进样速率。进样速率对CTS-CAP-MP粒径和产率的影响结果见表10所示。表中数据可看出，进样速率对CTS-CAP-MP的粒径和产率影响均很大。综合分析考虑，600ml/h时的粒径(4.8μm)和产率(59.8％)均符合要求，故选取600ml/h作为制备CTS-CAP-MP的进样速率。

表10 进样速度对粒径和产率的影响(n＝3)

3.热风流量的选择

在进口温度170℃，进样速率400ml/h，压缩空气压力10l/min，将热风流量分别设定在28m³/h，32m³/h，36m³/h进行单因素对比试验，实验结果以产率和粒径作为评价指标，考察不同热风流量的影响，优选合适的热风流量。热风流量对CTS-CAP-MP的粒径和产率的影响数据如表11所示，低的热风流量如28m³/h，因为风量不足导致低的产率(41.3％)，而高的热风流量如36m³/h，因为导致微球未完全干燥即被旋风分离器分离使粒径稍大(4.6μm)，经过不断调整工艺，并对大量实验结果的总结和分析，选择32m³/h作为CTS-CAP-MP制备的热风流量选择。

表11 热风流量对粒径和产率的影响(n＝3)

实施例4 按照优化的处方和工艺制备得到CTS-CAP-MP的质量检测按照以下步骤制备CTS-CAP-MP：

(1)采用1％(体积比浓度)的醋酸溶液充分溶解CTS，配制成1.0mg/ml的CTS溶液；采用0.5％(质量体积比浓度)的Tween-80溶解CAP，配制成1.5mg/ml的CAP溶液；

(2)将步骤(1)所述CTS溶液和CAP溶液按照10∶1的体积比混匀；采用4mol/l的NaOH溶液调节混合溶液的pH值为4.5；

(3)搅拌下，将浓度为1％的TPP水溶液恒速滴入步骤(2)所述的CTS和CAP的混合溶液中至蓝色乳光出现，继续搅拌即得CTS-CAP-MP混悬液；所述TPP水溶液的用量按照CTS/TPP的化合物质量比为4∶1确定；

(4)将步骤(3)所述CTS-CAP-MP混悬溶液，放置至无气泡，用喷雾干燥机进行喷雾干燥；所述喷雾干燥的条件为热风量32m³/h，进样速率400mL/h，压缩空气压力10l/min，进风口的温度为160℃，进样速率为600ml/h。制备得到CTS-CAP-MP，外观呈球形。

1.CTS-CAP-MP的差热分析(Differential thermal analysis，DTA)

取适量CTS、TPP、CTS+TPP+CAP的混合物、CAP和CTS-CAP-MP微球，用热分析仪进行热分析，升温速率为10℃/min。DTA分析结果见附图11。TPP在124.9℃时出现一个明显的吸热峰，说明TPP是以晶体状态存在的，熔点约为124.9℃。在附图中CTS观察不到任何明显的吸热峰，说明CTS是以无定形状态存在的，且玻璃化转变温度为245.1℃；在307℃时，CTS图中出现一个明显的强放热峰，说明在307℃附近，CTS发生了分解反应。这是由于在CTS分子中乙酰基所占的比重比其它侧基都要大，另外由于乙酰基上羰基的存在，使C-N键上电子云偏向C的一方，所以在307℃时CTS发生分解反应，脱掉了乙酰基。CAP在71℃时出现一个明显的吸热峰，表明其熔点约为71℃，在359℃时又出现一个明显的强吸热峰。在CTS、CAP和TPP的物理混合物(CTS+TPP+CAP的混合物)的图中我们发现，由于CAP和TPP在物理混合物中所占比例太小已经观察不到71℃和124.9℃的吸收稍弱的吸热峰，但是仍然可以观察到CAP在359℃处的强吸热峰。并且CTS在245.1℃处的玻璃化转变温度和307℃出的分解峰均未发生变化。这表明三者只是简单的物理混合没有发生任何化学反应。

在CTS-MP的图中发现，观察不到TPP的特征吸热峰且CTS在245.1℃出玻璃化转变温度也已经观察不到，而在325℃出现一个强的吸热峰，说明CTS和TPP通过正负电荷基团的结合形成了CTS-MP增加了其机械性能，使分解温度增加。通过CTS-CAP-MP微球的DTA图分析可知，TPP在124.9℃的特征吸热峰和CAP在359℃的特征吸热峰均消失且CTS的玻璃化转变温度也发生改变。而图中在72.3℃和88.4℃处出现了两个明显的吸热峰，这表明CTS、TPP和CAP形成了一种新的物质而不是三者简单的物理混合物，72.3℃的吸热峰可能是微球外面吸附的CAP的熔点峰，而88.4℃是形成新物质CTS-CAP-MP的特征吸热峰。

2.CTS-CAP-MP的粒径和表面电位的测定

CTS-CAP-MP的粒径和表面电位的测定采用激光粒度分析仪测定其粒径分布及表面电位。附图12和附图13分别显示CTS-CAP-MP的粒径分布和Zata电位的分布，结果表明CTS-CAP-MP的平均粒径为4.5μm，平均Zata电位为+3.48mV。

3.CTS-CAP-MP的表面形态观察

用导电双面胶将干燥的CTS-CAP-MP固定在金属样品平台上，在真空中喷涂钯金后，置于电子扫描显微镜中以10kV电子束观察，拍摄CTS-CAP-MP的形貌照片，观察其表面形态。附图14显示的是CTS-CAP-MP的表面形态SEM图(1000倍)，图中可以看出CTS-CAP-MP基本形态呈圆整球形且粒径大小均一。由于CAP熔点较低且吸附在微球表面，容易发生粘连使CTS-CAP-MP微球聚集在一起。

4.CTS-CAP-MP包封率和载药量的测定

精密称取50mg CTS-CAP-MP微球，加入适量甲醇溶解后用甲醇定容于25ml容量瓶中，于超声波清洗机中(35HZ)超声提取30min。高速离心后取上清液用选定的色谱条件测定CAP的含量，测定CTS-CAP-MP中CAP的包封率和载药量。结果见表12所示。

表12 包封率和载药量测定结果

由表12中数据看出，测定CTS-CAP-MP的平均包封率为85.17％，平均载药量为8.87％。包封率和载药量均比CTS-CAP-MP混悬液状态时高，说明在喷雾干燥过程中对CAP又具有一定的包裹作用，产生了二次包裹作用，从而提高了药物的包封率和载药量。

5.CTS-CAP-MP体外释放行为考察

精密称取50mg CTS-CAP-MP，加入40ml磷酸缓冲盐溶液(pH值为7.4)或不含酶的人工胃液(pH值为1.2)，置于37℃恒温水浴振荡箱中恒速振摇(100r/min)，每个样品平行三次。分别于0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h定时高速离心后取样，同时补加相同体积的新鲜释放接受液。取上清液用选定的色谱条件测定CAP的含量，考察CTS-CAP-MP在不同介质中的体外释放行为。附图15所示，CTS-CAP-MP在酸性介质中的释放比较快，在5h内释放到75％，这是因为CTS在酸性溶液中溶解性能很好；但是在24h内CTS-CAP-MP微球并不能完全释放，这是由于CTS-CAP-MP在酸性介质中溶胀后溶解过程中的溶胀层阻止了药物释放完全。在pH值为7.4的中性介质中，CTS-CAP-MP中药物释放较慢，且在24h基本释放完全。

本发明采用合适原料及原料比例，确定可行的工艺，通过离子交联法联合喷雾干燥法制备得到CTS-CAP-MP，并提供了CTS浓度、CAP浓度、溶液pH值和CTS/TPP质量比等对CTS-CAP-MP制备处方的影响，确定了CTS-CAP-MP的优选配方；并通过研究喷雾干燥制备工艺中进风温度、进样速率和热风流量对CTS-CAP-MP的产率和粒径的影响，制备出了包封率和载药量高、产率较高和平均粒径为4.5μm以下的CTS-CAP-MP微球。

本发明对制备出的CTS-CAP-MP，从形态、粒径、结构、包封率、载药量和体外释放等方面进行了全方位的质量研究和控制。研究结果表明，CTS-CAP-MP外观呈球形，粒径分布在0.8μm～4.5μm；CTS和TPP通过化学键牢固的结合并将CAP包载其中，平均包封率和载药量分别为85.17％和8.87％；体外释放结果亦表明，CTS-CAP-MP在酸性介质中释放较快，在中性介质中释放较慢，具有优良的缓释效果，减小和掩盖CAP使用过程中的刺激性。

实施例5 CTS-CAP-MP急性毒性实验

为求出半数致死剂量(LD₅₀)及其他急性毒性参数，观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒效应特征，为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标依据并为毒理学机制研究提供线索，对本发明微球进行了急性毒性实验研究。

1.预实验

参考辣椒碱与CTS微球的理化性质和相关资料，采用每组5只小鼠，口服给药，每次给药量为0.2ml/10g，给药两次，间隔时间为5h。以较大的剂量间隔进行预试，找出10％～90％(或0％～100％)的致死剂量范围为：8g/Kg～16g/Kg(见表13所示)。采用Bliss法设计正式试验分组，各组剂量的计算：

i＝(lgLD₉₀-lgLD₁₀)/(n-1)或i＝(lgLD₁₀₀-lgLD₀)/(n-1)

i为组距，n为设计的剂量组数。以最低剂量值(LD₀或LD₁₀)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组。

表13 预实验动物死亡数

2.毒性实验

试剂：本发明CTS-CAP-MP微球；实验动物：NIH小鼠10只，雌雄各半；给药途径：口服；单位g/Kg。给药体积：0.2ml/10g，给药两次，间隔时间为5h。用Bliss法计算半数致死量。结果见表14所示：

表14 急毒实验结果

回归方程y(Probit)＝-7.6005+10.817Log(D)；半数致死量LD₅₀＝14.618g/Kg(落在10000～15000mg/Kg之间属于实际无毒物质)；LD₅₀(Feiller校正)95％的可信限＝13.412～17.21g/Kg；LD₅＝10.299g/Kg，LD₉₅＝20.746g/Kg。

给药后动物出现不同程度毒性反应：1、2、3组部分小鼠静卧10～60min后即活动正常，2h左右活动完全恢复正常；4、5、6、7组小鼠出现静卧、腹式呼吸明显现象；4、5组小鼠5h左右毒性反应减弱，少量饮食、活动；6、7组部分小鼠出现静卧、暴窜后静卧和抽搐近僵直现象，且均出现眼睑明显松弛现象，24h左右毒性反应减弱，少量饮食、活动。动物死亡现象出现在0.5～24h，3h左右为死亡高峰期，无雌雄差异，24h后无继续死亡现象。解剖死亡小鼠，观察到胃部有不同程度充血现象，其它脏器无异常。给药后继续观察14天：给药24h后各组存活小鼠均不同程度恢复活动、饮食，72h后各组存活小鼠活动、饮食正常。观察期间动物外观、活动、分泌物、排泄物正常，饮食、生长正常，见表15所示。观察期结束后解剖动物，除6、7组胃部略显充血迹象外，各组小鼠脏器无异常，无雌雄差异。

表15 小鼠增重情况监测(g)

实施例6 减肥、降血糖和降血脂应用实验

1.实验动物 选择SPF级的SD大鼠100只，单一性别(雄性)，体重在70～90g之间。适应性喂养一周，随机分为11组，每组10只。

(1)正常对照组(空白对照组)；(2)肥胖对照组(阴性对照组)；(3)奥利司他组(阳性对照1组)；(4)左茶组(阳性对照2组)；(5)甲壳组(阳性对照3组)；(6)CTS对照组；(7)CTS-MP对照组；(8)CAP对照组；(9)H-CTS-CAP-MP低剂量组；(10)M-CTS-CAP-MP中剂量组；(11)L-CTS-CAP-MP高剂量组。

2.剂量确定及给药时间

肥胖组饲喂营养性肥胖饲料；空白对照组饲喂普通饲料；实验组在实验前3周饲喂营养性肥胖饲料，建立动物肥胖模型以后饲喂营养性肥胖饲料同时灌胃CTS、CTS-MP、CTS-CAP-MP，根据前期试验确定CTS-MP为440mg/kg。根据急性毒性实验结果以及现有文献报道，确定CTS-CAP-MP给药剂量为：高剂量：3382mg/kg(含辣椒碱30mg/kg)，中剂量：1128mg/kg(10mg/kg)，低剂量：376mg/kg(3mg/kg)。阳性对照组在实验前3周饲喂营养性肥胖饲料，建立动物肥胖模型以后开始灌两种经中国国家食品药品监督管理局批准的功能性食品甲壳和左茶(主要成分分别为：①甲壳素，②左茶肉碱、茶多酚)和美国国家食品药品监督管理局唯一批准的OTC减肥药奥利司他(主要成分为：奥利司他)，奥利司他的人体口服剂量为0.36g/天，甲壳的人体口服剂量为1.36g/天，左茶的人体口服剂量为2.1g/天，大鼠剂量＝人剂量/60×6.25mg/Kg，按人体重60kg计算，剂量为(等效剂量2倍量)：奥利司他：75mg/kg；甲壳：283.34mg/kg；左茶：437.5mg/kg。

3.减肥和降脂指标测定

通过给食营养性肥胖饲料造肥胖大鼠模型，造模期4周。每周称重，计算肥胖饲料各组平均体重和正常组平均体重，超过20.89％为造模成功(肥胖饲料各组平均体重超过正常组平均体重20％以上)。实验期间，每周定时称量体重，腹围，记录体长(鼻尖到肛门的长度)，每日记录摄食量。实验结束后，称量其体重，并与实验前进行比较。第10周末处死后称量内脏及其周围连带脂肪重，肝脏-80℃保存，腹主动脉取血，离心取血清-80℃保存。

减肥指标：解剖大鼠，取出心脏、肝脏、小肠和盲肠，称其湿重，计算其脏器指数(心脏、肝脏、小肠和盲肠湿重之和与体重之比)，同时取肾周、睾周脂肪，称重，计算脂体比；降脂指标：测血液中TC、TG、HDL、LDL的变化。检测结果见表16～18所示：

表16 给药期间各组大鼠增重、进食量、ΔLee’s指数比较

(means±SE，n＝10)

注：同一列数据中不同字母表示数据间具有显著性差异(p＜0.05)

表17 脏器指数、体脂、脂体比各组间比较(means±SE，n＝10)

注：同一列数据中不同字母表示数据间具有显著性差异(p＜0.05)

表16和表17实验结果说明：CTS-CAP-MP高中低剂量组均能够很好地控制大鼠体重增长、体重指数、脏器指数、体脂、脂体比在正常水平或更低且对大鼠食欲无影响，达到了良好的减肥效果。在控制体重增长、体重指数方面效果尤其明显，甚至优于3个阳性药组。CTS-CAP-MP高剂量组对大鼠各方面肥胖指标均能有效控制，减肥效果明显，但在体重指数、脏器指数和脂体比方面与中剂量组无明显差异，故预计最佳剂量为高剂量组。CTS-CAP-MP的减肥效果优于CTS-MP和CAP，达到协同增效效果。

表18 大鼠血清四项与血糖各组间比较(means±SE，n＝10)

注：同一列数据中不同字母表示数据间具有显著性差异(p＜0.05)

从表18实验结果可知：CTS-CAP-MP高中低剂量组均可显著降低TC、TG、LDL至正常水平，也可使HDL升至正常水平。CTS-CAP-MP高中低剂量组能有效控制血糖；CTS-CAP-MP高中低各剂量组对TC、TG、LDL具有一定的降低作用，对HDL的上调作用优于CTS-MP或CAP。

4.体外吸附脂类物质实验

试验方法参照文献报道方法，实验结果见附图16～19所示，附图16为体外吸附油脂能力比较结果，附图17为体外吸附胆固醇能力比较结果，附图18为体外吸附胆酸盐能力比较结果，附图19为体外吸附游离脂肪酸能力比较结果，附图16～19中曲线1、2和3都分别代表CTS-MP、CTS-CAP-MP和CTS实验结果；从上述紫外全波长扫描图显示的体外吸附脂类物质实验结果表明，CTS、CTS-MP、CTS-CAP-MP三者对油脂、胆固醇、胆酸盐和游离脂肪酸的吸附能力依次为：CTS-MP＞CTS-CAP-MP＞CTS。

本发明所述CTS-CAP-MP的半数致死量LD₅₀＝14.618g/Kg，为实际无毒物质；CTS-CAP-MP具有降血脂作用和降血糖作用；减肥效果明显，显著优于单一的CTS-MP和CAP，实现了协同和增效减肥效果；载有辣椒碱的壳聚糖微粒改变了单一物质的单纯吸附的减肥作用机制，由于辣椒碱的载入，改变了微粒及表面电荷，显著影响了CTS的吸附能力，表明载有辣椒碱的CAP微粒的减肥作用机制是吸附作用和燃烧脂肪作用机制的结合，而本发明的实验结果很好验证了上述分析和结论。

Claims (10)

1.一种壳聚糖载辣椒素微球的制备方法，其特征在于通过离子交联法联合喷雾干燥法制备得到，包括以下步骤：

（1）采用醋酸溶液充分溶解壳聚糖，配制成1.0 mg/ml的壳聚糖溶液；

采用吐温-80溶液溶解辣椒素，配制成1.5mg/ml的辣椒素溶液；

（2）将步骤（1）所述壳聚糖溶液和辣椒素溶液按照10:1的体积比混匀得混合溶液；

（3）将三聚磷酸钠水溶液加入步骤（2）所述混合溶液中得载辣椒素的壳聚糖微球混悬溶液；

（4）将步骤（3）所述载辣椒素的壳聚糖微球混悬溶液，放置至无气泡，用喷雾干燥机进行喷雾干燥。

2.根据权利要求1所述壳聚糖载辣椒素微球的制备方法，其特征在于步骤（1）所述醋酸溶液的浓度为1%；所述吐温-80溶液浓度为0.5%。

3.根据权利要求1所述壳聚糖载辣椒素微球的制备方法，其特征在于步骤（2）所述混合溶液的pH值调节为4.5。

4.根据权利要求1所述壳聚糖载辣椒素微球的制备方法，其特征在于步骤（3）是在搅拌条件下，将浓度为1%的三聚磷酸钠水溶液恒速滴入步骤（2）所述混合溶液中，至蓝色乳光出现，继续搅拌即得载辣椒素的壳聚糖微球混悬溶液；步骤（4）所述喷雾干燥的工艺条件为热风量32 m³/h，进样速率400 ml/h，压缩空气压力10 l/min，进风口的温度为160℃，进样速率为600 ml/h。

5.一种权利要求1、2、3或4所述壳聚糖载辣椒素微球的制备方法制备得到的壳聚糖载辣椒素微球。

6.一种权利要求5所述壳聚糖载辣椒素微球在制备缓释制剂方面的应用。

7.一种权利要求5所述壳聚糖载辣椒素微球在制备减肥药物或保健品方面的应用。

8.一种权利要求5所述壳聚糖载辣椒素微球在制备控制体重药物或保健品方面的应用。

9.一种权利要求5所述壳聚糖载辣椒素微球在制备降血脂药物或保健品方面的应用。

10.一种权利要求5所述壳聚糖载辣椒素微球在制备降血糖药物或保健品方面的应用。

Images