CN109694859A

CN109694859A - 一种嗜热果胶酶及其表达基因与应用

Info

Publication number: CN109694859A
Application number: CN201910024075.6A
Authority: CN
Inventors: 王瑞明; 汪俊卿; 贾保磊; 吉兴香; 王腾飞
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-04-30
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: CN109694859B

Abstract

本发明涉及一种嗜热果胶酶及其表达基因与应用。一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述嗜热外切聚半乳糖醛酸酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次发现了一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶及其表达基因，该酶具有较高的嗜热性，最适温度70‑75℃，可应用于饲料、纺织和造纸等需要高温操作的环境中，具有更好的应用潜力以及经济价值。

Description

一种嗜热果胶酶及其表达基因与应用

技术领域

本发明涉及一种嗜热果胶酶及其表达基因与应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

果胶是由D-半乳糖醛酸以α-1,4-糖苷键连接而成的一种聚合非淀粉多糖，主要存在于植物细胞的细胞壁中。由于果胶结构复杂，且具有一定的吸水性和黏性，因而造成诸多涉及植物资源的加工难题。如果胶能够增加果汁的黏度，使其浑浊，品质下降；果胶还可以阻碍饲料与动物胃肠道中的消化酶接触，降低饲料利用效率等。

果胶酶是一类能够专一催化果胶降解的酶的总称，根据作用底物的不同可以将其分为3种类型：降解不溶性果胶类物质的原果胶酶；对甲酯化果胶脱甲酯的果胶酯酶；以及裂解多聚半乳糖醛酸中α-1,4-糖苷键的解聚酶，其中以果胶解聚酶应用最为广泛。聚半乳糖醛酸酶是果胶解聚酶中的一种，按照作用方式可将其分为外切聚半乳糖醛酸酶和内切聚半乳糖醛酸酶。现已报道的能够产生果胶解聚酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等，最适温度在30℃～50℃，其中外切聚半乳糖醛酸酶能够裂解不溶性的果胶质物质，因而具有广泛的用途，目前已在饲料、食品、纺织和造纸等多个行业都发挥这重要的作用，具有重要的经济价值。

目前关于外切聚半乳糖醛酸酶相关的研究主要包括两个方面，一方面如：

中国专利文献CN103173366A(申请号201310080723.2)公开了一株产果胶酶菌株——黑曲霉(Asperillus niger)WZW001，及其在制备果胶酶和柑桔脱囊衣复合酶中的应用。该菌株于2012年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2012399。本发明利用黑曲霉(Asperillus niger)WZW001制备的柑桔脱囊衣复合酶具有生产成本低、专一高效、应用稳定等优点，应用时仅需将黑曲霉WZW001菌株发酵液制备固体果胶酶或分离纯化后得到PL、Exo-PG、PE单一酶组分，然后将固体果胶酶或单一酶组分中的一种或多种与市售纤维素酶进行复配，不需要额外添加其他酶即可高效脱除柑桔囊衣。

中国专利文献CN104480093A(申请号201410662606.1)公开了生产酶产品的方法,通过发酵曲霉属菌株而获得的具有多种酶活性的酶产品的生产方法。本发明的酶产品包含至少下列酶活性：i.多聚半乳糖醛酸内切酶活性；ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性；iii.果胶酯酶活性；iv.果胶裂解酶活性；v.纤维素酶活性；vi.木聚糖酶活性和vii.阿拉伯聚糖酶活性。

中国专利文献CN106047840A(申请号201610405968.1)公开了一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其制备方法和应用。所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。该酶最适pH为3.5、热稳定性好(最适温度70℃，在60、70℃中处理1h都能保持80％以上的酶活)，容易发酵生产。

以上技术描述了具有外切聚半乳糖醛酸酶活性的果胶酶及其生产方法；

另一方面，部分文献提供了关于果胶酶的应用方法和应用场景，如：中国发明专利文献CN102037122A(申请号200980118745.5)公开了一种或多种果胶分解酶在水果或蔬菜糊状物的处理中的用途，以及包括加入一种或多种果胶分解酶的步骤的用于水果或蔬菜糊状物的酶处理的方法，其中至少一种果胶分解酶可从里氏木霉获得，以及涉及包括用于水果或蔬菜糊状物的酶处理的方法的用于水果或蔬菜汁的制备的方法。此外，本发明公开了编码具有内切多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽、具有外切多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽、具有外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽和具有木半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽的重组DNA分子。

虽然目前已有部分关于外切聚半乳糖醛酸酶的研究，但由于该类酶的部分使用环境的温度较高，因此，迫切需要一种对温度有较高耐受性的外切聚半乳糖醛酸酶应用于造纸、饲料、纺织等领域。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶(PG)及其表达基因与应用，嗜热外切聚半乳糖醛酸酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种该耐热外切聚半乳糖醛酸酶的异源表达方式，即通过优选的毕赤酵母对所述核苷酸序列进行表达，该表达方式能够获得具有更高嗜热性的外切聚半乳糖醛酸酶。

本发明的技术方案如下：

一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述嗜热外切聚半乳糖醛酸酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种重组表达载体，通过向表达载体中插入SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的功能片段制得。

根据本发明优选的，所述表达载体为pPIC9K。

一种重组细胞，向宿主菌中转化上述重组表达载体或表达上述嗜热外切聚半乳糖醛酸酶制得。

根据本发明优选的，所述宿主菌为毕赤酵母。

上述嗜热外切聚半乳糖醛酸酶在70～80℃的环境下裂解α-1,4-糖苷键反应中的应用。

一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)以热黄腐菌(Thermoflavifilum sp.)QL01基因组为模板，进行PCR扩增，制得PCR产物；所述PCR的引物核苷酸序列如下所示：

PG-F1：5'-GAATTCATGCACCCAGTCTACACTAACC-3'，含EcoR Ⅰ酶切位点

PG-R1：5'-GCGGCCGCTTAATGATGGTGGTGATGATGACCTC-3'，含Not Ⅰ酶切位点

(2)将步骤(1)制得的PCR产物经限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，然后与同样经限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切的质粒pPIC9K进行连接，制得重组质粒pPIC9K-PG；

(3)将步骤(2)制得的重组质粒pPIC9K-PG转化毕赤酵母，经筛选，制得毕赤酵母重组子GS115/PG；

(4)将毕赤酵母重组子GS115/PG进行诱导表达，纯化，制得嗜热外切聚半乳糖醛酸酶。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：

10×扩增缓冲液5μl、浓度800μmol/L(4种各200μmol/L)dNTP 2μl、上游引物10～100pmol、下游引物10～100pmol、模板DNA 0.2μg、Taq DNA聚合酶2.5U，加ddH₂O水补齐50μl。

PCR扩增程序如下：

94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增后还包括将PCR产物与pUCm-T连接，转化大肠杆菌JM109，酶切测序的过程。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，连接采用T4DNA连接酶。

所述步骤(3)和步骤(4)中的步骤均按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，诱导表达按照手册上的标准流程进行，转化过程中对重组质粒pPIC9K-PG进行线性化采用限制性内切酶Sal Ⅰ酶切。

有益效果

1、本发明首次发现了一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶及其表达基因，该酶具有较高的嗜热性，最适温度70-75℃，可应用于饲料、纺织和造纸等需要高温操作的环境中，具有更好的应用潜力以及经济价值；

2、本发明所述的一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶通过采用特殊方法制备后，其最是温度较一般表达方式获得的酶的最适温度有明显提高，最适温度可达75℃。

附图说明

图1、重组质粒pPIC9K-PG的示意图；

图2、毕赤酵母表达外切聚半乳糖醛酸酶最适温度测定结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的保护范围。

生物材料来源

热黄腐菌(Thermoflavifilum sp.)QL01购自于山东省微生物工程重点实验室(编号：QLTs01)，普通市售产品；

pUCm-T、pET-28a、pYES2、pPIC9K载体及大肠杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

实施例1含编码外切聚半乳糖醛酸酶基因的表达质粒的构建及转化

(1)毕赤酵母表达载体构建

以PG-F1和PG-R1为引物，热黄腐菌(Thermoflavifilum sp.)QL01基因组为模板，进行PCR扩增，制得全长为1526bp含有酶切位点的目的基因，所述PCR的引物核苷酸序列如下所示：

PG-F1：5'-GAATTCATGCACCCAGTCTACACTAACC-3'，含EcoR Ⅰ酶切位点

PG-R1：5'-GCGGCCGCTTAATGATGGTGGTGATGATGACCTC-3'，含Not Ⅰ酶切位点

PCR扩增体系如下：

10×Taq Buffer 5μl、800μmol/L dNTP 2μl、引物PG-F1和PG-R1各1μl、模板DNA 2μl、Taq DNA聚合酶1μl，加ddH₂O水补齐50μl。

PCR扩增程序如下：

94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；

将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-PG)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

将测序结果正确的pUCm-T-PG与pPIC9K质粒均用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-PG(图1)，并对重组表达质粒进行序列测定。用Sal Ⅰ对pPIC9K-PG进行线性化，并对毕赤酵母GS115感受态进行电转化，参数设置为电击电压为1800V,时间为5ms，经G418(遗传霉素)抗性筛选后，得到毕赤酵母重组子GS115/PG。该工程菌经YPD培养基(蛋白胨2％、酵母粉1％、葡萄糖2％)培养，并添加1.0％甲醇诱导发酵72h后，离心所获上清液为重组外切聚半乳糖醛酸酶粗酶液。

(2)酿酒酵母表达载体构建

以PG-F1和PG-R1为引物进行PCR(94℃ 2min；30个循环，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃90s；72℃ 10min)，扩增全长为1526bp含有酶切位点的目的基因：

PG-F1：5'-GAATTCATGCACCCAGTCTACACTAACC-3'，含EcoR Ⅰ酶切位点

PG-R1：5'-GCGGCCGCTTAATGATGGTGGTGATGATGACCTC-3'，含Not Ⅰ酶切位点

将测序结果正确的pUCm-T-PG与pYES2质粒均用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pYES2-PG(图1)，并对重组表达质粒进行序列测定。其后使用该质粒对酿酒酵母YPH500感受态进行电转化，参数设置为电击电压为1500V,时间为5ms，经5-FOA(5-氟乳清酸)抗性筛选后，得到酿酒酵母重组子YPH500/PG。该工程菌经YPD培养基(蛋白胨2％、酵母粉1％、葡萄糖2％)发酵培养72h后，离心所获上清液为重组外切聚半乳糖醛酸酶粗酶液。

(3)大肠杆菌表达载体构建

以PG-F2和PG-R1为引物进行PCR(94℃ 2min；30个循环，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃90s；72℃ 10min)，扩增全长为1524bp含有酶切位点的目的基因：

PG-F2：5'-CCATGCACCCAGTCTACACTAACC-3'，含Nco Ⅰ酶切位点

PG-R1：5'-GCGGCCGCTTAATGATGGTGGTGATGATGACCTC-3'，含Not Ⅰ酶切位点将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-PG’)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。

将测序结果正确的pUCm-T-PG’与pET-28a质粒均用Nco Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a-PG(图1)，并对重组表达质粒进行序列测定。其后使用该质粒对大肠杆菌BL21感受态进行热激转化，热激温度为42℃,时间为90s，经卡那霉素抗性筛选后，得到大肠杆菌重组子BL21/PG。该工程菌经含含0.5mmol/L IPTG的LB培养基(蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％)诱导发酵8h后，超声破碎、离心所获上清液为重组外切聚半乳糖醛酸酶粗酶液。

实施例2外切聚半乳糖醛酸酶的最适温度测定

采用DNS法对实施例1制得的外切多聚半乳糖醛酸酶进行活性分析。具体方法如下：

在pH 7.0，50-80℃不同温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当稀释的酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，煮沸7min。冷却后使用分光光度计在540nm测定OD值。

外切多聚半乳糖醛酸酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生产1μmol还原糖所需的酶量为一个活性单位(U)。

结果显示，大肠杆菌和酿酒酵母表达的外切多聚半乳糖醛酸酶最适温度为70℃，而毕赤酵母表达的外切多聚半乳糖醛酸酶最适温度为75℃，嗜热性能大于其在大肠杆菌和酿酒酵母的产物。推测外切多聚半乳糖醛酸酶中存在较多的糖基化位点(N*T/S)，而毕赤酵母的糖基化方式能够有效提高其对高温的耐受能力，因而更适合作为本发明的外切多聚半乳糖醛酸酶基因表达宿主。对毕赤酵母表达的外切多聚半乳糖醛酸酶最适温度的测定结果如图2所示。

序列表

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种嗜热果胶酶及其表达基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1512

<212> DNA

<213> 热黄腐菌(Thermoflavifilum sp.)

<400> 1

atgcacccag tctacactaa cccatctcca cagccattct tcaacgtcag agaatacggt 60

gctaaggctg acggtcaaac taacgatgct ccagctatca acaaggctat tcaagctgct 120

catgatgccg gtggtggtac tgtttttttt cctgccggta cttacctgtc cggttccatt 180

agattgcagt cccacgttac cttgtacctg gacaacggtt gtgttatctt ggcctctgaa 240

aacccacaag actacgatgc tgctgagcca aatccacacg atcaatacca agattacggt 300

cactcccact ggcacaattc cttgatttgg ggtgaaaacc tggacgacat tgccattgaa 360

ggtccaggta tgattgacgg taagggtctg accagaaact acagatctga ccaaaagcca 420

gaaggtgtcg gtaacaaggc cattgctttg aagaactgcc acaacgtcat cctgaaggac 480

ttcaagatct acagaggtgg ttggttcggt ttgttgttga ccggtgttga caacctgacc 540

atcgacaact tgatgatcga caccaacaga gatggtatgg acatcgacgc ctgtaagaac 600

gttcacgtta ccaactgtat cgtcaactcc ccatacgacg acggtatctg tttgaagtca 660

tcctacggtt tgggtttcgc taagtccact gagaacgtta ccatctccga ctgtattgtc 720

tccggtgact acgttatcgg ttccgttatc gacggaacct acaagttgta cccagacacc 780

atgagagttc caagaaccgg tagaatcaag ttcggtactg aatccaacgg tggtttcaag 840

aacatcacca tcaccaactg tgtcttggac cactgtggtg gtttggcttt ggaatctgtt 900

gatggtgctg acttggagaa cgtcactatt tccaacatca ctatgaggga catcgtcaac 960

atgcccatct tcatcagatt gggtgccaga ttgagaggtc ctgaaggtac tcaaccaggt 1020

cacatcagaa aggtgtctat ctcccacatc gttgtttact cctctgcttc tagagctgct 1080

tccactatct ctggtattcc aggtcacgac atcgaggacg ttactttgtc tgacatgcag 1140

atctttctgg aaggtggtgg aactactgag caggctgcta ttaacccacc agagaaagaa 1200

aacgcttacc cagagccaac tatgttcgga accttgccat gttacggttt ctacatcaga 1260

cacgccaaga acattgcaat caacaacatc cagatctaca caaacaagaa ggacgagagg 1320

ccagctattc agactgacga tgttaagaac gtccagttca gattcttgga cctgccagag 1380

gataacccaa agccatactt ccacttcatc aggactaaca acattgagat cctgcactgc 1440

accaacacca aggacgaatt gattgctact accgaggacg agaagagagg tcatcatcac 1500

caccatcatt aa 1512

<210> 2

<211> 503

<212> PRT

<213> 热黄腐菌(Thermoflavifilum sp.)

<400> 2

Met His Pro Val Tyr Thr Asn Pro Ser Pro Gln Pro Phe Phe Asn Val

1 5 10 15

Arg Glu Tyr Gly Ala Lys Ala Asp Gly Gln Thr Asn Asp Ala Pro Ala

20 25 30

Ile Asn Lys Ala Ile Gln Ala Ala His Asp Ala Gly Gly Gly Thr Val

35 40 45

Phe Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Leu Ser Gly Ser Ile Arg Leu Gln Ser

50 55 60

His Val Thr Leu Tyr Leu Asp Asn Gly Cys Val Ile Leu Ala Ser Glu

65 70 75 80

Asn Pro Gln Asp Tyr Asp Ala Ala Glu Pro Asn Pro His Asp Gln Tyr

85 90 95

Gln Asp Tyr Gly His Ser His Trp His Asn Ser Leu Ile Trp Gly Glu

100 105 110

Asn Leu Asp Asp Ile Ala Ile Glu Gly Pro Gly Met Ile Asp Gly Lys

115 120 125

Gly Leu Thr Arg Asn Tyr Arg Ser Asp Gln Lys Pro Glu Gly Val Gly

130 135 140

Asn Lys Ala Ile Ala Leu Lys Asn Cys His Asn Val Ile Leu Lys Asp

145 150 155 160

Phe Lys Ile Tyr Arg Gly Gly Trp Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gly Val

165 170 175

Asp Asn Leu Thr Ile Asp Asn Leu Met Ile Asp Thr Asn Arg Asp Gly

180 185 190

Met Asp Ile Asp Ala Cys Lys Asn Val His Val Thr Asn Cys Ile Val

195 200 205

Asn Ser Pro Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Leu Lys Ser Ser Tyr Gly Leu

210 215 220

Gly Phe Ala Lys Ser Thr Glu Asn Val Thr Ile Ser Asp Cys Ile Val

225 230 235 240

Ser Gly Asp Tyr Val Ile Gly Ser Val Ile Asp Gly Thr Tyr Lys Leu

245 250 255

Tyr Pro Asp Thr Met Arg Val Pro Arg Thr Gly Arg Ile Lys Phe Gly

260 265 270

Thr Glu Ser Asn Gly Gly Phe Lys Asn Ile Thr Ile Thr Asn Cys Val

275 280 285

Leu Asp His Cys Gly Gly Leu Ala Leu Glu Ser Val Asp Gly Ala Asp

290 295 300

Leu Glu Asn Val Thr Ile Ser Asn Ile Thr Met Arg Asp Ile Val Asn

305 310 315 320

Met Pro Ile Phe Ile Arg Leu Gly Ala Arg Leu Arg Gly Pro Glu Gly

325 330 335

Thr Gln Pro Gly His Ile Arg Lys Val Ser Ile Ser His Ile Val Val

340 345 350

Tyr Ser Ser Ala Ser Arg Ala Ala Ser Thr Ile Ser Gly Ile Pro Gly

355 360 365

His Asp Ile Glu Asp Val Thr Leu Ser Asp Met Gln Ile Phe Leu Glu

370 375 380

Gly Gly Gly Thr Thr Glu Gln Ala Ala Ile Asn Pro Pro Glu Lys Glu

385 390 395 400

Asn Ala Tyr Pro Glu Pro Thr Met Phe Gly Thr Leu Pro Cys Tyr Gly

405 410 415

Phe Tyr Ile Arg His Ala Lys Asn Ile Ala Ile Asn Asn Ile Gln Ile

420 425 430

Tyr Thr Asn Lys Lys Asp Glu Arg Pro Ala Ile Gln Thr Asp Asp Val

435 440 445

Lys Asn Val Gln Phe Arg Phe Leu Asp Leu Pro Glu Asp Asn Pro Lys

450 455 460

Pro Tyr Phe His Phe Ile Arg Thr Asn Asn Ile Glu Ile Leu His Cys

465 470 475 480

Thr Asn Thr Lys Asp Glu Leu Ile Ala Thr Thr Glu Asp Glu Lys Arg

485 490 495

Gly His His His His His His

500

Claims

1.一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述嗜热外切聚半乳糖醛酸酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组表达载体，通过向表达载体中插入SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的功能片段制得。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pPIC9K。

5.一种重组细胞，向宿主菌中转化上述重组表达载体或表达上述嗜热外切聚半乳糖醛酸酶制得。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述宿主菌为毕赤酵母。

7.权利要求1所述嗜热外切聚半乳糖醛酸酶在70～80℃的环境下裂解α-1,4-糖苷键反应中的应用。

8.一种嗜热外切聚半乳糖醛酸酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

PG-F1：5'-GAATTCATGCACCCAGTCTACACTAACC-3'，含EcoRⅠ酶切位点

PG-R1：5'-GCGGCCGCTTAATGATGGTGGTGATGATGACCTC-3'，含NotⅠ酶切位点

(2)将步骤(1)制得的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，然后与同样经限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的质粒pPIC9K进行连接，制得重组质粒pPIC9K-PG；

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：

10×扩增缓冲液5μl、浓度800μmol/L dNTP 2μl、上游引物10～100pmol、下游引物10～100pmol、模板DNA 0.2μg、Taq DNA聚合酶2.5U，加ddH₂O水补齐50μl。

PCR扩增程序如下：

优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增后还包括将PCR产物与pUCm-T连接，转化大肠杆菌JM109，酶切测序的过程。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，连接采用T4DNA连接酶。