IT201900005090A1 - Procedimento per la produzione di vescicole da succo di agrumi - Google Patents

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IT201900005090A1
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juice
subjected
vesicles
permeate
feed
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IT102019000005090A
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English (en)
Inventor
Riccardo Alessandro
Alice Conigliaro
Stefania Raimondo
Valeria Corleone
Maria Angela Sartorio
Paola Sangiorgio
Daniele Pizzichini
Gian Paolo Leone
Anna Spagnoletta
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Navhetec S R L
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Description

Descrizione dell'invenzione dal titolo: procedimento per la produzione di vescicole da succo di agrumi
Sfondo dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce al settore della chimica ed in particolare a un procedimento per la produzione di vescicole da succo di agrumi, un impianto in cui svolgere detto procedimento nonché il permeato ottenuto e le sue forme liofilizzate e atomizzate (spray-drying) le quali contengono le vescicole, nonché il loro uso per ridurre lo stress ossidativo e per il trattamento della patologie infiammatorie.
Stato dell'arte
La domanda di brevetto statunitense pubblicazione n. US2014308212 descrive delle micro-vescicole di origine vegetale che derivano da uva, pompelmo e pomodoro che incapsulano un agente terapeutico, in particolare un agente chemioterapico. In particolare, le nano-vescicole sono isolate mediante centrifugazione in gradiente.
La domanda di brevetto Italiana n. 02015902344749 (RM2015A000162) descrive un procedimento per ottenere delle nano-vescicole dal succo di frutti di Citrus limon L comprendente i passaggi di centrifugare e filtrare il succo in uno o più cicli consecutivi, ultracentrifugare per ottenere un surnatante liquido e un pellet di sedimentazione dal quale si recuperano le vescicole.
Problema tecnico
Gli inventori della presente invenzione hanno implementato i procedimenti noti nell’arte ed in particolare quello descritto nella domanda di brevetto Italiana n. 02015902344749 (RM2015A000162).
Nello specifico gli inventori della presente invenzione hanno messo a punto un procedimento che permette di processare elevati volumi di succo e che, contrariamente al procedimento descritto nella domanda di brevetto Italiana n. 02015902344749 (RM2015A000162), può essere efficacemente applicato su scala industriale.
In particolare, in una prima fase del processo, che comprende centrifugazione ed ultrafiltrazione, si ottengono due succhi di caratteristiche diverse, uno limpido e uno torbido, quest’ultimo risulta 10 volte più concentrato del prodotto di partenza. La seconda parte del processo è volta a trattare solo il succo torbido, definito feed, mediante microfiltrazione, e successivamente e in alternativa mediante atomizzazione o liofilizzazione.
Oggetto dell'invenzione
Con riferimento alle rivendicazioni allegate, il problema tecnico viene pertanto risolto fornendo un procedimento per la preparazione di vescicole da succo di agrumi comprendente i seguenti stadi:
a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione;
b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione;
c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione fino ad ottenere un succo limpido e un succo torbido (feed) caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi di partenza dello stadio a);
d) Il succo torbido (feed) ottenuto nello stadio c) è sottoposto a microfiltrazione con cut-off 0,45 µm, oppure in alternativa a cromatografia per esclusione molecolare in cui la fase stazionaria ha particelle di dimensioni di 20-80 µm (dry), con un campo di frazionamento pari a 1-30kDa, fino ad ottenere un permeato/eluato che contiene le vescicole.
in cui il permeato che si ottiene nello stadio d) è sottoposto a liofilizzazione fino ad ottenere un liofilizzato che contiene le vescicole, oppure in alternativa è sottoposto ad atomizzazione (spray-drying) per ottenere vescicole atomizzate.
Costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione le vescicole ottenute direttamente dal suddetto processo, sia nella forma atomizzata che liofilizzata, nonché il succo torbido (feed) che si ottiene al termine dello stadio c) e il permeato che si ottiene al termine dello stadio d).
Costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione le vescicole nella forma atomizzata, nella forma liofilizzata e nel succo torbido (feed) e nel permeato per uso per ridurre lo stress ossidativo.
Costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione le vescicole nella forma atomizzata, nella forma liofilizzata e nel succo torbido (feed) e nel permeato per uso per la prevenzione ed il trattamento delle patologie infiammatorie.
Costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione uno schema di impianto per svolgere un procedimento per la preparazione di vescicole da succo di agrumi comprendente
un ingresso per il succo in precedente pastorizzato e centrifugato,
almeno due moduli filtranti ceramici posti in una conformazione a girasole (sunflower) in cui si svolgono in maniera sequenziale prima lo stadio di ultrafiltrazione e poi lo stadio di microfiltrazione
e un sistema di refrigerazione in continuo per il mantenimento della temperatura dell’impianto
un sistema di uscita per il prodotto del procedimento.
Breve descrizione delle figure
La figura 1 e la figura 2 mostrano in grafico i risultati di NTA nanoparticle tracking analysis.
La figura 3 mostra in grafico i risultati di DLS dinamyc light scattering.
La figura 4 mostra lo spettro NMR di campioni da atomizzazione, permeato di microfiltrazione e esosomi isolati mediante ultracentrifugazione e cromatografia.
La figura 5 mostra in grafico i risultati di test di tossicità su cellule RAW264.7, HS5 e Huvec.
La figura 6 mostra in grafico la concentrazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in cellule RAW264.7 trattate per 18h con due diverse concentrazioni di prodotto atomizzato e con menadione come controllo positivo.
La figura 7 mostra in grafico la percentuale di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in cellule RAW264.7 pre-trattate per 18h con il prodotto atomizzato e per 2h con menadione.
La figura 8 mostra in grafico i livelli di espressione genica di IL6, TNF-a, IL1b, IL-10 in cellule RAW264.7 pre-trattate per 18h con il prodotto atomizzato e LPS.
La figura 9 mostra in grafico i risultati di citofluorimetria di PBMC da pazienti con artrite reumatoide trattate per 48 e 72h con il prodotto atomizzato, in particolare la percentuale di espansione delle cellule Treg FOXP3 .
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Definizioni
Nell’ambito della presente invenzione, per agrumi si intendono le piante coltivate appartenenti al genere Citrus della sottofamiglia Aurantioideae (famiglia delle Rutaceae) e i loro frutti. In particolare bergamotto (Citrus bergamia), arancia (Citrus sinensis), mandarino (Citrus reticulata), pompelmo (Citrus paradisi), limone (Citrus limon).
Nell’ambito della presente invenzione, per pastorizzazione si intende il processo di trattamento termico volto a eliminare potenziali microorganismi patogeni dannosi per la salute da prodotti destinati all’uso alimentare.
Nell’ambito della presente invenzione, per centrifugazione si intende il processo che sfrutta la forza centrifuga per separare corpi aventi diverse densità.
Nell’ambito della presente invenzione, per ultrafiltrazione si intende il processo di filtrazione mediante membrana semipermeabile avente pori con diametro compreso tra 1 e 100 nm.
Nell’ambito della presente invenzione per strippaggio si intende il procedimento di estrazione degli olii contenuti nel succo mediante distillazione sotto vuoto, ove lo strippaggio avviene preferibilmente ad una temperatura pari a 85°C e 700 mm di Hg di vuoto.
Nell’ambito della presente invenzione, per microfiltrazione con cut-off 0,45 µm si intende il processo di filtrazione mediante membrana aventi pori di diametro tale da trattenere particelle con dimensioni maggiori di 0,45 µm.
Nell’ambito della presente invenzione, per cromatografia di esclusione molecolare si intende la cromatografia in cui la fase stazionaria ha particelle di dimensioni di 20-80 µm (dry), con un campo di frazionamento pari a 1-30kDa.
Nell’ambito della presente invenzione, per succo limpido si intende il permeato ottenuto a seguito di ultrafiltrazione.
Nell’ambito della presente invenzione, per un succo torbido si intende il feed ottenuto dalla ultrafiltrazione e caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi di partenza.
Nell’ambito della presente invenzione, per liofilizzazione si intende il processo di crio-essiccamento sottovuoto volto ad eliminare il contenuto di acqua da un prodotto, in questo caso dal permeato che si ottiene al termine dello stadio d) del processo.
Nell’ambito della presente invenzione, per liofilizzato si intende il prodotto contenente vescicole essiccato ottenuto al termine del processo di liofilizzazione del permeato che si ottiene al termine dello stadio d) del processo.
Nell’ambito della presente invenzione, per atomizzazione (spray-drying) si intende il processo per essiccare un prodotto liquido mediante dispersione in minutissime gocce che vengono rapidamente essiccate da una corrente di aria calda; in particolare viene applicata tale tecnica sul permeato che si ottiene al termine dello stadio d) del processo.
Nell’ambito della presente invenzione il processo di atomizzazione a spruzzo (spray-drying) può prevedere l’addizione di agenti di rivestimento, come per esempio maltodestrine, amido, cellulosa, gomma di guar, polimeri, amido, pectine, che agevolano il processo di dispersione ed essiccamento e riducono l’igroscopicità del prodotto finito, aumentandone quindi la stabilità.
Nell’ambito della presente invenzione, per vescicole atomizzate si intendono le vescicole essiccate ottenute al termine del processo di atomizzazione del permeato che si ottiene al termine dello stadio d) del processo.
Nell’ambito della presente invenzione per stress ossidativo si intende la condizione che implica anomalie nello stato redox e l’aumento di perossidi e radicali liberi.
Nell’ambito della presente invenzione, per patologie infiammatorie si intendono le condizioni patologiche dovute ad uno stato infiammatorio come per esempio: appendicite, ascesso epidurale spinale, asma, borsite, bronchiolite, bronchite, bronchite acuta, broncopolmonite, calazio, cheilite, cheratite puntata, cheratocongiuntivite, cisti radicolare, cistite, cistite interstiziale, cistotrigonite, colite aspecifica, congiuntivite, congiuntivite allergica, coroidite, dacriocistite, dermatite, dermatite atopica, dermatite nummulare, edema di reinke, encefalite, encefalite limbica, encefalomielite, enterite, epicondilite, epididimite, gastroduodenite, gastroenterite gastroenterocolite, gengivite, glossite, glossocele, granuloma apicale, ileite, infezione delle vie urinarie, irite, laringite acuta, laringite cronica, lesioni endo-parodontali, miocardite, oftalmite, orchite, orzaiolo, osteomielite, osteomielite cronica multifocale ricorrente, otite, otite media, pachivaginalite, pancreatite acuta, malattia parodontale, parodontite, parodontite apicale, parodontite apicale acuta, periartrite, periartrite scapoloomerale, pericardite, pericoronite, perimplantite, peritonite, pielonefrite, pleurite, polmonite, prostatite, pulpite, rinite, rinite gravidica, rinite non allergica, rinosinusite, sindrome da risposta infiammatoria sistemica, sindrome di dressler, sindrome di libman-sacks, sinusite, tendinite, tendinite da texting, tendinopatia achillea, tiroidite di de quervain, tricodinia, urosepsi, uveite, vaginite, vaginosi, vulvite.
Nell’ambito della presente invenzione le patologie infiammatorie comprendono anche le malattie reumatiche autoimmuni, come per esempio: artrite idiopatica giovanile, artrite psoriasica, artrite reumatoide, artriti croniche dell'infanzia, connettivite indifferenziata, connettivite mista, dermatomiosite, dermatomiosite amiopatica, lupus eritematoso cutaneo, lupus eritematoso indotto da farmaci, lupus eritematoso sistemico, miosite, poliarterite nodosa, polimiosite, sclerodermia, sindrome di felty, sindrome di sjögren, spondilite anchilosante, spondiloartriti sieronegative, malattia di still dell'adulto.
Nell’ambito della presente invenzione le patologie infiammatorie comprendono anche le vasculiti, cioè le patologie infiammatorie a carico dei vasi sanguigni, come per esempio: arterite, arterite di takayasu, arterite granulomatosa, arterite settica, arterite temporale, capillarite, crioglobulinemia mista essenziale, granulomatosi associata a poliangioite, malattia di buerger, poliangioite microscopica, poliarterite nodosa, porpora di schönleinhenoch, sindrome di behçet, sindrome di churg-strauss, sindrome di cogan, sindrome di kawasaki, vasculite da ipersensibilità, vasculite leucocitoclastica, vasculite orticarioide ipocomplementemica.
La presente invenzione riguarda un procedimento per la preparazione di vescicole da succo di agrumi comprendente i seguenti stadi:
a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione;
b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione;
c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione fino ad ottenere un succo limpido e un succo torbido (feed) caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi di partenza dello stadio a);
d) il succo torbido (feed) ottenuto nello stadio c) è sottoposto a microfiltrazione con cut-off 0,45 µm, oppure in alternativa a cromatografia per esclusione molecolare in cui la fase stazionaria ha particelle di dimensioni di 20-80 µm (dry), con un campo di frazionamento pari a 1-30kDa, fino ad ottenere un permeato/eluato che contiene le vescicole.
in cui il permeato che si ottiene nello stadio d) è sottoposto a liofilizzazione fino ad ottenere un liofilizzato che contiene le vescicole oppure in alternativa è sottoposto ad atomizzazione (spray-drying) per ottenere vescicole atomizzate.
Opzionalmente nel processo di atomizzazione al permeato viene addizionato almeno un agente di rivestimento.
Preferibilmente l’agente di rivestimento è scelto nel gruppo consistente di: maltodestrine, amido, cellulosa, gomma di guar, polimeri, amido, pectine, che agevolano il processo di dispersione ed essiccamento e riducono l’igroscopicità del prodotto finito, aumentandone quindi la stabilità.
Preferibilmente nello stadio a) il succo spremuto da frutti di agrumi è succo di bergamotto, arancia, mandarino, pompelmo, limone, più preferibilmente limone.
Preferibilmente nello stadio a) la pastorizzazione è condotta ad una temperatura compresa tra 82°C e 88°C e per un tempo compreso tra 15 e 25 secondi; più preferibilmente ad una temperatura di 85°C per 20 secondi.
Preferibilmente nello stadio b) la centrifugazione è condotta ad una temperatura compresa tra 55 e 65 °C, ad una velocità di rotazione compresa tra e 4900 e 5100 rpm e per un tempo compreso tra 50 e 60 secondi; più preferibilmente ad una temperatura di 60°C per 55 secondi, a 5000 rpm.
Preferibilmente nello stadio c) l’ultrafiltrazione è condotta utilizzando membrane semi-porose con dimensioni dei pori 50.000 Dalton, a una temperatura compresa tra 30 e 35°C.
Più preferibilmente la membrana semi-porosa è scelta nel gruppo consistente di membrana di polisulfone e membrana di materiale ceramico.
Quando l’ultrafiltrazione è condotta usando una membrana semiporosa di polisulfone prima dello stadio c) di ultrafiltrazione il centrifugato ottenuto nello stadio b) è preventivamente sottoposto a strippaggio.
Il procedimento di strippaggio permette di estrarre gli olii contenuti nel centrifugato ottenuto nello stadio b).
Preferibilmente il procedimento di strippaggio avviene ad una temperatura pari a 85°C e in condizioni di 700 mm di Hg di vuoto.
Preferibilmente nello stadio d) la microfiltrazione con cutoff 0,45 µm è condotta ad una temperatura minore o uguale a 25°C e in condizioni di pressione in entrata e in uscita inferiori o uguali a 5 bar. Preferibilmente la temperatura è di 20°C e la pressione in entrata e in uscita è di 0,4 bar.
Preferibilmente nello stadio d) la separazione per cromatografia viene condotta impiegando una fase stazionaria scelta nel gruppo consistente di: resine polimeriche di destrano, resine polimeriche di agarosio entrambi con campi di frazionamento tra 10-4000 kDa.
Preferibilmente nello stadio d) la separazione per cromatografia viene condotta impiegando una fase mobile scelta nel gruppo consistente di: fasi mobili eluenti salini isoosmotici al succo di limone aventi valori di pH compresi tra 3 e 6.
Preferibilmente quando il permeato che si ottiene nello stadio d) è sottoposto a liofilizzazione, il permeato viene inizialmente disposto su di una ampia superficie con spessore max 1,5cm, per facilitare la liofilizzazione, e congelato ad una T compresa tra -50 e -30°C.
Successivamente viene sottoposto a essiccamento primario, o sublimazione sottovuoto, che viene condotto in autoclave mediante abbassamento della pressione a valori al di sotto del punto triplo, cioè compresi tra 30 e 50 Pa, e scaldando il prodotto congelato secondo rampe di temperatura, fintantoché il ghiaccio sublima ed il vapore formatosi viene convogliato da una camera di liofilizzazione a un condensatore, posto ad una temperatura compresa tra -45 e -40°C.
Preferibilmente la rampa di temperatura è un riscaldamento da una temperatura di -30°C a -20°C in un tempo di 60 minuti.
Successivamente viene sottoposto a essiccamento secondario, o evaporazione sottovuoto, al fine di allontanare per evaporazione anche l’acqua incongelabile legata o di cristallizzazione, riscaldando fino ad una temperatura di 30°C in condizioni di medio vuoto, cioè ad una pressione di 20 Pa, fino ad attenere un prodotto avente una umidità residua inferiore al 2%. Il prodotto finale liofilizzato viene infine ottenuto mediate rottura del vuoto con azoto.
Generalmente la durata della fase di essiccamento secondario è la metà della fase di essiccamento primario.
Il prodotto liofilizzato può essere conservato mediante confezionamento in idonei contenitori sottovuoto. Preferibilmente nella fase di liofilizzazione viene aggiunto un idoneo additivo che permette di mantenere durante la liofilizzazione la struttura del congelato facilitando così la sublimazione, detto idoneo additivo è scelto nel gruppo consistente di pectina, alginati, carragenina, maltodestrine.
Preferibilmente l’atomizzazione (spray-drying) è condotta ad una temperatura di ingresso minore o uguale a 250°C e una temperatura di uscita compresa tra 85 e 110°C ad una velocità di rotazione della turbina inferiore o uguale a 30,000 rpm, ad una portata d’aria inferiore o uguale a 800 m<3>/h, e capacità evaporativa compresa tra 15 e 20 L/h. Preferibilmente la temperatura di ingresso è di 180°C.
Preferibilmente la temperatura di uscita è pari a 90°C.
Preferibilmente la velocità di rotazione della turbina è pari a 15,000 rpm.
Preferibilmente la portata d’aria è pari a 400 m<3>/h.
Preferibilmente la capacità evaporativa è pari a 20 L/h.
La presente riguarda le vescicole che si ottengono da succo di agrumi mediante il procedimento comprendente i seguenti stadi:
a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione;
b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione;
c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione fino ad ottenere un succo limpido e un succo torbido (feed) caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi di partenza dello stadio a);
d) Il succo torbido (feed) ottenuto nello stadio c) è sottoposto a microfiltrazione con cut-off 0,45 µm fino ad ottenere un permeato che contiene le vescicole,
in cui il permeato che si ottiene nello stadio d) è sottoposto a liofilizzazione fino ad ottenere un liofilizzato che contiene le vescicole oppure in alternativa è sottoposto ad atomizzazione (spray-drying) per ottenere vescicole atomizzate.
Le vescicole ottenute dal suddetto processo sono caratterizzate da una dimensione compresa tra 75 e 100 nm, preferibilmente di 100nm, e dalla presenza nello spettro NMR dei picchi 0,75-1,00 ppm e 1,55-1,80 ppm.
Le vescicole ottenute dal suddetto processo si presentano sia nella forma atomizzata che liofilizzata.
La presente invenzione riguarda ulteriormente il succo torbido (feed) che contiene le vescicole e si ottiene mediante il procedimento comprendente i seguenti stadi:
a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione;
b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione,
c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione;
in cui il succo torbido (feed) è caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi di partenza dello stadio a).
La presente invenzione riguarda ulteriormente il permeato che contiene le vescicole e si ottiene mediante il procedimento comprendente i seguenti stadi:
a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione;
b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione,
c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione fino ad ottenere un succo limpido e un succo torbido (feed) caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi si partenza dello stadio a)
d) Il succo torbido (feed) ottenuto nello stadio c) è sottoposto a microfiltrazione con cut-off 0,45 µm fino ad ottenere un permeato che contiene le vescicole.
Il permeato è caratterizzato dai seguenti parametri:
Acidità % p/p compresa tra 0.5 e 8;
Brix compreso tra 5 e 14;
Contenuto di glucosio g/l compresa tra 0 e 120;
Contenuto di fruttosio g/l compresa tra 0 e 120;
Contenuto di saccarosio g/l compresa tra 0 e 180 ;
Contenuto di acido malico g/l compresa tra 0 e 75;
Contenuto di acido isocitrico mg/l compresa tra 10 e 5000;
Contenuto di eriocitrina mg/l compresa tra 0 e 3400;
Contenuto di esperidina mg/l compresa tra 0 e 5000.
Il liofilizzato contenente le vescicole è caratterizzato dai seguenti parametri:
Acidità % p/p compresa tra 0.5 e 8;
Brix compreso tra 5 e 14;
Contenuto di glucosio g/l compresa tra 0 e 120;
Contenuto di fruttosio g/l compresa tra 0 e 120;
Contenuto di saccarosio g/l compresa tra 0 e 180;
Contenuto di acido malico g/l compresa tra 0 e 75;
Contenuto di acido isocitrico mg/l compresa tra 10 e 5000;
Contenuto di eriocitrina mg/l compresa tra 0 e 3400;
Contenuto di esperidina mg/l compresa tra 0 e 5000;
L’atomizzato contenente le vescicole è caratterizzato dai seguenti parametri:
Acidità % p/p compresa tra 0.5 e 8;
Brix compreso tra 5 e 14;
Contenuto di glucosio g/l compresa tra 0 e 120;
Contenuto di fruttosio g/l compresa tra 0 e 120;
Contenuto di saccarosio g/l compresa tra 0 e 180;
Contenuto di acido malico g/l compresa tra 0 e 75;
Contenuto di acido isocitrico mg/l compresa tra 10 e 5000;
Contenuto di eriocitrina mg/l compresa tra 0 e 3400;
Contenuto di esperidina mg/l compresa tra 0 e 5000; Costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione le vescicole nella forma atomizzata, nella forma liofilizzata e nel succo torbido (feed) e nel permeato per uso per ridurre lo stress ossidativo.
Costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione le vescicole nella forma atomizzata, nella forma liofilizzata e nel succo torbido (feed) e nel permeato per uso per la prevenzione ed il trattamento delle patologie infiammatorie.
Preferibilmente le patologie infiammatorie sono scelte nel gruppo comprendente: appendicite, ascesso epidurale spinale,asma, borsite, bronchiolite, bronchite, bronchite acuta, broncopolmonite, calazio, cheilite, cheratite puntata, cheratocongiuntivite, cisti radicolare, cistite, cistite interstiziale, cistotrigonite, colite aspecifica, congiuntivite, congiuntivite allergica, coroidite, dacriocistite, dermatite, dermatite atopica, dermatite nummulare, edema di reinke, encefalite, encefalite limbica, encefalomielite, enterite, epicondilite, epididimite, gastroduodenite, gastroenterite gastroenterocolite, gengivite, glossite, glossocele, granuloma apicale, ileite, infezione delle vie urinarie, irite, laringite acuta, laringite cronica, lesioni endo-parodontali, miocardite, oftalmite, orchite, orzaiolo, osteomielite, osteomielite cronica multifocale ricorrente, otite, otite media, pachivaginalite, pancreatite acuta, malattia parodontale, parodontite, parodontite apicale, parodontite apicale acuta, periartrite, periartrite scapoloomerale, pericardite, pericoronite, perimplantite, peritonite, pielonefrite, pleurite, polmonite, prostatite, pulpite, rinite, rinite gravidica, rinite non allergica, rinosinusite, sindrome da risposta infiammatoria sistemica, sindrome di dressler, sindrome di libman-sacks, sinusite, tendinite, tendinite da texting, tendinopatia achillea, tiroidite di de quervain, tricodinia, urosepsi, uveite, vaginite, vaginosi, vulvite.
Preferibilmente le patologie infiammatorie sono malattie reumatiche autoimmuni.
Più preferibilmente le malattie reumatiche autoimmuni sono scelte nel gruppo comprendente: artrite idiopatica giovanile, artrite psoriasica, artrite reumatoide, artriti croniche dell'infanzia, connettivite indifferenziata, connettivite mista, dermatomiosite, dermatomiosite amiopatica, lupus eritematoso cutaneo, lupus eritematoso indotto da farmaci, lupus eritematoso sistemico, miosite, poliarterite nodosa, polimiosite, sclerodermia, sindrome di felty, sindrome di sjögren, spondilite anchilosante, spondiloartriti sieronegative, malattia di still dell'adulto.
Preferibilmente le patologie infiammatorie sono vasculiti.
Più preferibilmente le vasculiti sono scelte nel gruppo comprendente: arterite, arterite di takayasu, arterite granulomatosa, arterite settica, arterite temporale, capillarite, crioglobulinemia mista essenziale, granulomatosi associata a poliangioite, malattia di buerger, poliangioite microscopica, poliarterite nodosa, porpora di schönleinhenoch, sindrome di behçet, sindrome di churg-strauss, sindrome di cogan, sindrome di kawasaki, vasculite da ipersensibilità, vasculite leucocitoclastica, vasculite orticarioide ipocomplementemica.
Costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione uno schema di impianto per svolgere un procedimento per la preparazione di vescicole da succo di agrumi comprendente:
un ingresso per il succo in precedente pastorizzato e centrifugato,
almeno due moduli filtranti ceramici posti in una conformazione a girasole (sunflower) in cui si svolgono in maniera sequenziale prima lo stadio di ultrafiltrazione e poi lo stadio di microfiltrazione
e un sistema di refrigerazione in continuo per il mantenimento della temperatura dell’impianto
un sistema di uscita per il prodotto del procedimento.
Esempi
Il succo spremuto viene pastorizzato e centrifugato: pastorizzazione a 85°C per 20 secondi e centrifugazione a 60° in continuo a circa 4500 rpm. Il succo viene poi sottoposto ad ultrafiltrazione mediante membrane in Polysulfone con dimensione di 50.000 Dalton, ingresso in UF 30-35°C. Dall'ultrafiltrazione si ottiene un succo limpido (5.000 lt/h) e un succo torbido (500 lt/h). Si procede con il succo torbido (feed) che è 10 volte più concentrato rispetto a quello di partenza ed è sottoposto a microfiltrazione con cut-off a 0,45 µm da cui si ottiene un permeato. E’ stato utilizzato un impianto pilota equipaggiato con due moduli filtranti ceramici TAMI cut-off 0,45 µm da 0,35 m2 in conformazione “sunflower” (girasole) per una superficie filtrante totale di 0,7 m<2>, dotato di refrigerazione in continuo del succo torbido (feed), per mantenere la temperatura di lavoro a valori inferiori o uguali a 25 °C, e si sono raccolti i dati inerenti le condizioni di pressione, temperatura e portata che definiscono l’andamento della filtrazioni, individuandone la performance.
Il dati di rilievo ai fini della valutazione del processo in termini di performance sono stati:
i. la durata della filtrazione che indica il tempo di inizio e fine della prova;
ii. la temperatura media perché l’incremento della temperatura influisce sulla produttività media della filtrazione, l‘efficacia separativa e la composizione finale delle frazioni, ,
iii. la portata di permeato media che indica l’efficienza del processo di filtrazione nel tempo, poiché basse produttività si traducono in lunghi tempi di processamento;
iv. la produttività media cioè la portata del permeato in relazione alla superficie di membrana, poiché detto valore indica quanto permeato viene prodotto nell’unità di tempo e per unità di superficie filtrante ed è un parametro importante per il dimensionamento degli impianti;
v. la portata di ricircolo: determinante per le condizioni di pressione in Microfiltrazione, deve mantenersi elevata per garantire un efficiente scorrimento sulla membrana e ridurre l’intasamento dei pori.
vi. le pressioni in ingresso e uscita: le condizioni di pressione sono in Microfiltrazione il risultato della portata di ricircolo che mantenendosi alta tende a creare condizioni di pressione basse (inferiori ai 5 bar) e un regime dinamico sulla superficie di membrana.
vii. i volumi delle frazioni, cioè i volumi separati delle frazioni di processo: succo torbido (o feed), concentrato e permeato in litri.
viii. il rapporto volumetrico di concentrazione VCR:
espresso come il rapporto tra il volume del succo torbido (permeato o feed) in ingresso e il volume di concentrato ottenuto, è in relazione alla produttività e alla durata dell’efficienza totale del processo nella concentrazione o separazione delle sostanze di interesse.
Nelle tabelle che seguono sono riportati i parametri di due prove indipendenti.
Tabella 1
Tabella 2
Il permeato ottenuto dopo Microfiltrazione è sottoposto a atomizzazione (spray-drying) o liofilizzazione, per la sua disidratazione.
Nella atomizzazione (spray-drying) il permeato è stato addizionato di MaltoDestrine (MD) per un quantitativo pari al 15% - 20% del permeato iniziale. Tali attività sono state eseguite mediante un impianto pilota della ICF Industrie CIBEC S.p.A., Modello Beta 1C/15-20/UDF-T/SC: riscaldatore dell’aria elettrico (temperatura di ingresso fino a 250 °C, temperatura di uscita 85-110 °C); velocità turbina (atomizzatore rotante) fino a 30,000 rpm; portata d'aria fino a 800 m3/h; capacità evaporativa 20 L/h.
Per la liofilizzazione è stato usato un Liofilizatore Genesis 35ES VIRTIS su scala intermedia, 7 ripiani, sistema di stoppering automatico, capacità condensatore 35 L; superficie evaporante: 1 m2 (circa 20L in bulk).
Un esempio di condizioni operative di atomizzazione (spraydrying) sono riportate nella tabella 3 che segue.
Tabella 3
Le prove condotte mediante microfiltrazione hanno permesso il recupero di un permeato complessivo contenente vescicole, che sono state evidenziate anche nella polvere ottenuta per disidratazione mediante spray-drying.
Sono state condotte analisi di NTA Nanoparticle Tracking Analysis (analisi del tracciamento delle nanoparticelle) e di DLS Dinamyc Light Scattering (dispersione dinamica della luce) per ottenere la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle dei campioni in sospensione liquida. L’analisi NTA sul permeato mostra particelle di dimensione media di 111.7 nm; l’analisi NTA sul campione ottenuto attraverso cromatografia mostra particelle di dimensione media di 190.5 nm; l’analisi DLS su atomizzato mostra particelle con diametro medio di 50nm. I risultati sono mostrati in figura 1, figura 2 e figura 3 rispettivamente.
Sono state condotte analisi di SEM (microscopio elettronico a scansione) sul campione di permeato che hanno mostrato vescicole di dimensione dai 60 ai 100 nm.
Sono stati anche messi a confronto gli spettri NMR dei campioni ottenuti per cromatografia, per atomizzazione a spruzzo e del permeato con lo spettro degli esosomi isolati mediante ultracentrifugazione, in cui gli esosomi isolati mediante centrifugazione sono ottenuti mediante il processo descritto nella domanda di brevetto Italiana n. 02015902344749 (RM2015A000162). Tutti i campioni hanno mostrano segnali larghi caratteristici degli esosomi nelle regioni 0,75-1,00ppm e 1,55-1,80ppm, così come riportato in letteratura (Laulagnier K1, Motta C, Hamdi S, Roy S, Fauvelle F, Pageaux JF, Kobayashi T, Salles JP, Perret B, Bonnerot C, Record M., Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization, Biochem J.
2004 May 15;380(Pt 1):161-71). I risultati sono mostrati nelle figure 3 e 4.
Nella tabella 4 che segue è mostrata la caratterizzazione chimica dei tre prodotti.
Tabella 4
Sono stati condotti saggi su cellule RAW264.7, che sono state trattate per 18h con due diverse concentrazioni di prodotto atomizzato e con menadione come controllo positivo. Dopo 18h è stata valutata la concentrazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Il trattamento non altera la vitalità delle cellule sane (figura 5) e non induce stress ossidativo (figura 6).
Ulteriormente le cellule RAW264.7 sono state pre-trattate per 18h con il prodotto atomizzato e successivamente con Menadione per 2h (induttore dello stress ossidativo). Dopo 20h è stata valutata la concentrazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS).
I dati hanno mostrato che il pre-trattamento con vescicole determina la riduzione della produzione di ROS causati da menadione (figura 7).
Ulteriormente le cellule RAW264.7 sono state pre-trattate per 18h con il prodotto atomizzato e successivamente con LPS (induttore della risposta infiammatoria). I dati di Real time PCR hanno mostrato che il pre-trattamento con vescicole determina la riduzione degli effetti pro-infiammatori causati da LPS, come dimostrato dalla riduzione dell'espressione genica delle citochine pro-infiammatorie IL6, TNF-a e IL1b e dall'up-regolazione di IL-10, citochina regolatoria antiinfiammatoria (figura 8).
Infine cellule mononucleate del sangue periferico PBMC isolate da pazienti con artrite reumatoide sono state trattate per 48 e 72h con il prodotto atomizzato. I dati di citofluorimetria hanno mostrato che il trattamento con le vescicole di limone porta all'espansione delle cellule Treg FOXP3 , ove Foxp3 è un fattore di trascrizione espresso dai linfociti T-reg che sono cellule specializzate nel sopprimere l'attivazione del sistema immunitario. Quindi è lecito concludere che i prodotti testati esercitano un effetto anti-infiammatorio. I dati sono mostrati in figura 9.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1) Procedimento per la preparazione di vescicole da succo di agrumi comprendente i seguenti stadi: a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione; b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione; c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione fino ad ottenere un succo limpido e un succo torbido (feed) caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi di partenza dello stadio a); d) Il succo torbido (feed) ottenuto nello stadio c) è sottoposto a microfiltrazione con cut-off 0,45 µm, oppure in alternativa a cromatografia per esclusione molecolare in cui la fase stazionaria ha particelle di dimensioni di 20-80 µm (dry), con un campo di frazionamento pari a 1-30kDa, fino ad ottenere un permeato/eluato che contiene le vescicole; in cui il permeato che si ottiene nello stadio d) è sottoposto a liofilizzazione fino ad ottenere un liofilizzato che contiene le vescicole oppure in alternativa è sottoposto ad atomizzazione (spray-drying) mediante addizione con maltodestrine per ottenere vescicole atomizzate.
  2. 2) Vescicole ottenute da succo di agrumi mediante il procedimento comprendente i seguenti stadi: a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione; b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione; c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione fino ad ottenere un succo limpido e un succo torbido (o feed) caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi si partenza dello stadio a); d) Il succo torbido (feed) ottenuto nello stadio c) è sottoposto a microfiltrazione con cut-off 0,45 µm fino ad ottenere un permeato che contiene le vescicole; in cui il permeato che si ottiene nello stadio d) è sottoposto a liofilizzazione fino ad ottenere un liofilizzato che contiene le vescicole oppure in alternativa è sottoposto ad atomizzazione (spray-drying) mediante addizione con maltodestrine per ottenere vescicole atomizzate.
  3. 3) Succo torbido (feed) che contiene le vescicole ottenuto mediante il procedimento comprendente i seguenti stadi: a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione; b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione, c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione; in cui il succo torbido (feed) è caratterizzato dal fatto di essere 10 volte concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi di partenza dello stadio a).
  4. 4) Permeato che contiene le vescicole ottenuto mediante il procedimento comprendente i seguenti stadi: a) Il succo spremuto da frutti di agrumi è sottoposto a pastorizzazione; b) Il succo pastorizzato come ottenuto nello stadio a) è sottoposto a centrifugazione; c) Il centrifugato ottenuto nello stadio b) è sottoposto a ultrafiltrazione fino ad ottenere un succo limpido e un succo torbido (feed) caratterizzato dal fatto di essere 10 volte più concentrato rispetto al succo spremuto da frutti di agrumi si partenza dello stadio a).; d) Il succo torbido (feed) ottenuto nello stadio c) è sottoposto a microfiltrazione con cut-off 0,45 µm fino ad ottenere un permeato che contiene le vescicole.
  5. 5) Vescicole secondo la rivendicazione 2 nella forma atomizzata, nella forma liofilizzata e nella forma di permeato.
  6. 6) Vescicole secondo la rivendicazione 2 per uso per ridurre lo stress ossidativo.
  7. 7) Vescicole secondo la rivendicazione 2 per uso per la prevenzione ed il trattamento delle patologie infiammatorie.
  8. 8) Impianto per svolgere il procedimento per la preparazione di vescicole da succo di agrumi della rivendicazione 1 comprendente: un ingresso per il succo in precedente pastorizzato e centrifugato, almeno due moduli filtranti ceramici posti in una conformazione a girasole (sunflower) in cui si svolgono in maniera sequenziale prima lo stadio di ultrafiltrazione e poi lo stadio di microfiltrazione e un sistema di refrigerazione in continuo per il mantenimento della temperatura dell’impianto e un sistema di uscita per il prodotto del procedimento.
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