CN106389180B - 一种银杏原花青素-多糖混合提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种银杏原花青素-多糖混合提取物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种银杏原花青素‑多糖混合提取物，该提取物中原花青素含量为40～60％，多糖含量为40～60％，原花青素和多糖总含量大于90％。本发明还提供制备上述提取物的制备方法，其包括下列内容：采用梯度乙醇水溶液提取、提取浓缩液加尿素二次提取、醇沉、沉淀分离多糖、醇沉液分离原花青素等步骤得到的提取物。本发明提供的银杏原花青素‑多糖混合提取物可作为用于抗氧化、抗辐射、美容抗衰老、癌症辅助治疗为目的的保健食品、药品或化妆品。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物的提取方法和提取物，具体涉及从银杏枝皮中提取原花青素和多糖的方法以及利用该方法获得的原花青素-多糖混合提取物及其应用。
背景技术
银杏被誉为“活化石”，药用银杏叶中含有大量的活性成分，包括内酯、黄酮、原花青素、有机酸、多糖等。其中，组成银杏原花青素的单体成分主要是没食子儿茶素和表没食子儿茶素，约占总量的85％。由于没食子儿茶素和表没食子儿茶素相对于儿茶素和表儿茶素多一个酚羟基，因此银杏原花青素的活性比葡萄籽原花青素的活性更强，这一观点在专利“含银杏原花青素提取物及其制备方法和应用”(申请号201110384337.3)中已经证实。因此，开发利用银杏原花青素对整个大健康产业和银杏产业的发展意义重大。
但在银杏叶中，原花青素含量随季节和天气变化差异较大，最低不足0.5％，最高可达10％，一般在正常采收期的银杏叶原花青素含量在0.5～2％。且银杏叶中含有大量黄酮类成分，因此从银杏叶中提取分离高纯度的原花青素代价大，得率低，专利“含银杏原花青素提取物及其制备方法和应用”(申请号201110384337.3)中，获得98％以上的原花青素提取物，得率不足0.2％。
在药用银杏叶种植过程中，会产生大量的废料，据估计每亩银杏树每年可以产生300～500kg废弃的银杏枝条，相当于约100～150kg枝皮。本发明人团队研究发现，枝皮中不含黄酮类成分，内酯成分含量不足0.1％，但含有丰富的原花青素和多糖成分，原花青素的含量为2％～8％，多糖的含量为4％～8％。因此从枝皮中开发原花青素不受黄酮类成分的干扰，纯化步骤简化，制备成本下降，更重要的是原料成本非常低廉，为废弃的枝皮。从枝皮中开发原花青素产品，可以充分利用银杏资源，变废为宝，为银杏产业增加了重大的附加经济价值。同时，本发明人团队还发现，原花青素和多糖一起具有协同增效的作用，等剂量下，混合物的活性大于单一成分的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从银杏枝皮中制备的富含原花青素和多糖的提取物，及其制备方法，还提供所制备的原花青素-多糖提取物在制备食品、保健食品或化妆品的应用。
其中，银杏原花青素-多糖提取物中含有40～60％(w/w)的原花青素，40～60％(w/w)的多糖，且原花青素和多糖的总含量大于90％(w/w)。
更进一步限定银杏原花青素-多糖提取物中原花青素含量为50％-58％，多糖含量为45％-55％，且原花青素和多糖总含量大于95％。
为实现上述发明目的，本发明以银杏枝皮为原料，具体制备方法包括如下步骤：
1)银杏枝皮粉碎后依次用乙醇溶液、水回流提取，合并后获得提取液原液，并回收提取液原液中的乙醇至无醇味，得提取浓缩液；
2)提取浓缩液中加入0.1g～1g/L尿素，加热回流0.5～6h，获得二次提取液；
3)二次提取液过滤，滤液用乙醇醇沉，醇沉的醇浓度为70％～90％，分别获得醇沉液和沉淀；
4)沉淀用0.5～10倍量50～100℃热水溶解，放冷，过滤，得多糖滤液；
5)醇沉液浓缩至无醇味，用大孔树脂吸附分离，用0～70％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得乙醇洗脱液；
6)将多糖滤液和乙醇洗脱液合并，干燥后即得银杏原花青素-多糖提取物产品。
本发明制备方法中：
步骤1)中，银杏枝皮粉碎至粒径0.5-2cm，先用6-20倍量的60％乙醇水溶液回流提取1.0～3.0h，提取1～3次；再用6-20倍量的水提取1.0～3.0h，提取1～3次，合并多次提取液，用减压浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为投料量的0.5～5倍量体积，得提取浓缩液。
步骤1)中提取最佳工艺优选为，银杏枝皮粉碎至粒径0.5-2cm，先用10倍量的60％乙醇水溶液回流提取2.0h，提取1次；再用10倍量的水提取2.0h，提取2次，合并多次提取液，用减压浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为投料量的1倍量体积，得提取浓缩液。
步骤2)中二次提取最佳工艺优选为，提取浓缩液中加入0.2g/L尿素，加热回流1.0h，获得二次提取液。
步骤3)中醇沉最佳醇浓度为80％。
步骤4)中沉淀溶解的最佳工艺优选为，沉淀用1倍量90℃热水溶解。
步骤5)中，醇沉液浓缩至无醇味，用AB-8、HPD-750、HPD-200A、HPD-100C、HPD-417、ADS-17大孔树脂吸附分离，用0～70％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得乙醇洗脱液。
本发明步骤5)中树脂分离的最佳工艺优选为，醇沉液浓缩至无醇味，用HPD-100C/ADS-17混合树脂(V/V＝1/1)进行吸附，依次用水和5％乙醇洗脱除杂，再用50％乙醇水溶液进行洗脱分离。
银杏原花青素和多糖具有协同增效作用，其抗辐射、抗氧化和抗癌活性好于单一的原花青素或多糖成分；本发明人发现，银杏原花青素-多糖混合提取物具有较好的抗辐射、抗氧化和抗癌活性；尤其是当原花青素与多糖的重量比例为1：1时，抗辐射、抗氧化和抗癌活性最佳。因此，本发明制备的原花青素-多糖混合提取物，可作为制备用于抗辐射、抗氧化、美容养颜的食品、保健食品和化妆品，也可作为制备用于对抗各种因过氧化造成的机体器官损伤的食品和保健食品，还可作为制备用于辅助抗肿瘤的食品和保健食品。
本发明以银杏枝皮为原料，用梯度乙醇水溶液进行提取，再通过加尿素的二次提取，大大增加了原花青素的转移率，之后通过醇沉，将原花青素和多糖分离开来，单独纯化，最终合并纯化溶液，以获得高含量原花青素和多糖的提取物。本发明取得以下有益效果：
1.本发明提供了一种原花青素-多糖混合提取物，含有40～60％(w/w)的原花青素，40～60％(w/w)的多糖，原花青素和多糖的总含量大于90％(w/w)，更进一步限定银杏原花青素-多糖提取物中原花青素含量为50％-58％，多糖含量为45％-55％，且原花青素和多糖总含量大于5％。银杏原花青素和多糖具有协同增效作用，其抗辐射、抗氧化和抗癌活性好于单一的原花青素或多糖成分；当原花青素与多糖的重量比例为1：1时，抗辐射、抗氧化和抗癌活性最佳。
2.本发明提供的提取物是以银杏枝皮为原料，充分利用了银杏资源，变废为宝，为银杏原花青素和多糖提供了又一重要的来源，为银杏产业增加了重大的附加经济价值。
3.本发明中用乙醇溶液、水多次提取银杏枝皮中的原花青素和多糖，可最大限度的将原花青素提取出来，也可最大限度的提取出多糖成分，整个提取效率远远大于等度乙醇水溶液的提取效率。
4.本发明中的提取浓缩液，加入尿素进行二次提取，可以有效的提高原花青素的转移率，去除蛋白质等水溶性杂质。
5.本发明的工艺路线包括回流提取、醇沉、过柱，对仪器设备的要求低、成本低，适合工业化生产。
6.本发明提取制备方法除乙醇外，未再次引入有机溶剂，有利于后续三废的处理。
7.本发明制备方法制备的原花青素-多糖混合提取物相对于单一原花青素成分或单一多糖成分，抗辐射、抗氧化和抗癌活性更强，可用于保健食品、食品和化妆品的制备。
附图说明：
图1为枝皮原花青素的HPLC色谱图，其中7.8min的峰是单体峰，14.4和15.7min的峰是两个二聚体峰，17.9、19.0和20.1min的峰是三个三聚体峰。
图2为银杏叶原花青素的HPLC色谱图，其中8.0min的峰是单体峰，14.5和15.8min的峰是两个二聚体峰，18.0、19.1和20.1min的峰是三个三聚体峰。
图3为葡萄籽原花青素的HPLC色谱图，其中7.2min的峰是单体峰，13.7min的峰是二聚体峰，17.3min的峰是三聚体峰。
具体实施方式
下面的实施例，用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅限于此。实施例中取值为本发明所述范围的任一具体数值，均为可实施。
以下实施例中所用的银杏枝皮原料中原花青素含量4.5％，多糖含量5.6％。
实施例1：提取溶剂的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮5份，依次进行如下处理后，测定提取液中原花青素和多糖的转移率；
A、用10倍量的水回流提取3次，每次2h；
B、用10倍量的40％乙醇回流提取1次，2h，再用10倍量的水回流提取2次，每次2h；
C、用10倍量的60％乙醇回流提取1次，2h，再用10倍量的水回流提取2次，每次2h；
D、用10倍量的80％乙醇回流提取1次，2h，再用10倍量的水回流提取2次，每次2h；
E、用10倍量的60％乙醇回流提取3次，每次2h；
表1提取溶剂的筛选
| 提取溶剂 | 提取物得率(％) | 原花青素转移率(％) | 多糖转移率(％) |
| A | 17.5 | 51.6 | 88.7 |
| B | 19.8 | 69.5 | 88.8 |
| C | 22.4 | 98.6 | 88.9 |
| D | 19.2 | 42.6 | 85.1 |
| E | 19.7 | 98.4 | 31.5 |
表1结果得，银杏枝皮依次用60％乙醇、水、水提取三次，原花青素和多糖转移率最高。
实施例2：提取溶剂料液比的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮4份，用60％乙醇提取1次，再用水提取2次，每次提取时间均为2h，溶剂量分别为6倍量、10倍量、15倍量、20倍量，测定提取液中原花青素和多糖的转移率。
表2提取溶剂料液比的筛选
| 提取溶剂料液比 | 提取物得率(％) | 原花青素转移率(％) | 多糖转移率(％) |
| 6 | 20.0 | 81.4 | 63.6 |
| 10 | 22.7 | 95.3 | 89.9 |
| 15 | 22.9 | 97.2 | 91.3 |
| 20 | 23.1 | 97.8 | 91.7 |
表2结果说明，提取溶剂料液比为10倍量、15倍量、20倍量时，原花青素和多糖转移率均基本相同，且大于6倍量，因此选择提取溶剂料液比10倍量。
实施例3：提取时间的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮3份，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，第一份样本3次提取时间均为1h，第二份样本3次提取时间均为2h，第三份样本3次提取时间均为3h，测定提取液中原花青素和多糖的转移率。
表3提取时间的筛选
| 提取时间(h) | 提取物得率(％) | 原花青素转移率(％) | 多糖转移率(％) |
| 1 | 21.1 | 88.7 | 75.2 |
| 2 | 22.8 | 95.6 | 89.8 |
| 3 | 22.8 | 95.9 | 90.2 |
表3结果说明，提取时间为2h和3h时，原花青素和多糖转移率均基本相同，且大于1h，因此选择提取时间为2h。
实施例4：提取液浓缩体积的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮4份，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积50ml、100ml、200ml、500ml，加入1g/L尿素，加热回流2h，过滤，测定滤液中原花青素和多糖的转移率。
表4提取液浓缩体积的筛选
| 提取液浓缩体积 | 提取物得率(％) | 原花青素转移率(％) | 多糖转移率(％) |
| 0.5倍量(50ml) | 16.4 | 83.2 | 85.5 |
| 1倍量(100ml) | 17.5 | 90.8 | 88.7 |
| 2倍量(200ml) | 17.8 | 91.1 | 89.3 |
| 5倍量(500ml) | 18.2 | 91.4 | 89.8 |
表4结果说明，提取液浓缩体积为1～5倍量时，原花青素和多糖转移率均基本相同，且大于0.5倍量，因此提取液浓缩体积为1倍量。
实施例5：尿素加入量的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮5份，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积100ml，分别加入0、0.1、0.2、0.5、1.0g/L尿素，加热回流2h，过滤，测定滤液中原花青素和多糖的转移率。
表5尿素加入量的筛选
| 尿素加入量(g/L) | 提取物得率(％) | 原花青素转移率(％) | 多糖转移率(％) |
| 0 | 14.9 | 57.6 | 85.1 |
| 0.1 | 16.2 | 80.4 | 87.5 |
| 0.2 | 17.3 | 90.2 | 88.2 |
| 0.5 | 17.3 | 90.8 | 88.1 |
| 1.0 | 17.4 | 90.8 | 88.5 |
表5结果说明，不加尿素，原花青素转移率不足60％，尿素加入量在0.2～1.0g/L时，原花青素和多糖转移率均基本相同，因此尿素加入量为0.2g/L。
实施例6：二次提取时间的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮4份，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积100ml，加入0.2g/L尿素，分别加热回流0.5h、1h、2h、6h，过滤，测定滤液中原花青素和多糖的转移率。
表6二次提取时间的筛选
| 提取时间(h) | 提取物得率(％) | 原花青素转移率(％) | 多糖转移率(％) |
| 0.5 | 15.8 | 81.2 | 86.9 |
| 1 | 17.2 | 89.7 | 88.4 |
| 2 | 17.4 | 90.4 | 88.5 |
| 6 | 17.3 | 90.2 | 88.3 |
表6结果说明，二次提取时间在1～6h时，原花青素和多糖转移率均基本相同，因此二次提取时间为1h。
实施例7：乙醇醇沉浓度的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮5份，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积100ml，加入0.2g/L尿素，加热回流，过滤，滤液加乙醇醇沉，通过加入乙醇的用量控制醇浓度，醇沉后的醇浓度分别为70％、75％、80％、85％、90％，过滤，测定沉淀中多糖的转移率和含量。
表7乙醇醇沉浓度的筛选
| 乙醇醇沉浓度(％) | 提取物得率(％) | 多糖含量(％) | 多糖转移率(％) |
| 70 | 4.86 | 86.7 | 75.2 |
| 75 | 5.12 | 87.6 | 80.1 |
| 80 | 5.43 | 88.1 | 85.4 |
| 85 | 5.59 | 86.5 | 86.3 |
| 90 | 5.70 | 86.3 | 87.8 |
表7结果说明，80％～90％醇沉浓度所得提取物中多糖含量和转移率相差不多，考虑到实际生产中，80％醇沉浓度所用乙醇量最少，成本最低，因此醇沉浓度选择80％。
实施例8：溶解沉淀用水量的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮5份，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积100ml，加入0.2g/L尿素，加热回流，过滤，滤液用乙醇醇沉，醇沉后的醇浓度为80％，过滤，沉淀再分别用0.5倍量、1倍量、2倍量、5倍量、10倍量的100℃热水溶解，放冷，过滤，测定滤液中多糖的转移率和含量。
表8溶解沉淀用水量的筛选
| 溶解沉淀用水量 | 提取物得率(％) | 多糖含量(％) | 多糖转移率(％) |
| 0.5倍量 | 4.77 | 94.2 | 80.2 |
| 1倍量 | 4.93 | 96.7 | 85.1 |
| 2倍量 | 4.97 | 96.5 | 85.6 |
| 5倍量 | 4.99 | 96.2 | 85.8 |
| 10倍量 | 5.01 | 95.9 | 85.8 |
表8结果说明，溶解沉淀用水量在1～10倍量时，多糖转移率和含量均基本相同，因此溶解沉淀用水量为1倍量。
实施例9：溶解沉淀用水温度的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮4份，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积100ml，加入0.2g/L尿素，加热回流，过滤，滤液用乙醇醇沉，醇沉后的醇浓度为80％，过滤，沉淀再分别用1倍量的50℃、70℃、90℃、100℃热水溶解，放冷，过滤，测定滤液中多糖的转移率和含量。
表9溶解沉淀用水温度的筛选
| 水温(℃) | 提取物得率(％) | 多糖含量(％) | 多糖转移率(％) |
| 50 | 4.53 | 94.2 | 76.2 |
| 70 | 4.74 | 94.7 | 80.1 |
| 90 | 4.98 | 96.1 | 85.4 |
| 100 | 4.98 | 96.3 | 85.6 |
表9结果说明，溶解沉淀用水温在90～100℃时，多糖转移率和含量均基本相同，因此溶解沉淀用水温为90℃。
实施例10：吸附树脂的筛选
取120g粉碎后银杏枝皮，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积120ml，加入0.2g/L尿素，加热回流，过滤，滤液用乙醇醇沉，醇沉后的醇浓度为80％，过滤，醇沉滤液浓缩至无醇味，平均分成6份，分别用20mlAB-8、HPD-750、HPD-200A、HPD-100C、HPD-417、ADS-17大孔树脂吸附分离，水洗后，用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部位，测定原花青素转移率和含量。
表10吸附树脂的筛选
| 树脂型号 | 提取物得率(％) | 原花青素含量(％) | 原花青素转移率(％) |
| AB-8 | 5.24 | 75.2 | 87.6 |
| HPD-750 | 5.55 | 70.9 | 87.4 |
| HPD-200A | 5.16 | 74.3 | 85.2 |
| HPD-100C | 4.56 | 85.2 | 86.3 |
| HPD-417 | 4.21 | 86.1 | 80.5 |
| ADS-17 | 3.90 | 93.1 | 80.7 |
表10结果说明，提取物原花青素含量最高需选择ADS-17树脂，转移率则是AB-8、HPD750、HPD200A和HPD-100C树脂差不多，但HPD-100C相对原花青素的含量更高，因此，结合ADS-17树脂高含量的优势和HPD-100C高转移率的优势，对两者组合比例再进行研究。
实施例11：混合树脂比例的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积100ml，加入0.2g/L尿素，加热回流，过滤，滤液用乙醇醇沉，醇沉后的醇浓度为80％，过滤，醇沉滤液浓缩至无醇味，平均分成5份，分别用不同比例的HPD-100C和ADS-17大孔树脂吸附分离(见表13)，水洗后，用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部位，测定原花青素转移率和含量。
表11混合树脂比例的筛选
表11结果说明，相对来说，HPD-100C和ADS-17大孔树脂比例为1：1时，效果最好。
实施例12：洗脱溶剂的筛选
取100g粉碎后银杏枝皮，用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积100ml，加入0.2g/L尿素，加热回流，过滤，滤液用乙醇醇沉，醇沉后的醇浓度为80％，过滤，醇沉滤液浓缩至无醇味，用HPD-100C/ADS-17(1：1)混合树脂吸附分离，分别用水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇洗脱，收集各洗脱部位，测定原花青素转移率和含量。
表12洗脱溶剂的筛选
| 洗脱部位 | 提取物得率(％) | 原花青素含量(％) | 原花青素转移率(％) |
| 水 | 7.63 | 0.3 | 0.5 |
| 5％乙醇 | 0.24 | 22.5 | 1.2 |
| 10％乙醇 | 0.23 | 93.9 | 4.8 |
| 20％乙醇 | 0.81 | 96.1 | 17.3 |
| 30％乙醇 | 1.21 | 95.6 | 25.7 |
| 50％乙醇 | 1.69 | 95.9 | 36 |
| 70％乙醇 | 0.19 | 4.7 | 0.2 |
表12结果说明，药液用混合树脂吸附用，先用水洗除杂，再用5％乙醇除杂，最后用50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱部位即得原花青素溶液。
实施例13：制备工艺验证
取1kg粉碎后银杏枝皮6批，分别用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积1000ml，加入0.2g/L尿素，加热回流，过滤：滤液用乙醇醇沉，醇沉后的醇浓度为80％，过滤，醇沉滤液浓缩至无醇味，用HPD-100C/ADS-17(1：1)混合树脂吸附分离，先用水洗除杂，再用5％乙醇除杂，最后用50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱部位；沉淀用1L90℃热水溶解，放冷，过滤，收集滤液；合并滤液和50％乙醇洗脱部位，减压干燥得原花青素-多糖提取物。
表13制备工艺验证
实施例14：枝皮原花青素和银杏叶原花青素的比较
检测方法参见文献“银杏叶制剂中原花青素的HPLC鉴别方法研究”(中草药，2013，44(13)：1774-1778.)。
色谱条件：固定相为phenomenex二元醇柱(250×4.6mm，5μm)；流动相为(A)乙腈，(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V)；流动相梯度为0～10min：0～12％B；10～10.01min：12～15％B；10.01～30min：15～45％B；30～35min：45％B；35～40min：45～0％B；流速为1.0ml/min；荧光激发波长276nm；发射波长316nm；进样量为20μL。
结果见图1～3，枝皮原花青素和银杏叶原花青素的图谱基本一致，说明两者组成基本一致，主要由没食子儿茶素和表没食子儿茶素组成，与葡萄籽原花青素的组成(儿茶素和表儿茶素)有较大差异。
实施例15：活性实验样本制备
取1kg粉碎后银杏枝皮，分别用10倍量60％乙醇提取1次，再用10倍量水提取2次，每次2h，合并所有提取液，浓缩至剩余体积1000ml，加入0.2g/L尿素，加热回流，过滤：滤液用乙醇醇沉，醇沉后的醇浓度为80％，过滤，醇沉滤液浓缩至无醇味，用HPD-100C/ADS-17(1：1)混合树脂吸附分离，先用水洗除杂，再用5％乙醇除杂，最后用50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱部位；沉淀用1L90℃热水溶解，放冷，过滤，收集滤液，为多糖溶液；按比例合并多糖溶液和50％乙醇洗脱部位，减压干燥得不同配比的原花青素-多糖提取物。
样本1含银杏原花青素95.3％，不含多糖；
样本2含银杏原花青素70.6％，含银杏多糖23.7％(两者重量比例约为3：1)
样本3含银杏原花青素56.6％，含银杏多糖39.5％(两者重量比例约为1.5：1)
样本4含银杏原花青素48.8％，含银杏多糖48.5％(两者重量比例约为1：1)
样本5含银杏原花青素39.2％，含银杏多糖56.3％(两者重量比例约为1：1.5)
样本6含银杏原花青素24.4％，含银杏多糖70.5％(两者重量比例约为1：3)
样本7含银杏多糖93.8％，不含原花青素；
样本8含葡萄籽原花青素48.5％，含银杏多糖47.6％(两者重量比例约为1：1)
样本9含葡萄籽原花青素98.7％，不含多糖。
实施例16活性实验样本的抗氧化作用评价
培养大鼠原代主动脉血管内皮细胞、心肌细胞、视网膜细胞及脑神经细胞，将生长状态良好的细胞种植入96孔板中，待细胞密度达8成后，弃去培养基，换用含200umol/LH2O2培养基100ml，及100ml含药培养基。阴性对照加入200ml普通培养基。培养24h后，MTT法测定细胞存活率，并计算半数有效量(ED50)。
表14结果说明银杏原花青素和银杏多糖具有协同增效作用，两者重量比例在1：1时，抗氧化效果最佳；银杏原花青素的抗氧化活性比葡萄籽原花青素更强。
表14活性实验样本的抗氧化作用评价
实施例17活性实验样本的抗辐射作用评价
雌性ICR小鼠随机分为11组，模型组、正常组、样本1～9组，模型组和假手术组给予相同体积的蒸馏水。除正常组外，其余各组均剃去背部的毛，每日用UVA灯管照射，共持续8周，造成小鼠光老化模型。8周后，处死动物，取下背部脱毛处的全层皮肤，测定SOD活性及HYP含量。
表15活性实验样本的抗辐射作用评价
表15结果说明银杏原花青素和银杏多糖具有协同增效作用，两者重量比例在1：1时，抗辐射效果最佳；银杏原花青素的抗辐射活性比葡萄籽原花青素更强。
实施例18活性实验样本的抗肿瘤作用评价
常规复苏人前列腺癌PC3、口腔上皮细胞癌KB和胰腺癌PANC-1细胞株，将生长状态良好的细胞种植入96孔板中，在体积分数5％CO2，37℃，饱和湿度下培养细胞24h，然后将不同浓度样本溶液加入实验组的相应孔中。加药后放入培养箱共孵育72小时后，MTT法测定细胞存活率，并计算半数抑制量(IC50)。
表16活性实验样本的抗肿瘤作用评价
表16结果说明银杏原花青素和银杏多糖具有协同增效作用，两者重量比例在1：1时，抗肿瘤效果最佳；银杏原花青素的抗肿瘤活性比葡萄籽原花青素更强。
Claims (10)
1.一种银杏原花青素-多糖混合提取物，其特征在于，提取物原料为银杏枝皮，提取物中原花青素含量为40～60％，多糖含量为40～60％，且原花青素和多糖总含量大于90％。
2.根据权利要求1所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物，其特征在于，所述提取物中原花青素含量为50％-58％，多糖含量为45％-55％，且原花青素和多糖总含量大于95％。
3.权利要求2所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)银杏枝皮粉碎后用梯度乙醇水溶液回流提取，合并后获得提取液原液，并回收提取液原液中的乙醇至无醇味，得提取浓缩液；
2)提取浓缩液中加入0.1g～1g/L尿素，加热回流0.5～6h，获得二次提取液；
3)二次提取液过滤，滤液用乙醇醇沉，醇沉后的醇浓度为70％～90％，分别获得醇沉液和沉淀；
4)沉淀用0.5～10倍量50～100℃热水溶解，放冷，过滤，得多糖滤液；
5)醇沉液浓缩至无醇味，用大孔树脂吸附分离，用0～70％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得乙醇洗脱液；其中，大孔树脂选自AB-8、HPD-750、HPD-200A、HPD-100C、HPD417、ADS-17这类中的一种或两种；
6)将多糖滤液和乙醇洗脱液合并，干燥后即得银杏原花青素-多糖提取物产品。
4.根据权利要求3所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物的制备方法，其特征是步骤1)银杏枝皮粉碎至粒径0.5-2cm，先用6-20倍量的60％乙醇水溶液回流提取1.0～3.0h，提取1～3次；再用6-20倍量的水提取1.0～3.0h，提取1～3次，合并多次提取液，用减压浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积为投料量的0.5～5倍量体积，得提取浓缩液。
5.根据权利要求3或4所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物的制备方法，其特征是步骤1)银杏枝皮粉碎至粒径0.5-2cm，先用10倍量的60％乙醇水溶液回流提取2.0h，提取1次；再用10倍量的水提取2.0h，提取2次，合并多次提取液，用减压浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积为投料量的1倍量体积，得提取浓缩液。
6.根据权利要求3所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物的制备方法，其特征是步骤2)提取浓缩液中加入0.2g/L尿素，加热回流1h，获得二次提取液。
7.根据权利要求3所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物的制备方法，其特征是步骤3)中醇沉最佳醇浓度为80％。
8.根据权利要求3所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物的制备方法，其特征是步骤4)沉淀用1倍量90℃热水溶解，放冷，过滤，得多糖滤液。
9.根据权利要求8所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物的制备方法，其特征是步骤5)分离用大孔树脂为HPD-100C/ADS-17混合树脂，体积比为V/V＝1/1。
10.根据权利要求3或9所述的一种银杏原花青素-多糖混合提取物的制备方法，其特征是步骤5)梯度洗脱方法为依次用水和5％乙醇洗脱除杂，再用50％乙醇水溶液进行洗脱分离。
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