CN114752613A - 果胶酶基因、果胶酶、重组载体及其在蓝莓加工中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果胶酶基因、果胶酶、重组载体及其在蓝莓加工中的应用。本发明所述果胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的果胶酶氨基酸序列与现有已知功能的果胶酶序列相似度仅56%。本发明所述的果胶酶ZF05具有热稳定性特性，在60℃下孵育2小时，可保持80%以上的活性。本发明所述的果胶酶性质稳定，产量大，可用于降解果胶多糖。

Description

果胶酶基因、果胶酶、重组载体及其在蓝莓加工中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及一种果胶酶基因、果胶酶、重组载体及其在蓝莓加工中的应用。

背景技术

短梗霉（Aureobasidium app.）广泛分布于各种生态环境中，包括森林土壤、海水、动植物组织等。短梗霉细胞形态主要有酵母状细胞、芽生孢子、厚垣孢子和菌丝体。它可以用来水解海洋中的绿藻以及各种工业废料。研究表明，短梗霉除了生产普鲁兰多糖以外，还可以产生多种酶，例如蔗糖酶、淀粉酶、果胶酶等。

果胶（Pectin）是一类富含半乳糖醛酸的植物细胞壁多糖的总称，其基本骨架是α-1,4糖苷键连接而成的均聚物。果胶主要是由聚半乳糖醛（Homogalacturonan，HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-I（Rhamnogalacturonan-I，RG-I）和鼠李半乳糖醛酸聚糖-II（Rhamnogalacturonan-II，RG-II）三种多糖基序组成，其中HG区域作为平滑区，是由甲酯化的半乳糖醛组成的线性多聚物，约占果胶的65%；RG-I和RG-II区域作为须状区，其中RG-I为主链是以半乳糖醛酸和鼠李糖为基本单元构成二糖重复单元，约占果胶的20-35%，侧链是以α-L-阿拉伯糖和β-D-半乳糖等中性糖为基本单元连接在鼠李糖基形成半乳聚糖；RG-II由多聚半乳糖醛酸构成骨架结构，约占果胶的10%。果胶结构复杂，在不同植物、不同组织、不同区域其链长结构也不尽相同，果胶作为水合剂和粘合材料使得纤维素网络结构彼此互交联在一起，从而形成复杂的细胞壁的骨架结构，起着维持细胞结构和功能稳定性的作用。果胶类物质在高等植物细胞壁中含量丰富，草本植物中含量约2-10%。在拟南芥叶细胞壁中的含量最高可达50%左右。果胶也是食物中的天然成分，其应用范围广泛。由于果胶具有凝胶特性，常作为食品添加剂应用于食品工业中。

果胶低聚糖（Pectinoligosaccharide, POS）又称果胶寡糖，是一类果胶经降解产生的低分子质量寡糖物质，聚合度一般介于2-10，分子量介于200-2000Da。果胶寡糖具有多种生理活性，是一种理想的现代功能性食品添加剂。目前很多研究表明存在于天然植物中的多糖具有抗肿瘤活性，能够促进人体肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌的生长繁殖，产生大量的短链脂肪酸类益生元物质。植物细胞壁中果胶经多聚半乳糖醛酸水解后产生果胶低聚糖，并在植物组织中起到生物防御的主要作用，发挥着自卫激活剂和生长调节剂的效用。

果胶寡糖的获得通常以富含果胶的农业产品废弃物为原料，并通过化学方法、物理方法和生物酶法将果胶降解以获得果胶低聚糖。物理法对于果胶的降解并不彻底，而化学法所用的化学试剂、反应条件等都不利于寡糖的生产，并且生产过程中容易生成废气、废水等污染物，对环境造成严重危害，与之相比，酶解法的条件温和，产物特异性强、反应效率高且绿色无污染。所以利用酶解法生产果胶寡糖是一种相对简单、高效且易获得的生产方法。

果胶酶（Pectinase）是一类能特异性降解果胶类物质的复合酶的总称。根据其作用机制的不同可以划分为三种：原果胶酶、果胶酯酶和解聚酶。原果胶酶可将不溶性果胶分解为可溶性果胶从而降低其黏度；果胶酯酶可降解甲酯键，释放甲醇和果胶酸；解聚酶分为裂解酶和水解酶，水解酶水解果胶中的α-1,4糖苷键，裂解酶反式消去降解α-1,4糖苷键，并在非还原末端形成不饱和半乳糖醛酸残基的寡聚糖。目前所研究的果胶裂解酶绝大多数来源于微生物，大多来源于青霉菌、曲霉、镰刀酶等真菌，细菌和酵母来源的报道较少。利用果胶酶在葡萄酒、蓝莓等果汁的萃取与纯化、果胶废水的处理等方面的应用研究较少，且传统使用的酶制剂技术所生产的产品有限，不适于大规模应用。当前全球对果胶及果胶寡糖的需求日益增加，果胶酶具有专一性强、高效性、作用条件温和、无污染等优点，将果胶酶广泛用于果汁生产中，可以快速彻底地清除果胶，降低果汁的黏度，在一定程度上也减少了化学澄清剂的用量，对改善果汁质量具有潜在应用价值。因此，寻找一种能高效降解果胶的新型果胶酶可为更好地开发利用果胶提供新资源，并且借助基因水平技术对果胶酶进行优化是提高果胶酶产量以及获取果胶寡糖的一种最有效方式。

发明内容

发明目的：为解决上述问题，本发明提供了果胶酶基因、果胶酶、重组载体及其在蓝莓加工中的应用。本发明通过产果胶酶的结构基因，并将其转入表达菌体中，从而得到能高效表达的高产菌株。

技术方案：本发明第一方面提供了一种果胶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所提供的果胶酶基因（果胶酶基因ZF05），来源于蓝莓果皮的短梗霉（Aureobasidium pullulans），从中扩增出的果胶酶ZF05编码基因，具有下述核苷酸序列特征之一：

（1）序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸（DNA）序列；

（2）对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸（DNA）序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有果胶酶活性的核苷酸序列；

（3）与序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸（DNA）序列的同源性达到80%及以上，且能编码降解果胶多糖和聚半乳糖醛酸的蛋白质的脱氧核糖核酸（DNA）序列。

本发明的果胶酶ZF05的基因序列是通过PCR技术从短梗霉（Aureobasidium pullulans）菌株LM1中克隆得到。该基因编码区长1563bp。

本发明第二方面提供了一种果胶酶（果胶酶ZF05），其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示的核苷酸编码或者如SEQ ID NO.2所示。

本发明的果胶酶的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的果胶酶的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

本发明的果胶酶ZF05的氨基酸序列，具有如下特征之一：

（1）由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码；

（2）对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有果胶酶活性的氨基酸序列；

（3）序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-520位氨基酸残基序列。

与本文所公开的序列相似或同源（与已知果胶酶序列相似度仅56%）的序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸水平上的序列同一性可以约为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。在核酸水平上，序列同一性可以约为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。

本发明所述的“基本相同（或基本同源）”是指第一氨基酸或核苷酸序列与第二氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的相同或等同（例如具有相似侧链，例如保守氨基酸取代）氨基酸残基或核苷酸，以使第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。

本发明第三方面提供了一株产果胶酶的普鲁兰短梗霉LM1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年03月09日，保藏号为CCTCC NO：M2022182。

本发明第四方面提供了一种重组载体，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的重组载体采用的表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。

作为本发明的一种优选实施方式，重组载体选用的表达载体为pPIC9K毕赤酵母载体。

本发明所述的重组载体的构建方法为：将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段克隆到表达载体中，获得重组载体。

本发明第五方面提供了一种宿主细胞，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者上述的重组载体。

作为本发明的一种优选实施方式，宿主细胞可以是大肠杆菌宿主细胞（如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等）、酵母菌宿主细胞（如Saccharomy cescerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyceslactis等）、枯草杆菌宿主细胞（如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920等）、乳酸菌宿主细胞（如Lactic acid bacteria COCC101等）、放线菌宿主细胞（如Streptomyces spp.等）、丝状真菌宿主细胞（如Trichoderma viride、Trichodermareesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等）、昆虫细胞（如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等）或哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等）。

作为本发明的一种优选实施方式，宿主细胞为毕赤酵母。

本发明中制备果胶酶的方法为：是将上文所述的果胶酶基因克隆入表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的果胶酶。

本发明第六方面提供了上述的普鲁兰短梗霉LM1的筛选方法，包括以下步骤：

（1）取新鲜蓝莓果皮于生理盐水中振荡，静置后取上清液接种于筛选培养基，摇床振荡培养，得到菌悬液；

（2）将步骤（1）得到的菌悬液涂布于初筛培养基平板上培养，挑选出能使溴酚蓝平板生成黄色圈的单菌落，进行划线分离纯化；

（3）将步骤（2）中纯化好的菌株划线接种于初筛培养基平板上培养后，接种于筛选培养基中，得到果胶酶活力高的普鲁兰短梗霉LM1。

作为本发明的一种优选实施方式，所述筛选培养基的组成为：5g/L果胶，2g/LNaNO₃，1g/L NaCl，1g/L MgSO₄，1g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.5g/L KH₂PO₄，0.01g/L 溴酚蓝。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的初筛培养基的组成为：5g/L果胶，2g/LNaNO₃，1g/L NaCl，1g/L MgSO₄，1g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.5g/L KH₂PO₄，20g/L琼脂， 0.01g/L溴酚蓝。

本发明第七方面提供了上述的果胶酶在降解果胶多糖中的应用。

具体的，对于上文所述本发明提供的果胶酶的应用，包括以下应用之一：

（1）在断裂果胶多糖的糖苷键，获得单糖或果胶寡糖中的应用；

（2）在断裂聚半乳糖醛酸的糖苷键，获得单糖或半乳糖醛酸中的应用；

（3）与其他果胶酶混合后，在协同断裂果胶多糖糖苷键方面的应用。

具体地，本发明所述的果胶酶可用于水解含有果胶的绿藻或者是含有果胶的植物果实。

本发明第八方面提供了上述的果胶酶在水解蓝莓中的应用。

除非另有说明，本发明中所述的“%”为质量百分比。

有益效果：（1）本发明的果胶酶ZF05，可以高效降解果胶多糖，以果胶多糖为底物时，具有热稳定性特性，在60℃下孵育4小时，可保持58.3%的活性；（2）本发明的果胶酶ZF05可广泛应用于农业、工业、食品、饲料添加、医药及果胶寡糖的制备等领域。

附图说明

图1为果胶酶ZF05表达及纯化的SDS-PAGE图；

图2为果胶酶ZF05的酶学特性测试结果，其中，A图为果胶酶ZF05的最适pH测定结果；B图为果胶酶ZF05的pH稳定性测定结果；C图 果胶酶ZF05的最适温度测定结果；D图为果胶酶ZF05的热稳定性测定结果；

图3为本发明的普鲁兰短梗霉LM1的单菌落图；

图4为本发明的果胶酶ZF05在水解蓝莓中的应用效果。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下列实施例中所使用的实验方法、实验所需试剂等，如无特殊说明，均为常规操作。

实施例1：产果胶酶菌株的筛选

以果胶为唯一碳源配制筛选培养基：果胶 5g/L， NaNO₃ 2g/L， NaCl 1g/L， MgSO₄1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，溴酚蓝0.01g/L。取10g新鲜蓝莓果皮样品于50mL无菌生理盐水中振荡30min，静置后吸取4 mL接种于100mL筛选培养基，30℃摇床振荡培养24h。取菌悬液0.5mL做适当梯度稀释，再取不同稀释度的菌悬液0.1mL涂布于初筛培养基平板（初筛培养基平板的组分为筛选培养基中加入2%的琼脂）上，30℃培养48h后，挑选出能使溴酚蓝平板生成黄色圈的单菌落，进行划线分离纯化。将纯化好的菌株划线接种于初筛平板上培养60h后，接种于筛选培养基中，30℃振荡培养60h后，将发酵液9000r/min离心15min后，吸取上清液适当稀释作稀释粗酶液，采用DNS法使用酶标仪测定稀释粗酶液的果胶酶活力，筛选出酶活力较高的菌株，得出其中菌株LM1（普鲁兰短梗霉LM1，Aureobasidium pullulans LM1）果胶酶活力最高，稀释粗酶液中的酶活达到20.1U/mL。

果胶酶活力测定方法为：

吸取1.8mL质量分数为1%的果胶底物溶液（用pH为5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）于具塞比色管中，加入0.2mL稀释粗酶液，50℃水浴精确反应30min后取出，加入3mL DNS试剂混匀后立即用沸水浴10min灭活，定容至25mL；以煮沸灭活的粗酶稀释液作为空白对照。用酶标仪在波长540nm处测OD值。果胶酶活力的定义：在上述反应条件（50℃，pH 5.0）下，1 mL酶液每分钟水解果胶底物生成1μg半乳糖醛酸的能力定义为1个酶活力单位（U）。

实施例2：菌株鉴定和果胶酶基因克隆

将菌株LM1在YPD固体培养基上于28℃培养两天，观察菌落特征及细胞形状，结果见图3，本发明筛选得到的普鲁兰短梗霉LM1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年03月09日，保藏单位地址：中国武汉，保藏号为CCTCC NO：M2022182。

通过PCR扩增得到产物，产物送测序后得到26S rDNA 的序列。PCR扩增D1/D2 26SrDNA序列所用引物为：

上游引物 NL-1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'（SEQIDNO.3）；

下游引物 NL-4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3（SEQIDNO.4）。

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的果胶酶基因（命名为果胶酶基因ZF05）编码区长1563bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。果胶酶基因ZF05编码的520个氨基酸，命名为果胶酶ZF05，其氨基酸序列为：

MRRFIATVGALLPVALACNNADTHPCPGYYHDNLAEVSDFCATFTQSTVAASTGLPSWATVCDNSPKKLSSACSCQVPATAVAASAPSSGVVASTTPSSSGFVTSVKNVESSPVFAITRTHSSSVTSAAAKVAVSSEVVVSSSVAATPAVTSSAAAVPTISGGASVSLASGGVTCTVTEYAGISSAVASCTNIVLSNIKAPASSTIDLTSLQTGTHVIFAGKTTFEDTNDKKFDPIVITGTDIIVEGADGHVIDGNGQSYWDGKGSNGGDAKPNHFIVAKHVNNGRFENLNIQNWPVHCFYVSYCNAVTFSNILLNNTIGNEPNSKSGSKAAAHNSDGFDISSSDNIVLTDSHVYNQDDCVAVTSGSKILVDSMYCSGGHGLSIGSIGGKSNNTVSDVTFQNSIIVDSQNGCRIKSNEGETGEVSNIHYKNITMENIEKYGLVIQQDYLNGGPTGEPSNGVTISGVTVTDVKGTMSSSKGIDYYVLCGDGSCSDFSYSGVEITGGSGDKCNYPSSGCPAI（如SEQIDNO.2所示），氨基酸链型为单链，蛋白质理论分子量为49.0kDa。

采用PCR的方法扩增LM1菌株的果胶酶编码基因，所用引物为：

PT1: ATGCGTCGCTTTATCGCTACCGTAG（SEQIDNO.5）；

PT2: CTAAATTGCAGGGCAACCAG（SEQIDNO.6）。

实施例3：果胶酶ZF05在毕赤酵母中异源表达及纯化

果胶酶基因ZF05与pPIC9K 毕赤酵母载体相连，构建重组载体，并按毕赤酵母表达手册方法进行电转化，待长出单菌落进行筛选并将其进行诱导表达实验。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测果胶酶ZF05的表达及纯化情况，结果如图1所示，纯化后的果胶酶ZF05在电泳胶上呈单一条带，且位置（约49kDa）与预测的分子量（49.30kDa）相吻合。

实施例4：果胶酶ZF05的酶学特性

如图2中A图所示，选择果胶多糖作为底物，在55℃条件下进行还原糖测定，测得果胶酶ZF05最适pH为3.5，在pH 6.0时仍有20%活性，在pH 5.0时有60%活性，但在pH 4.0~6.0其活性逐渐下降。

如图2中B图所示，选择果胶多糖作为底物，在pH 2.0~6.0的范围内35℃保温2h，果胶酶ZF05在2.5~4.5具有pH稳定性，均可以保持80%左右的酶活力。

如图2中C图所示，选择果胶多糖作为底物，pH为3.5，测得果胶酶ZF05最适温度为55℃，当孵育温度从35℃升为55℃，酶活逐渐上升至98%。在65℃仍有70%活性。当孵育温度从65℃升为70℃，酶活快速下降至45%。

如图2中D图所示，选择果胶多糖作为底物，pH为3.5，该酶在温度40℃~60℃的范围内均可以保持80%左右的酶活力。在35℃具有最高热稳定性，在60℃下孵育2小时，依然可以保持80%以上的活性，在60℃下孵育4小时，可保持58.3%的活性。当温度有65℃上升至70℃，稳定性急剧降低，达到45%。

实施例5：果胶酶ZF05降解蓝莓的方法

1) 匀浆：挑选成熟、无霉烂、无红果青果蓝莓样品解冻、榨汁、分装，每瓶100g，将实施例1制备的酶活为20.1 U/mL的粗酶溶液（果胶酶ZF05）取8‰（以蓝莓的总质量计）分别加入其中混匀，反应前测其pH，同时与纤维素酶（PB纤维素酶，南宁庞博生物工程有限公司）、果胶酶（PB果胶酶，南宁庞博生物工程有限公司）、纤维素酶（LKT纤维素酶，山东隆科特酶制剂有限公司）以及果胶酶（LKT果胶酶，山东隆科特酶制剂有限公司）作比较，每种酶加入量均为蓝莓总质量的8‰。

2) 酶解：将上述样品放入摇床，45℃，3h，反应结束测其pH。

3) 分离：反应结束于50mL离心管将上述样品进行8000rpm，5min离心。取上述离心后样品，稀释10×和20×观察其颜色差别，并测定530nm波长处的吸光度A_530nm。

4) 测定：花色苷含量测定（采用pH示差法）：于两只25mL具塞试管中分别加入2~5mL步骤3）离心蓝莓粗汁，一只试管加入8mL pH 1.0缓冲液（0.2mol/L KCL溶液-0.2mol/LHCl溶液）；另一只试管加入8mL pH 4.5缓冲液（1mol/L NaAc溶液-1mol/L HCl溶液-H₂O），混匀后静置30min，利用分光光度计来测定510nm和700nm波长处的吸光度A_510nm和A_700nm，从而确定总花色苷含量。

总吸光度（A）= pH 1.0（A_510nm-A_700nm）- pH 4.5（A_510nm-A_700nm）

结果如图4所示，从图4中可以看出，果胶酶ZF05所产出的总花色苷含量明显高于其他商品酶，本发明的果胶酶ZF05的酶解效率高。此外，本发明果胶酶具有较好的热稳定性和pH 耐受性，具有更好的应用潜力。

将本发明的果胶酶ZF05用于水解果胶多糖，解决了在果汁饮料的生产过程中提取的果肉往往含有较高的果胶含量，使得果肉的粘度较高，果汁澄清困难的问题。在制作浓缩蓝莓汁的过程中，用果胶酶ZF05处理蓝莓肉，提高出汁率。此外，由于本发明的果胶酶ZF05具有耐高温性能，可以提高果胶酶的浓度和反应温度，增加花色苷类物质含量。

对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的范围的情况下，能利用上述公开的技术内容对本发明的技术方案进行多种可能的变更和改，或改为等效变更的等效实施例。因此，在不脱离本发明技术方案内容的前提下，根据本发明的技术实质对上述实施例所作的等效变更和改动，仍属于本发明技术方案的范围。本发明的实施例不应限于以下所述的示例性实施例，但应受权利要求书及其任何等同形式中阐述的限制的控制。

序列表

<110> 青岛紫斐农业科技发展有限公司

<120> 果胶酶基因、果胶酶、重组载体及其在蓝莓加工中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1563

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgtcgct ttatcgctac cgtaggcgct ctcttgcctg tcgctctcgc atgtaacaat 60

gcagatacac acccttgtcc tggttactac cacgacaatt tagccgaagt ctcggacttc 120

tgtgccacct tcacgcaaag caccgtcgct gcttctaccg gccttccgtc atgggcgact 180

gtctgtgaca acagtcctaa gaagctgtct agtgcatgca gctgtcaggt ccccgctact 240

gctgttgctg cttctgcacc gtcctcgggt gtcgtcgcat ccaccacacc ttcatcctca 300

ggctttgtca cctctgtcaa gaatgtcgag agctcccctg ttttcgctat cacccggacc 360

cactcctcca gtgtcaccag tgctgccgca aaggtcgccg tgagctctga agtcgtggtc 420

agctcttcgg ttgctgccac tcctgctgtt actagctctg cggctgctgt ccctactatt 480

tctggaggtg catctgtctc gctcgcttcg ggcggtgtca cttgcactgt gaccgagtac 540

gctggcatct cgtcagctgt ggcctcgtgc accaatatcg tcctctccaa catcaaagcc 600

cctgcctcga gcactatcga tctcacctct ctgcagactg gaacccatgt catttttgct 660

ggcaagacca cttttgagga tacaaacgac aagaaattcg acccgatcgt gatcacggga 720

actgatatca ttgtggaagg cgctgacggt cacgtcatag acggaaatgg acagtcttac 780

tgggacggaa agggtagcaa tggaggtgac gctaagccca accacttcat cgtcgcaaag 840

catgtcaaca atggacgctt cgagaacttg aacatacaga actggcccgt ccactgtttc 900

tatgtctctt actgcaacgc cgtcaccttc tcgaatatcc ttctgaacaa cactattgga 960

aatgagccca actctaaaag tggcagtaag gcagccgccc acaactctga cggattcgac 1020

atctcttcca gcgacaacat cgtcctgact gactcccatg tctacaacca agatgactgt 1080

gttgccgtta cctctggttc gaaaatattg gtagacagta tgtactgctc tggtggtcat 1140

ggcctctcga tcggatccat tggcggcaag tcaaacaaca ccgtcagcga tgtcactttc 1200

cagaactcta tcatcgtcga cagccaaaac ggttgccgca tcaagtccaa cgagggcgag 1260

actggcgagg tttccaacat ccactacaag aatatcacca tggagaacat tgaaaagtac 1320

ggcttggtaa tccagcagga ctacctcaat ggtggtccga ccggcgaacc cagcaacggt 1380

gttactattt ctggagtcac tgttacagat gtcaaaggaa ctatgtctag cagcaagggc 1440

attgactatt acgtcctttg tggtgacggc tcttgcagcg acttctcgta ctctggcgtt 1500

gaaatcactg gtggcagtgg tgacaagtgc aactaccctt cttctggttg ccctgcaatt 1560

tag 1563

<210> 2

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Arg Phe Ile Ala Thr Val Gly Ala Leu Leu Pro Val Ala Leu

1 5 10 15

Ala Cys Asn Asn Ala Asp Thr His Pro Cys Pro Gly Tyr Tyr His Asp

20 25 30

Asn Leu Ala Glu Val Ser Asp Phe Cys Ala Thr Phe Thr Gln Ser Thr

35 40 45

Val Ala Ala Ser Thr Gly Leu Pro Ser Trp Ala Thr Val Cys Asp Asn

50 55 60

Ser Pro Lys Lys Leu Ser Ser Ala Cys Ser Cys Gln Val Pro Ala Thr

65 70 75 80

Ala Val Ala Ala Ser Ala Pro Ser Ser Gly Val Val Ala Ser Thr Thr

85 90 95

Pro Ser Ser Ser Gly Phe Val Thr Ser Val Lys Asn Val Glu Ser Ser

100 105 110

Pro Val Phe Ala Ile Thr Arg Thr His Ser Ser Ser Val Thr Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Lys Val Ala Val Ser Ser Glu Val Val Val Ser Ser Ser Val

130 135 140

Ala Ala Thr Pro Ala Val Thr Ser Ser Ala Ala Ala Val Pro Thr Ile

145 150 155 160

Ser Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Ala Ser Gly Gly Val Thr Cys Thr

165 170 175

Val Thr Glu Tyr Ala Gly Ile Ser Ser Ala Val Ala Ser Cys Thr Asn

180 185 190

Ile Val Leu Ser Asn Ile Lys Ala Pro Ala Ser Ser Thr Ile Asp Leu

195 200 205

Thr Ser Leu Gln Thr Gly Thr His Val Ile Phe Ala Gly Lys Thr Thr

210 215 220

Phe Glu Asp Thr Asn Asp Lys Lys Phe Asp Pro Ile Val Ile Thr Gly

225 230 235 240

Thr Asp Ile Ile Val Glu Gly Ala Asp Gly His Val Ile Asp Gly Asn

245 250 255

Gly Gln Ser Tyr Trp Asp Gly Lys Gly Ser Asn Gly Gly Asp Ala Lys

260 265 270

Pro Asn His Phe Ile Val Ala Lys His Val Asn Asn Gly Arg Phe Glu

275 280 285

Asn Leu Asn Ile Gln Asn Trp Pro Val His Cys Phe Tyr Val Ser Tyr

290 295 300

Cys Asn Ala Val Thr Phe Ser Asn Ile Leu Leu Asn Asn Thr Ile Gly

305 310 315 320

Asn Glu Pro Asn Ser Lys Ser Gly Ser Lys Ala Ala Ala His Asn Ser

325 330 335

Asp Gly Phe Asp Ile Ser Ser Ser Asp Asn Ile Val Leu Thr Asp Ser

340 345 350

His Val Tyr Asn Gln Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Ser Lys

355 360 365

Ile Leu Val Asp Ser Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile

370 375 380

Gly Ser Ile Gly Gly Lys Ser Asn Asn Thr Val Ser Asp Val Thr Phe

385 390 395 400

Gln Asn Ser Ile Ile Val Asp Ser Gln Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser

405 410 415

Asn Glu Gly Glu Thr Gly Glu Val Ser Asn Ile His Tyr Lys Asn Ile

420 425 430

Thr Met Glu Asn Ile Glu Lys Tyr Gly Leu Val Ile Gln Gln Asp Tyr

435 440 445

Leu Asn Gly Gly Pro Thr Gly Glu Pro Ser Asn Gly Val Thr Ile Ser

450 455 460

Gly Val Thr Val Thr Asp Val Lys Gly Thr Met Ser Ser Ser Lys Gly

465 470 475 480

Ile Asp Tyr Tyr Val Leu Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Asp Phe Ser

485 490 495

Tyr Ser Gly Val Glu Ile Thr Gly Gly Ser Gly Asp Lys Cys Asn Tyr

500 505 510

Pro Ser Ser Gly Cys Pro Ala Ile

515 520

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatatcaat aagcggagga aaag 24

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtccgtgtt tcaagacgg 19

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcgtcgct ttatcgctac cgtag 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctaaattgca gggcaaccag 20

Claims (10)

1.一种果胶酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种果胶酶，其特征在于，其氨基酸序列由权利要求1所述的果胶酶基因编码或者如SEQ ID NO.2所示。

3.一株普鲁兰短梗霉LM1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年03月09日，保藏号为CCTCC NO：M2022182。

4.一种重组载体，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，该重组载体的表达载体为pPIC9K 毕赤酵母载体。

6.一种宿主细胞，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者如权利要求4所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，宿主细胞为毕赤酵母。

8.一种如权利要求3所述的普鲁兰短梗霉LM1的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取新鲜蓝莓果皮于生理盐水中振荡，静置后取上清液接种于筛选培养基，摇床振荡培养，得到菌悬液；

（2）将步骤（1）得到的菌悬液涂布于初筛培养基平板上培养，挑选出能使溴酚蓝平板生成黄色圈的单菌落，进行划线分离纯化；

（3）将步骤（2）中纯化好的菌株划线接种于初筛培养基平板上培养后，接种于筛选培养基中，得到果胶酶活力高的普鲁兰短梗霉LM1。

9.一种如权利要求2所述的果胶酶在降解果胶多糖中的应用。

10.一种如权利要求2所述的果胶酶在水解蓝莓中的应用。

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