DE102004051667A1

DE102004051667A1 - Verfahren zur Herstellung von xylanasereichen Enzymkomplexen

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Publication number: DE102004051667A1
Application number: DE200410051667
Authority: DE
Inventors: Manfred Prof. Dr. Ringpfeil; Matthias Dr.-Ing. Gerhardt; Monika Dr. Wolf; Cornelia Heine
Original assignee: Biopract GmbH
Current assignee: Biopract GmbH
Priority date: 2004-10-22
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2006-04-27

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von xylanasereichen Enzymkomplexen, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation von Trichoderma Hochleistungsstämmen bei pH-Werten zwischen 5,0 und 6,0 erfolgt. Das batch-Medium der Fermentation weist einen hohen Anteil an Stickstoff bezogen auf den Kohlenstoff auf. Es sind im batch-Nährmedium 25-40 Masse-% Stickstoff vorhanden, die durch die Verwendung geeigneter anorganischer und organischer Stickstoffquellen realisiert werden. Der Fermentation wird mittels fed-batch-Technik bei Verwendung proteinreicher Hemicellulosen als Induktoren für die Xylanasen durchgeführt. Durch den Einsatz kostengünstiger Substrate/Induktoren werden hohe Raum-Zeit-Ausbeuten an Xylanase- und Cellulase-Aktivität erreicht, wodurch eine hohe Ausnutzung der Fermentationskapazität gewährleistet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von xylanasereichen Enzymkomplexen durch Fermentation von Stämmen der Gattung Trichoderma im aeroben Submersverfahren. Anwendungsgebiete der mikrobiell erzeugten xylanolytischen und cellulolytischen Enzympräparate sind die Lebensmittelindustrie vor allem die Brauerei, Brennerei, Bäckerei und Saftherstellung. Weiterhin finden polysaccharidspaltende Enzympräparate Anwendung als Hilfsmittel in der Umwelttechnik, Futtermittel- und Textilindustrie.
Es ist bekannt, das Pilze der Gattung Trichoderma unter induzierenden Bedingungen einen extracellulären Enzymkomplex zum Abbau von Cellulosen und Hemicellulosen bilden, wobei die Hauptaktivität cellulolytisch ist. Der cellulolytische Enzymkomplex besteht hauptsächlich aus endo-Glucanasen, exo-Glucanasen und β-Glucosidase. Diese Enzyme bewirken den vollständigen Abbau der Cellulose. Die cellulolytische Aktivität eines Enzymkomplexes wird in der Regel durch die Messung der Aktivität gegen Filterpapier bestimmt (Pure & Appl. Chem., 1987). Für die Kultivierung von Trichoderma reesei wurden bereits Filterpapieraktivitätseinheiten von 30 U/ml beschrieben ( DE 197 35 650 ). Nach diesem Verfahren findet die Fermentation bei einem pH-Wert von 4,5 statt und das C:N-Verhältnis im batch-Nährmedium beträgt 100 : 20.
Neben diesen Hauptaktivitäten liegen im Enzymkomplex von Trichoderma reesei in der Regel auch Nebenaktivitäten vor. Hierzu zählen Xylanasen, Mannanasen, Amylasen und Proteasen. Zur Veränderung dieses Aktivitätsspektrums insbesondere der Erhöhung der xylananolytischen Aktivität wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt. Um die Xylanasebildung zu induzieren, wurden bisher dem Nährmedium verschiedenartige xylanhaltige Substanzen wie Gerstenspelzen, Maiskolben, Stroh und Kornbrennereischlempe als Induktoren zugesetzt.
Nachteilig für die Verwendung des extrazellulären Enzymkomplexes von Trichoderma reesei in der Lebensmittelindustrie, Umwelttechnik bzw. Futtermittel- und Textilindustrie ist seine zu geringe xylanolytische Aktivität. Nach einem bisher bekannten Verfahren ( DE 197 35 650 ) beträgt das Verhältnis Carboxymethylcellulase (CMCase) : β-Glucanase : Xylanase 1 : 2 : 0,5.
Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der xylanolytischen Aktivität von Trichoderma reesei-Kulturen im Bioreaktor bei unverändert hoher oder leicht reduzierter cellulolytischer Aktivität. Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, durch Änderung verfahrenstechnischer Parameter, Verwendung geeigneter Induktoren sowie durch gentechnisches Verändern von Trichoderma reesei-Stämmen die xylanolytische Aktivität der extrazellulären Enzymkomplexe von Trichoderma reesei deutlich zu erhöhen.
Die Erfindung wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. Der Kerngedanke der Erfindung besteht in der Fermentation von Trichoderma reesei-Stämmen bei einen pH-Wert von 5,0–6,0 bei Verwendung von proteinreichen Hemicellulosen als Induktor und eines batch-Nährmediums mit einem C:N-Verhältnis von 100:25 bis 100:40, wobei der Stickstoff als Kombination von organischen Stickstoffquellen mit Ammoniumsalzen im Medium vorliegt.
Gemäß der Erfindung werden durch die Verwendung von Induktoren und durch den Einsatz der Hochleistungsstämme Trichoderma reesei DSM 16613 (rekombinanter Stamm) bzw. DSM 10683 im aeroben Submersverfahren Xylanasen und Cellulasen hergestellt. Die Fermentation der Pilze findet bei einem pH-Wert zwischen 5,0 und 6,0 statt, vorzugsweise bei pH 5,5. Dies bedeutet gegenüber dem bekannten Stand der Technik ( DE 197 35 650 ) eine Erhöhung des pH-Wertes, was vollkommen überraschend zu einer gesteigerten Xylanase-Aktivität führt.
Als Induktoren für die Bildung xylanasereicher Enzymkomplexe werden proteinreiche Hemicellulaseinduktoren vorzugsweise entöltes Sojaschrot bzw. lösliches Maisprotein (Maisquellwasser) verwendet. Wenn man das Verfahren so führen möchte, dass die cellulolytische Aktivität im Vergleich zum Verfahren DE 197 35 650 nahezu unverändert ist, können Cellulaseinduktoren wie cellulosehaltige Rohstoffe, vorzugsweise mikrokristalline Cellulose bzw. Maisschalen (die cellulosehaltige Fraktion der Maisverarbeitung) eingesetzt werden.
Als Voraussetzung für die Verschiebung des Enzymprofils wird erfindungsgemäß das C:N-Verhältnis als 100:25 bis 40 beschrieben. Im Vergleich dazu beträgt im Verfahren DE 197 35 650 das C:N-Verhältnis 100:20.
Erfindungsgemäß gibt es drei Ausführungsvarianten.
In der ersten Variante wird dem batch-Nährmedium nur ein Hemicellulase/Cellulaseinduktor, vorzugsweise 15–60 g/l Sojaschrot, zugesetzt. Besonders bevorzugt wird hierbei ein Bereich von 15–30 g/l Sojaschrot. Das Verhältnis zwischen Kohlenstoff und Stickstoff wird durch entsprechende Verringerung der anorganischen Stickstoffquelle eingestellt. Das C:N-Verhältnis im batch-Nährmedium beträgt erfindungsgemäß mindestens 100:25 und maximal 100:40 (siehe Beispiele 2 und 3).
Gemäß der zweiten Ausführungsvariante wird dem batch-Nährmedium lösliches Maisprotein als Stickstoffquelle in Kombination mit einem Hemicellulase/Cellulaseinduktor (Maisschalen) zugesetzt. Hierbei werden sowohl das lösliche Maisprotein als auch die Maisschalen in Konzentrationen von 2–10 g/l, vorzugsweise 5 g/l eingesetzt (siehe Beispiel 4).
In der dritten Ausführungsvariante wird der Hemicellulaseinduktor, vorzugsweise Sojaschrot, in einer Konzentration von 10–30 g/l und der Cellulaseinduktor, vorzugsweise mikrokristalline Cellulose, in einer Konzentration von 5–15 g/l zum batch-Nährmedium gegeben. Dabei liegen die bevorzugten Konzentrationen bei 20 g/l Sojaschrot und 10 g/l mikrokristalliner Cellulose (siehe Beispiel 1).
Bei den Ausführungsvarianten 1 und 3 wird mittels fed-batch-Technik dem Nährmedium Lactose und Sojaschrot portionsweise zugeführt, so dass im Fermentor Endkonzentrationen von 1–2 g/l Lactose und 100–200 mg/l Sojaschrot vorliegen. Dabei sind die bevorzugten Konzentrationen 1,5 g/l Lactose und 170 mg/l Sojaschrot.
Bei der zweiten Variante werden anstatt Sojaschrot lösliches Maisprotein und die cellulosehaltige Fraktion der Maisschalen verwendet, so dass Endkonzentrationen beider Substanzen im Fermenter von 50–100 mg/l, vorzugsweise 70 mg/l entstehen.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren weiter erläutert. Es dient der Produktion des Xylanase-Cellulose-Enzymkomplexes und ist durch die fed-batch-Fermentation in einem Bioreaktor gekennzeichnet. In der batch-Fermentation wird der Pilzkultur ein Nährmedium vorgelegt, das vor allem der Vermehrung des enzymproduzierenden Mikroorganismus dient. In der anschließenden fed-batch-Phase wird der Kultur portionsweise Substrat, welches die Induktoren enthält, zugeführt. Im zweiten Abschnitt der Fermentation erfolgt die Bildung der Enzyme, wobei das Biomassewachstum begrenzt wird.
Als C-Quelle dient vorzugsweise Lactose und als N-Quelle neben den beiden Induktoren Sojaschrot und löslichem Maisprotein auch Ammoniumsulfat und Ammoniakwasser, als P-Quelle werden Kaliumdihydrogenphosphat sowie weitere Salze und Spurenelemente eingesetzt. Dem Nährmedium können weiterhin Antischaummittel und Detergenzien zugesetzt werden.
Das Nährmedium besteht aus 10–15 g/l Lactose, 10–15 g/l Cellulose und 15–30 g/l Sojaschrot oder 5–10 g/l Maisprotein und 5–10 g/l Maisschalen. Der Stickstoffanteil, bezogen auf den vorhandenen Kohlenstoff, beträgt erfindungsgemäß 25–40 Masse% und der Phosphoranteil mindestens 10–20 Masse% im batch-Nährmedium.
Die Substratlösung besteht aus 250–350 g/l Lactose, 30–50 g/l Sojaschrot oder 15–20 g/l lösliches Maisprotein und 15–20 g/l Maisschalen sowie 1 g/l Antischaummittel. Am Ende der fed-batch-Fermentation werden durch das Nährmedium 15–20 Masse% Stickstoff, bezogen auf den Kohlenstoff, vorgelegt. Der Anteil an Phosphor beträgt mindestens 1–2 Masse%.
Der pH-Wert für das Verfahren zur Produktion xylanasereicher Enzympräparate liegt bei 5,5 und wird durch die Dosierung von 12,5%igem Ammoniakwasser konstant gehalten.
Bei den aus der Maisverarbeitung stammenden Rohstoffen lösliches Maisprotein und Maisschalen handelt es sich um komplexe Substrate, die als Rückstände bei der Maisverarbeitung anfallen. Das lösliche Maisprotein enthält ca. 45% Protein sowie in geringeren Mengen Milchsäure, Salze und Vitamine. Im Gegensatz dazu enthält die cellulosehaltige Maisschalenfraktion (Maisschalen) nur 7–10% Protein und 20–25% Hemicellulosen, sowie geringe Anteile Fette.
Die Temperatur für die Kultivierung im Bioreaktor liegt bevorzugt im Bereich zwischen 26°C und 31°C. Die Kultivierungstemperatur in der batch-Phase beträgt 31°C und wird in der fed-batch-Phase auf 28°C reduziert.
Zur Inokulation des Nährmediums wird eine Vorkultur verwendet, deren Volumen 10% des Gesamtvolumens entspricht.
Die xylananolytische und cellulolytische Aktivitätsbestimmung des Enzymkomplexes erfolgt nach der von König et al. (2002) beschriebenen Methode. Die cellulolytische Aktivität gegen Filterpapier wird nach der in Pure & Appl. Chem. (1987) beschriebenen Methode bestimmt.
Zur Induktion der Xylanasebildung wird dem Kultivierungsmedium entöltes Sojaschrot allein oder in Kombination mit löslichem Maisprotein eingesetzt. Zur Induktion der Cellulasebildung werden dem Nährmedium mikrokristalline Cellulose oder Maisschalen zugesetzt.
Variante 1:
Der Stickstoffanteil aus Sojaschrot und Ammoniumsalzen beträgt im batch-Medium 30 bis 40 Masse% bezogen auf den Kohlenstoff (100%). Mikrokristalline Cellulose wird nicht eingesetzt. Durch den erhöhten N-Gehalt in Kombination mit einem pH-Wert von 5,5 und bei den unten aufgeführten Induktorkonzentrationen wird die Bildung der Xylanase gesteigert und ein Ertrag von 16 bis 25 FPU/ml Cellulase erreicht.
Sehr hohe Konzentrationen an Sojaschrot im batch-Medium von 30 g/l und von 40 g/l in der Substratlösung verändern das C:N-Verhältnis zugunsten der N-Quelle. Das C:N-Verhältnis im batch-Nährmedium beträgt 100:39.
Bei 15 g/l Sojaschrot im batch-Medium und 40 g/l Sojaschrot im feed-Medium wird das C:N-Verhältnis im batch-Medium durch gleichzeitige Verringerung der Konzentration der anorganischen Stickstoffquelle auf einen Wert von 100:34 eingestellt. Damit wird ein optimales Pilzwachstum bei gleichzeitig intensiver Produktbildung ermöglicht. Die Erhöhung der Xylanasebildung wird durch den hohen Gehalt des Sojaschrots in der feed-Substratlösung forciert.
Variante 2:
Der Stickstoffanteil aus löslichem Maisprotein, Maisschalen und Ammoniumsalzen beträgt im batch- Medium 30 bis 40 Masse% bezogen auf den Kohlenstoff (100%). Mikrokristalline Cellulose wird nicht eingesetzt. Als Cellulaseinduktor dienen Maisschalen. Durch den erhöhten N-Gehalt in Kombination mit einem pH-Wert von 5,5 und bei den unten aufgeführten Induktorkonzentrationen wird die Bildung der Xylanase gesteigert und ein Ertrag von mindestens 20 FPU/ml Cellulase gewährleistet.
Im batch-Medium können 5 g/l lösliches Maisprotein und 5 g/l Maisschalen sowie 16 g/l lösliches Maisprotein und 16 g/l Maisschalen im feed-Medium eingesetzt werden. Der Einsatz des löslichen Maisproteins begünstigt das Wachstum der Pilzkultur, da neben Proteinen auch verschiedene Vitamine und Salze vorhanden sind. Die Bildung der Xylanasen wird durch das zugunsten des Stickstoffs verschobene C:N-Verhältnis erhöht. Das C:N-Verhältnis beträgt im batch-Nährmedium 100:33. Die in den Maisschalen vorhandenen Hemicellulosen wirken induzierend auf die Xylanasebildung und die Cellulasebildung.
Variante 3:
Der Stickstoffanteil aus Sojaschrot und Ammoniumsalzen beträgt im batch- Medium 25 bis 29 Masse% bezogen auf den Kohlenstoff (100%). Mikrokristalline Cellulose wird zusätzlich eingesetzt und dient als Cellulaseinduktor. Durch den erhöhten N-Gehalt in Kombination mit einem pH-Wert von 5,5 und bei den unten aufgeführten Induktorkonzentrationen wird die Bildung der Xylanase gesteigert und ein Ertrag von mindestens 29 FPU/ml Cellulose gewährleistet.
Enthält das batch-Medium 20 g/l Sojaschrot und 10 g/l Cellulose und das feed-Medium 40 g/l Sojaschrot, so führt der hohe Gehalt an Sojaschrot und Cellulose im batch-Medium zur Induktion der Xylanasen bei gleichzeitig starker Induktion der Cellulasen, insbesondere der β-Glucosidase.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den Vorteil gegenüber dem bekannten Stand der Technik, dass die Ausbeute an xylanolytischer Aktivität drastisch gesteigert ist. Durch die veränderten verfahrenstechnischen Parameter und Induktoren wird die Xylanase-Expression gegenüber dem Verfahren nach DE 197 35 650 um 200–300% erhöht werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, Xylanaseaktivitäten im Fermentationsüberstand von 1.100–1.500 U/mL zu erreichen. Die cellulolytischen Aktivitäten werden dabei annähernd konstant gehalten, so dass das Enzymspektrum zugunsten der Xylanase verschoben wird (CMCase : β-Glucanase : Xylanase = 1 : 1,6 : 2,9). Nach DE 197 35 650 wird hingegen ein Enzymspektrum zugunsten der Cellulasen erreicht (CMCase : β-Glucanase : Xylanase nur 1 : 2 : 0,5). Hier dient das Verfahren zur Gewinnung eines cellulasereichen Enzympräparates.
Die Erfindung soll nachfolgend durch 5 Anwendungsbeispiele näher erläutert werden:
Beispiele:
Beispiel 1:
In einem 5-Liter Bioreaktor erfolgte die Kultivierung des Pilzstammes Trichaderma reesei M18.2 (DSM 10683) zur Produktion des Enzymkomplexes mit einer gesteigerten xylanolytischen Aktivität.
Als Substrate dienten Lactose, mikrokristalline Cellulose und Sojaschrot. Die mikrokristalline Cellulose wurde nur im batch-Medium eingesetzt. Der Gehalt an Soja wurde im batch- und Substratmedium erhöht. Der Prozess wurde als fed-batch-Fermentation durchgeführt, wobei die Zufütterung in Abhängigkeit von der Stoffwechselaktivität der Pilzkultur erfolgte. Die Fermentation wurde bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt.
Herstellung des Nährmediums für die batch-Phase:
2,3 l Nährmedium, bestehend aus 15 g/l Lactose; 20 g/l Sojaschrot; 10 g/l Cellulose; 5,4 g/l KH₂PO₄; 8,5 g/l (NH₄)₂SO₄; 0,7 g/l MgSO₄ × 7 H₂O; 0,7 g/l CaCl₂ × 2 H₂O; 8,78 mg/l FeSO₄ × 7 H₂O; 2,81 mg/l MnSO₄ × H₂O; 2,45 mg/l ZnSO₄ × 7 H₂O; 3,51 mg/l CoCl₂ × 6 H₂O und 2,61 g/l Antischaummittel Glanapon DG 102 sowie 1,43 g/l Detergenz Durfax 80 K in wässriger Lösung, wurde im Bioreaktor für 40 Minuten bei 121°C autoklaviert und anschließend bei 31°C wurde mit 12,5%igem Ammoniak-Wasser der pH-Wert auf 5,5 eingestellt.
Herstellung der Substratlösung für die fed-batch-Phase:
Bei einer Temperatur von etwa 80°C wurden die Substanzen für 2 l Substratlösung gelöst. Die Substratlösung, bestehend aus 345 g/l Lactose; 40 g/l Sojaschrot und 1 g/l Antischaummittel Glanapon DG 102, wurde ohne Einstellung des pH-Wertes für 30 Minuten bei 121°C autoklaviert und anschließend auf etwa 50°C unter ständigem Rühren temperiert.
batch-Phase:
Zur Inokulation des batch-Mediums wurde der Trichoderma reesei M18.2 in 400 ml Schüttelkolben-Kultur mit dem Nährmedium nach Mandels et al. 1971 angezüchtet. Die Medientemperatur wurde auf 31°C und der pH-Wert mittels 12,5%igen Ammoniakwasser auf 5,5 geregelt. Die Belüftungsrate der Fermentation betrug vvm = 0,6. Nach 10 bis 15 Stunden Fermentationszeit erfolgte die Zugabe des Detergenz Durfax 80 K. Das Ende der batch-Phase war nach ca. 25 Stunden Kultivierung erreicht und war dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenstoffdioxidgehalt der Bioreaktorabluft ein Maximum überschritt.
fed-batch-Phase:
Nach Überschreiten und Absinken des CO₂-Gehaltes in der Abluft wurde die Temperatur der Kultur auf 28°C abgesenkt. Nachdem der CO₂-Gehalt der Abluft 80% des maximalen Wertes erreicht hatte, erfolgte die portionsweise Zugabe der Substratlösung. In der Anfangsphase der fed-batch-Fermentation erfolgte die Zugabe der Substratlösung nach Erreichen des 80%-Wertes des vorhergehenden Maximums. Der 80%-Wert der CO₂-Konzentration im getrockneten Abgas durfte den Absolutwert von 2 Vol% nicht überschreiten.
Das zugegebene Volumen der Substratlösung entsprach 1,5 g Lactose pro Liter Kulturlösung. Der pH-Wert der Kultur wurde mit 12,5%igem Ammoniakwasser konstant auf 5,5 gehalten.
Die Fermentation wurde nach 96 Stunden und einem Endvolumen von etwa 3,5 l beendet. Das Mycel wurde abgetrennt und der verbliebene Kulturüberstand der Analyse unterzogen. Die Enzymaktivitäten der Fermentationslösung betrugen:
Beispiel 2:
In einem 5-l Bioreaktor erfolgte die Kultivierung des Pilzstammes Trichoderma reesei M18.2 (DSM 10683) zur Produktion des Enzymkomplexes mit einer gesteigerten hemicellulolytischen Aktivität.
Als Substrate dienten Lactose und Sojaschrot. Die Konzentration des Soja wurde gegenüber dem Verfahren DE 197 35 650 im Nährmedium der batch-Phase um 50% erhöht und in der Substratlösung um 30% erhöht. Der Induktor Cellulose wurde nicht eingesetzt. Der Prozess wurde als fed-batch-Fermentation durchgeführt, wobei die Zufütterung in Abhängigkeit von der Stoffwechselaktivität der Pilzkultur erfolgte. Die Fermentation wurde bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt.
Herstellung des Nährmediums für die batch-Phase:
2,3 l Nährmedium, bestehend aus 15 g/l Lactose; 30 g/l Sojaschrot; 5,4 g/l KH₂PO₄; 7,5 g/l (NH₄)₂SO₄; 0,7 g/l MgSO₄ × 7 H₂O; 0,7 g/l CaCl₂ × 2 H₂O; 8,78 mg/l FeSO₄ × 7 H₂O; 2,81 mg/l MnSO₄ × H₂O; 2,45 mg/l ZnSO₄ × 7 H₂O; 3,51 mg/l CoCl₂ × 6 H₂O und 2,61 g/l Antischaummittel Glanapon DG 102 sowie 1,43 g/l Detergenz Durfax 80 K in wässriger Lösung, wurde im Bioreaktor für 40 Minuten bei 121°C autoklaviert und anschließend bei 31°C mit 12,5%igem Ammoniak-Wasser auf pH 5,5 eingestellt.
Herstellung der Substratlösung für die fed-batch-Phase:
Bei einer Temperatur von etwa 80°C wurden die Substanzen für 2 l Substratlösung gelöst. Die Substratlösung, bestehend aus 345 g/l Lactose; 40 g/l Sojaschrot und 1 g/l Antischaummittel Glanapon DG 102, wurden ohne Einstellung des pH-Wertes für 30 Minuten bei 121°C autoklaviert und anschließend auf etwa 50°C unter ständigem Rühren temperiert.
Fermentation:
Die Prozessdurchführung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 35 Kultivierungsstunden wurde die Fermentation in die fed-batch-Phase überführt.
Die Fermentation wurde nach 96 Stunden und einem Endvolumen von etwa 4,0 l beendet. Das Mycel wurde abgetrennt und der verbliebene Kulturüberstand der Analyse unterzogen. Die Enzymaktivitäten der Fermentationslösung betrugen:
Beispiel 3:
In einem 5 l Bioreaktor erfolgte die Kultivierung des Pilzstammes Trichoderma reesei M18.2 (DSM 10683) zur Produktion des Enzymkomplexes mit einer gesteigerten hemicellulolytischen Aktivität.
Als Substrate dienten Lactose, und Sojaschrot. Die Konzentration des Soja im batch-Medium wurde auf 15 g/l reduziert. Unter Anpassung des C:N-Verhältnisses wurde die anorganische N-Quelle Ammoniumsulfat in geringerer Konzentration eingesetzt. Der Prozess wurde als fed-batch-Fermentation durchgeführt, wobei die Zufütterung in Abhängigkeit von der Stoffwechselaktivität der Pilzkultur erfolgte. Die Fermentation wurde bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt.
Herstellung des Nährmediums für die batch-Phase:
2,3 l Nährmedium, bestehend aus 15 g/l Lactose; 15 g/l Sojaschrot; 5,4 g/l KH₂PO₄; 7,5 g/l (NH₄)₂SO₄; 0,7 g/l MgSO₄ × 7 H₂O; 0,7 g/l CaCl₂ × 2 H₂O; 8,78 mg/l FeSO₄ × 7 H₂O; 2,81 mg/l MnSO₄ × H₂O; 2,45 mg/l ZnSO₄ × 7 H₂O; 3,51 mg/l CoCl₂ × 6 H₂O und 2,61 g/l Antischaummittel Glanapon DG 102 sowie 1,43 g/l Detergenz Durfax 80 K in wässriger Lösung, wurde im Bioreaktor für 40 Minuten bei 121°C autoklaviert und anschließend bei 31°C mit 12,5%igem Ammoniak-Wasser auf pH 5,5 eingestellt.
Herstellung der Substratlösung für die fed-batch-Phase:
Bei einer Temperatur von etwa 80°C wurden die Substanzen für 2 l Substratlösung gelöst. Die Substratlösung, bestehend aus 345 g/l Lactose; 40 g/l Sojaschrot und 1 g/l Antischaummittel Glanapon DG 102, wurde ohne Einstellung des pH-Wertes für 30 Minuten bei 121°C autoklaviert und anschließend auf etwa 50°C unter ständigem Rühren temperiert.
Fermentation:
Die Prozessdurchführung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 27 Kultivierungsstunden wurde die Fermentation in die fed-batch-Phase überführt.
Die Fermentation wurde nach 96 Stunden und einem Endvolumen von etwa 4,0 Liter beendet. Das Mycel wurde abgetrennt und der verbliebene Kulturüberstand der Analyse unterzogen. Die Enzymaktivitäten der Fermentationslösung betrugen:
Beispiel 4:
In einem 5 l Bioreaktor erfolgte die Kultivierung des Pilzstammes Trichoderma reesei M18.2 (DSM 10683) zur Produktion des Enzymkomplexes mit einer gesteigerten hemicellulolytischen Aktivität.
Als Substrate dienten Lactose, lösliches Maisprotein (SOLULYS L48L, Roquette, Frankreich) und cellulosehaltige Fraktion der Maisverarbeitung (COREX M100, Roquette, Frankreich). Der Prozess wurde als fed-batch-Fermentation durchgeführt, wobei die Zufütterung in Abhängigkeit von der Stoffwechselaktivität der Pilzkultur erfolgte. Die Fermentation wurde bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt.
Herstellung des Nährmediums für die batch-Phase:
2,3 l Nährmedium, bestehend aus 15 g/l Lactose; 5 g/l SOLULYS L48L; 5 g/l COREX M100; 5,4 g/l KH₂PO₄; 8,5 g/l (NH₄)₂SO₄; 0,7 g/l MgSO₄ × 7 H₂O; 0,7 g/l CaCl₂ × 2 H₂O; 8,78 mg/l FeSO₄ × 7 H₂O; 2,81 mg/l MnSO₄ × H₂O; 2,45 mg/l ZnSO₄ × 7 H₂O; 3,51 mg/l CoCl₂ × 6 H₂O und 2,61 g/l Antischaummittel Glanapon DG 102 sowie 1,43 g/l Detergenz Durfax 80 K in wässriger Lösung, wurde im Bioreaktor für 40 Minuten bei 121°C autoklaviert und anschließend bei 31°C mit 12,5%igem Ammoniak-Wasser auf pH 5,5 eingestellt.
Herstellung der Substratlösung für die fed-batch-Phase:
Bei einer Temperatur von etwa 80°C wurden die Substanzen für 2 l Substratlösung gelöst. Die Substratlösung, bestehend aus 276 g/l Lactose; 16 g/l SOLULYS L48L; 16 g/l COREX M100 und 1 g/l Antischaummittel Glanapon DG 102, wurde ohne Einstellung des pH-Wertes für 30 Minuten bei 121°C autoklaviert und anschließend auf etwa 50°C unter ständigem Rühren temperiert.
Fermentation:
Die Prozessdurchführung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 27 Kultivierungsstunden wurde die Fermentation in die fed-batch-Phase überführt. Das zugegebene Volumen der Substratlösung entsprach 1,2 g Lactose pro Liter Kulturlösung.
Die Fermentation wurde nach 96 Stunden und einem Endvolumen von etwa 4,0 l beendet. Das Mycel wurde abgetrennt und der verbliebene Kulturüberstand der Analyse unterzogen. Die Enzymaktivitäten der Fermentationslösung betrugen:
Beispiel 5:
In einem 5-l Bioreaktor erfolgte die Kultivierung des rekombinanten Pilzstammes Trichoderma reesei M18.2 AX1 (DSM 16613) mit einer zusätzlichen durch den CBHI – Promotor gesteuerten Kopie des Xylanase II-Gens zur Produktion des Enzymkomplexes mit einer gesteigerten hemicellulolytischen Aktivität.
Das Nährmedium und die Prozessbedingungen sind bereits unter Beispiel 1 beschrieben.
Die Fermentation wurde nach 96 Stunden und einem Endvolumen von etwa 4,0 l beendet. Das Mycel wurde abgetrennt und der verbliebene Kulturüberstand der Analyse unterzogen. Die Enzymaktivitäten der Fermentationslösung betrugen:
Literatur

– Mandels, M.; Weber, J.; Parizek, R.; Enhanced cellulase production by a mutant of Trichoderma viride; Appl. Microbiol. 21 (1971) 1273–1281
– Pure & Appl. Chem., Vol. 59, No. 2, (1987) 257–268
– König, J.; Grasser, R.; Pikor, N.; Vogel, K.; Determination of xylanase β-glucanase and cellulase activity; Anal Bioanal Chem 374 (2002) 80–87

Claims

Verfahren zur Herstellung von xylanasereichen Enzymkomplexen durch Fermentation von Stämmen der Gattung Trichoderma im aeroben Submersverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einem pH-Wert von 5,0–6,0 durchgeführt wird und das batch-Nährmedium einen Stickstoffanteil von 25–40% bezogen auf den Kohlenstoff enthält, der durch die proteinreiche organische Stickstoffquelle von mindestens 15 g/l Sojaschrot oder von mindestens 2 g/l lösliches Maisprotein sowie durch anorganische Ammoniumsalze realisiert wird, und 10–15 g/l Lactose, Salze, Spurenelemente und gegebenenfalls weitere Stoffe enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das batch-Nährmedium als weitere Stoffe weitere Cellulose-/Hemicellulaseinduktoren wie cellulosehaltige Rohstoffe wie mikrokristalline Cellulose oder Maisschalen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das batch-Nährmedium neben dem Induktor lösliches Maisprotein noch mindestens 2 g/l Maisschalen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das batch-Nährmedium neben dem Induktor Sojaschrot noch mindestens 10 g/l mikrokristalline Cellulose enthält.
Verfahren nach Anspruch 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einem pH-Wert von 5,5 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass als Stämme der Gattung Trichoderma die Trichoderma reesei Hochleistungsstämme DSM 16613 (rekombinanter Stamm) oder DSM 10683 eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass der Stickstoffanteil im batch-Nährmedium bezogen auf den Kohlenstoffanteil 30–40% beträgt, der durch den Induktor Sojaschrot in einer Konzentration von 15–60 g/l realisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das batch-Nährmedium vorzugsweise 15–30 g/l Sojaschrot enthält.
Verfahren nach Anspruch 1–8, dadurch gekennzeichnet, dass Lactose zusammen mit dem Induktor und der Stickstoffquelle Sojaschrot dem Nährmedium portionsweise mittels fed-batch Technik in solcher Weise zugeführt wird, dass die zugeführten Substrate in einer Endkonzentration von 1–2 g/l Lactose und 100–200 mg/l Sojaschrot im Fermentor vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zugeführten Substrate in einer Endkonzentration von vorzugsweise 1,5 g/l Lactose und 170 mg/l Sojaschrot im Fermentor vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass der Stickstoffanteil im batch-Nährmedium bezogen auf den Kohlenstoffanteil von 30–40 Masse% durch lösliches Maisprotein in einer Konzentration von 2–10 g/l realisiert wird, und als Cellulose-/Hemicellulaseinduktor Maisschalen in einer Konzentration von 2–10 g/l eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das batch-Nährmedium vorzugsweise 5 g/l lösliches Maisprotein und 5 g/l Maisschalen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1–6, 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass Lactose zusammen mit den Induktoren lösliches Maisprotein und Maisschalen dem Nährmedium portionsweise mittels fed-batch-Technik in solcher Weise zugeführt wird, dass die zugeführten Substrate in einer Endkonzentration von vorzugsweise 1–2 g/l Lactose, 50–100 mg/l lösliches Maisprotein und 50–100 mg/l Maisschalen im Fermentor vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zugeführten Substrate in einer Endkonzentration von 1,5 g/l Lactose, 70 mg/l lösliches Maisprotein und 70 mg/l cellulosehaltige Maisschalenfraktion im Fermentor vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass der Stickstoffanteil im batch-Nährmedium bezogen auf den Kohlenstoffanteil von 25–29 Masse% durch den Hemicellulaseinduktor und die Stickstoffquelle Sojaschrot in einer Konzentration von 10–30 g/l realisiert wird, und als Cellulaseinduktor mikrokristalline Cellulose in einer Konzentration von 5–15 g/l eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das batch-Nährmedium vorzugsweise 20 g/l Sojaschrot und 10 g/l mikrokristalline Cellulose enthält.
Verfahren nach Anspruch 1–6, 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass Lactose zusammen mit dem Induktor Sojaschrot dem Nährmedium portionsweise mittels fed-batch Technik in solcher Weise zugeführt wird, dass die zugeführten Substrate in einer Endkonzentration von vorzugsweise 1–2 g/l Lactose und 100–200 g/l Sojaschrot im Fermentor vorliegen
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die zugeführten Substrate in einer Endkonzentration von 1,5 g/l Lactose und 170 g/l Sojaschrot im Fermentor vorliegen.