CN114470020B - 三七细胞外囊泡的制备方法及其应用 - Google Patents

三七细胞外囊泡的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种三七细胞外囊泡的制备方法及其应用。本发明将植物中药三七主根碾磨过滤后采用差速离心的方法进行提取，通过精确的控制各步骤条件，制备得到的三七细胞外囊泡轮廓清晰，结构完整。进一步对提取得到的细胞外囊泡进行研究，发现其可以成功的转染至HSF细胞中，并对其凋亡和增殖产生影响。

Description

三七细胞外囊泡的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物和医药领域，具体涉及一种三七细胞外囊泡的制备方法及其应用。
背景技术
人类皮肤衰老是一个不可避免的过程，主要表现为皮肤外观的变化，如皮肤松弛、失去弹性和皱纹的形成。人们普遍认为，皮肤衰老是由各种内因和外因共同驱动的。其中，真皮层纤维细胞是分泌细胞外基质的主要皮肤基质细胞。真皮层细胞可以合成或分泌胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸等细胞外基质成分。这些细胞外基质成分经加工组装成纤维，可以赋予皮肤弹性和韧性，帮助皮肤保持年轻。然而，在衰老过程中，细胞外基质逐渐降解并产生一些有害物质，极大的损害纤维细胞的功能。随着社会的进步和科技的发展，人们对衰老的认识不断深入的同时，对抗衰老的愿望也日益强烈，这就为抗衰老技术产品的开发提供了巨大的市场空间。
目前市面上已有各种方式来延缓皮肤衰老，比如各种美容产品、牛血清蛋白制剂等，但是这些产品大多数只起到物理性的作用。因此，开发更多安全有效，无毒无害的方法去调动皮肤的内在活力，从细胞水平上延缓衰老具有重要的研究意义。
目前已有用干细胞和尿液来源的细胞外囊泡来延缓皮肤层纤维细胞和真皮层纤维细胞的衰老的应用，但是不同的细胞外囊泡颗粒千差万别，生物学功能和运转特性也不尽相同。因此寻找一种能有效作用于人皮肤层纤维细胞的植物细胞外囊泡，通过提取并研究其是否可以有效作用于人真皮层纤维细胞，这对于推动中药细胞外囊泡的研究意义重大。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种新鲜三七细胞外囊泡的制备方法和应用。通过该方法可以有效的对三七细胞中的外囊泡进行提取，提取得到的细胞外囊泡可以成功的转染至HSF细胞中，并对其凋亡和增殖产生影响。
本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：
本发明提供一种三七外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
在温度≤37℃的条件下碾磨三七主根，将碾磨后的三七主根加入到缓冲溶液中，用脱脂纱布过滤掉残渣，收集液体；
将收集的液体在≤6℃，第一预设转速下离心并过滤，收集滤液并转移到超滤离心管中；
将超滤离心管中的滤液在≤6℃，第二预设转速下重复离心，弃去超滤管底部的水；
将超滤浓缩后的液体在第三预设转速下离心70～100min，收集沉淀；
用预冷的缓冲液重悬沉淀，并在第四预设转速下离心收集沉淀；
将收集的沉淀再次重悬即得；
其中第一预设转速为800～1500g，第二预设转速为1500～3000g，第三预设转速为8000～12000g。具体地，第一预设转速为1000g，第二预设转速为 2000g，第三预设转速为100000g。
本发明将新鲜植物中药三七碾磨过滤后离心，制备得到的三七细胞外囊泡轮廓清洗，结构完整。该方法中，三七主根碾磨时应保证机身温度不超过 37℃。
另外，本发明还采用差速离心的方法进行提取，在该方法中，需要严格控制离心次数、离心时间和转速，时间过短或者转速过小，无法充分提取外囊泡，次数过多或者转速过大，又会破坏外囊泡的结构，导致外囊泡的产率下降。
本发明中所用的缓冲液优选为PBS缓冲液，其制备方法如下：
称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌。
作为本发明的一种优选地实施方式，第一预设转速下离心8～12min，第二预设转速下离心20～40min，第三预设转速下离心80～100min，第四预设转速下离心80～90min。
作为本发明的一种优选地实施方式，第四预设转速为80000～120000g。具体地，第四预设转速为100000g。
作为本发明的一种优选地实施方式，碾磨后三七主根的粒径为60～120 目。
作为本发明的一种优选地实施方式，三七主根碎末和PBS溶液的质量体积比为1：(3～5)。
作为本发明的一种优选地实施方式，滤液在第二预设转速下重复操作 2～4次。
本发明还提供了上述方法制备得到的三七外囊泡在延缓皮肤衰老中的应用以及在制备延缓皮肤衰老产品中的应用，该产品可以是颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液体制剂、注射剂、经皮给药制剂中的任一种。
本发明提供了一种中药来源外囊泡的制备方法提取步骤操作简单、成本低廉、易于控制；提取得到的三七细胞外囊泡具有明显的抑制真皮层纤维细胞衰老的作用，可以作为治疗延缓皮肤衰老治疗剂的理想选择。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的细胞外囊泡粒径分布图；
图2为实施例1和对比例2中得到的细胞外囊泡在透射电子显微镜下的照片，其中a为实施例1中得到的外囊泡在透射电子显微镜下的照片，b为对比例2中得到的细胞外囊泡在透射电子显微镜下的照片；
图3为三七外囊泡成功转染至HSF细胞后的荧光显微镜照片，其中八个图片依次代表：对照组(HSF+PBS)中，荧光显微镜下DAPI染色细胞核后的图片(上1)；荧光显微镜下PKH26染色外囊泡后的图片(上2)；将细胞核和外囊泡图片叠加在一起的图片(上3)；白光照射下的细胞形态图片(上4)。外囊泡转染组中，荧光显微镜下DAPI染色细胞核后的图片(下1)；荧光显微镜下PKH26染色外囊泡后的图片(下2)；将细胞核和外囊泡图片叠加到一起后的图片(下3)；白光照射下的细胞形态图片(下4)。
图4为细胞凋亡实验中不同处理条件下对凋亡细胞的影响。其中图A为流式散点图，代表各个时期凋亡细胞的分布情况；B为流式直方图，表示三个分组中，凋亡细胞的百分率。
图5为细胞增殖实验中，不同处理条件下各组细胞的在450nm处的吸光度值(OD450)随时间的变化趋势。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供一种三七细胞外囊泡的制备方法，具体包括以下步骤：
S1，碾磨三七：准备新鲜的洗净的三七主根，用棉布擦净表面水珠，将三七主根用切刀切成小块或者片，将切好的三七放入研钵中，用研杵将其磨碎至80目左右；
过滤除杂：将200mLPBS溶液加入到约45g碾磨好的三七粉末中，用脱脂纱布过滤，收集过滤后的液体；
S2，低速离心：在4℃条件下，先用1000g离心10min，收集上清液，并用滤纸及0.22μm过滤器过滤，除去一些未除净的三七残渣和一些大粒径的坏死细胞等；
S3，超滤浓缩：将过滤后得到的过滤液转移到15mL超滤浓缩离心管中，在4℃下，以2000g离心30min，弃去超滤浓缩离心管底部的液体，反复离心3次；
S4，将超滤浓缩后的液体用高效离心机，在4℃下以100000g的转速离心90min，弃去上清液，收集沉淀；
S5，PBS重悬：用50μL预冷的PBS重悬后，再次用高效离心机4℃、 100000g，离心90min，在超净台上去除上清液，并用30μL PBS重悬，置于-80℃保存备用即可。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，步骤S4中超滤离心的条件为4℃，以5000g离心90min。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，步骤S4中超滤离心的条件为4℃，以100000g离心120min。
对实施例1和对比例1～2制备得到的细胞外囊泡进行表征分析，结果如下：
(1)粒径分析
使用PARTICLE METRIX纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)测量三七外囊泡的颗粒大小，具体步骤为：取冻存样本，25℃水浴解冻，冰上放置；将外囊泡样本用PBS进行稀释(外囊泡：PBS＝1:1)，直接用于NTA检测三七细胞外囊泡的浓度和粒径。
其中实施例1得到细胞外囊泡的粒径分布如图1所示，大多数细胞外囊泡的粒径分布的范围为76.8nm-268.0nm，平均粒径为165.6nm，浓度为 6.0*1011Particles/mL；
对比例1无法提取到三七细胞外囊泡。
对比例2中提取得到的三七细胞外囊泡中部分结构被破坏，具体参见图 2b。
(2)投射电子显微镜分析
将三七外囊泡颗粒沉淀物固定并使用常规程序进行透射电子显微镜检查，采用Hitachi透射电子显微镜进行观察，得到的透射电子显微镜显微照片如图2所示，证实了以上粒径分布的范围。
应用例 三七细胞外囊泡对HSF细胞的影响
(1)荧光显微镜测量细胞外囊泡成功转染至HSF
将实施例1中从三七中分离出来的外囊泡用PKH26红色荧光细胞连接剂试剂盒染色，用外囊泡旋转柱去除未标记的染料。将染色后的外囊泡(2 μg/L×104cells)或等体积的PBS，加入半混溶的HSF细胞中。孵育48h后，用3.7％的PFA洗涤固定10分钟。再用FITC-共轭环肽标记细胞，得到两组细胞(对照组：HSF+PBS；实验组：HSF+外囊泡)。用荧光显微镜测量两组细胞的外囊泡转染效果，得到的荧光显微镜照片如图3所示。与对照组相比，实验组细胞在荧光显微镜下的红色荧光更多，说明三七外囊泡和细胞一起孵育后，被成功转染至HSF细胞。
(2)三七细胞外囊泡对HSF凋亡的影响
用H2O2构建细胞衰老模型后，将细胞分为两组，其中一组转染入三七外囊泡孵育，得到三组细胞(对照组：HSF+PBS；衰老组：HSF+H2O2+PBS；实验组：HSF+H2O2+外囊泡)。为了保证实验结果的准确性，每组均设置三个平行样。用Beckman CytoFLEX S流式细胞仪和Solarbio的凋亡试剂盒测量6组细胞中凋亡细胞的个数，得到的实验结果如图4和表1所示。实验结果表明，与对照组相比，衰老组的凋亡细胞数目明显变多，加入外囊泡后，由H2O2诱导的HSF细胞凋亡被有效抑制。
表1不同处理条件下的细胞各个时期凋亡细胞的百分比
(3)三七细胞外囊泡对HSF增殖的影响
用H2O2构建细胞衰老模型后，将细胞分为两组，其中一组转染入三七外囊泡孵育，得到三组细胞(对照组：HSF+PBS；衰老组：HSF+H2O2+PBS；实验组：HSF+H2O2+外囊泡)。为了保证实验结果的准确性，每组均设置三个平行样。将处理过的细胞胰酶消化后计数，接种1000个细胞至96孔板，每孔100μl培养基，将培养板置37℃，5％CO2培养箱中培养0h、24h、48h 和72h；每孔加入10μL Solarbio CCK-8溶液，用加了相应量细胞培养液和 CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；在细胞培养箱内继续孵育 0.5h，用汇松酶标仪在450nm测定吸光度，得到的实验结果如图5和表2所示。实验结果表明，与对照组相比，衰老组的吸光度明显变少，这说明细胞的增值能力变弱。而加入细胞外囊泡后，实验组的吸光度明显增强，这说明转入细胞外囊泡后，细胞的增值能力恢复。
表2不同处理条件下的各组细胞的在450nm处的吸光度值。
综上所述，这些数据表明，三七细胞外囊泡被成功提取，能成功转入 HSF细胞，且可以有效延缓皮肤衰老。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.三七细胞外囊泡在制备延缓皮肤衰老产品中的应用，其特征在于，三七细胞外囊泡的制备方法如下：
在温度≤37℃的条件下碾磨三七主根，将碾磨后的三七主根加入到PBS溶液中，用脱脂纱布过滤掉残渣，收集液体；
将收集的液体在≤6℃，第一预设转速下离心并过滤，收集滤液并转移到超滤离心管中；
将超滤离心管中的滤液在≤6℃，第二预设转速下重复离心，弃去超滤管底部的水；
将超滤浓缩后的液体在第三预设转速下离心70~100min，收集沉淀；
用预冷的缓冲液重悬沉淀，并在第四预设转速下离心收集沉淀；
将收集的沉淀再次重悬即得；
第一预设转速为800~1500g，第二预设转速为1500~3000g，第三预设转速为80000~120000g，第四预设转速与第三预设转速相当。
2.根据权利要求1所述的三七细胞外囊泡在制备延缓皮肤衰老产品中的应用，其特征在于，第一预设转速下离心8~12min，第二预设转速下离心20~40min，第三预设转速下离心80~100min，第四预设转速下离心80~90min。
3.根据权利要求1所述的三七细胞外囊泡在制备延缓皮肤衰老产品中的应用，其特征在于，第一预设转速为1000g，第二预设转速为2000g，第三预设转速为100000g。
4.根据权利要求1所述的三七细胞外囊泡在制备延缓皮肤衰老产品中的应用，其特征在于，第四预设转速为80000~120000g。
5.根据权利要求1所述的三七细胞外囊泡在制备延缓皮肤衰老产品中的应用，其特征在于，碾磨后三七主根的粒径为60~120目。
6.根据权利要求1所述的三七细胞外囊泡在制备延缓皮肤衰老产品中的应用，其特征在于，三七主根碎末和PBS溶液的质量体积比为1：（3~5）。
7.根据权利要求1所述的三七细胞外囊泡在制备延缓皮肤衰老产品中的应用，其特征在于，滤液在第二预设转速下重复操作2~4次。
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