KR20040082060A - 효모변이주 아이에스투 유래 수용성 글루칸 올리고머를함유하는 면역활성용 또는 암질환 예방 및 치료용 조성물,및 이의 제조방법 - Google Patents

효모변이주 아이에스투 유래 수용성 글루칸 올리고머를함유하는 면역활성용 또는 암질환 예방 및 치료용 조성물,및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효모 돌연변이 균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)IS2 (KCTC0959BP) 유래의 수용성 글루칸 올리고머(soluble glucan oligomer), 이의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 면역활성 촉진 및 항암용 약학조성물에 관한 것으로, 생산된 수용성 글루칸 올리고머는 면역세포의 수를 증가시키고, NO 생성능과 대식세포의 탐식능을 현저히 향상시키는 등 면역활성을 촉진시키는 한편, 다양한 암세포에 대한 시험관내 실험에서 탁월한 증식억제 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명의 수용성 글루칸 올리고머는 면역저하로 인한 질환 및 암질환을 위한 의약품 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

Description

효모변이주 아이에스투 유래 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 면역활성용 또는 암질환 예방 및 치료용 조성물, 및 이의 제조방법{Composition comprising soluble glucan oligomer from Saccharomyces cerevisiae IS2 for immune activation or prevention and treatment of cancer and the preparation method thereof}
본 발명은 효모 유래 수용성 글루칸 올리고머(soluble glucan oligomer), 이를 함유하는 면역활성 촉진 및 항암용 약학조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
베타글루칸은 효모 뿐만 아니라 미생물, 버섯, 곡류, 조류 등으로부터 분리되어 다양한 형태의 제품으로 사용되고 있으며, 특히 효모세포벽 유래의 베타글루칸이 가장 잘 연구되어 있다. 효모는 미국 FDA에서 GRAS (Generally Recognized As Safe)로 분류되어 식품 및 다양한 분야에서 사용되는 미생물로서 세포내측은 주성분의 베타 1,3 과 1,6 글루칸, 및 소량의 키틴과 만노단백질(mannoprotein)로 되어 있으며, 외측은 만난(mannan)이 단백질과 연결되어 있는 만노단백질로 이루어진 세포벽을 가지고 있다. 효모세포벽의 주성분인 베타글루칸은 대식세포의 활성화와 증식촉진에 따른 항원 특이적 면역반응 증가가 보고되고 있으며 진균, 세균, 바이러스등의 다양한 감염원에 대한 저항성을 높이는 것이 증명되었고, 외상 시 관찰되는 면역기능 저하도 억제하는 것으로 보고되며, 또한 숙주의 암 또는 암의 전이에 대한 저항성도 증가시키는 것으로 알려져 있다(Abel, G. and Czop, J. K.,Int. J. Immunophamacol.,14, pp1363-1373, 1992; Babineau, et al.,220(5), pp601-609, 1994; Benach J. L., et al.,Infection and Immunity,35(3), pp947-951, 1982; Di Renzo, L., et al.,Eur. J. Immunol.,21, pp1755-1758, 1991; Fukase, S., et al.,Cancer Res.,47, pp4842-4847, 1987; Janusz, M. J., et al.,J. Immun.,142, pp959-965, 1989; Olsen, E, J., et al.,J. Immun.,64, pp3548-3554,1996, Sakurai, T., et al.,Int. J. Immunopharmacol.,14, pp821-830, 1992; Czop, J. K., et al.,Prog. Clin. Biol. Res.,297, pp287-296, 1989).
효모의 베타글루칸은 불용성(water insoluble) 다당체로서 흡수율을 높이기 위해서는 불용성 입자의 크기를 매우 미세하게 제조하는 방법(Donzis, Byron A., 1996, Substantially purified beta (1,3) finely ground yeast cell wall glucan composition with dermatological and nutritional uses. US patent 5,576,015)과 용해도를 증가시키기 위한 화학적 수식을 도입하는 방법 (DiLuzio; Nicholas R., 1989, Soluble phosphorylated glucan. US patent 4,877,777), 유기용매를 이용하여 글루칸을 추출한 후 글루칸의 기본구조인 베타-1,3-글루코스(β-1,3-D-glucose) 구조를 분해할 수 있는 효소인 베타글루카나제 혹은 셀룰라아제 등을 처리하여 수용성 입자를 만드는 방법(Jamas, Spiros, Rha, ChoKyun, Sinskey, Anthony J.,1991, Glucan composition and process for preparation thereof. US patent 5,037,972; Lehmann, Joachim, Kunze, Rudolf, 2000, Water-soluble low molecular weight beta-glucans for modulating immunological responses in mammalian system. US patent 6,143,883) 등이 널리 사용되고 있다.
이에, 본 발명자는 효모변이주 IS2의 세포벽으로부터 불용성 베타글루칸을 추출한 후, 베타글루칸을 분해하여 분자량이 50,000 이하이고, 바람직하게는 분자량이 1,000 내지 10,000 사이의 수용성 글루칸 올리고머를 생산하고, 생산된 수용성 글루칸 올리고머가 면역활성 촉진과 암세포 증식억제에 탁월한 효능을 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 효모 변이주 IS2(KCTC 0959BP)로부터 수용성 글루칸 올리고머 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 면역촉진용 및 항암용 약학조성물을 제공한다.
도 1 은 수용성 글루칸 올리고머를 복강주사하였을 때, 마우스의 면역세포의 NO 생산능에 미치는 영향을 나타낸 것이고,
도 2 는 수용성 글루칸 올리고머를 마우스에 복강주사하였을 때, 비장세포내 IL-2 생산에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 3 은 마우스 골수 유래의 IL-3 의존성 LyD9 세포주에 대한 수용성 글루칸 올리고머의 세포증식 억제 효과를 나타낸 도이고,
도 4 는 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포주에 대한 수용성 글루칸 올리고머의 세포증식 억제 효과를 나타낸 도이고,
도 5 는 마우스 T 림프종 세포주인 EL4 세포주에 대한 수용성 글루칸 올리고머의 세포증식 억제 효과를 나타낸 도이고,
도 6 은 인간 T 림프종 세포주인 Jurkat 세포주에 대한 수용성 글루칸 올리고머의 세포증식 억제 효과를 나타낸 도이고,
도 7 은 인간 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포주에 대한 수용성 글루칸 올리고머의 세포증식 억제 효과를 나타낸 도이며,
도 8 은 인간 위장암 세포주 KATO3에 대한 수용성 글루칸 올리고머의 세포성장 억제 효과를 나타낸 도이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모변이주(KCTC 0959BP) 세포벽 유래의 불용성 베타글루칸을 효소로 처리하여 얻어진 면역활성을 촉진시키고 암세포 증식억제에 효능이 탁월한 수용성 글루칸 올리고머를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 변이주 IS2(KCTC 0959BP)를 접종용 액체배지에서 배양하는 제 1단계; (b) 상기 효모배양액을 액체배지에 접종하여 유가배양한 후 원심분리로 효모를 수득하는 제 2 단계; (c) 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 효모 IS2 세포벽으로부터 베타글루칸을 추출하는 제 3 단계; (d) 추출한 베타글루칸을 베타글루칸 분해효소와 반응시킨 후 여과하여 수용성 글루칸 올리고머를 생산하는 제 4 단계; 및 (e) 상기 수용성 글루칸 올리고머를 동결건조하여 건조분말을 수득하는 제 5 단계로 이루어진 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 글루칸 올리고머의 제조방법을 제공한다.
상기 효모 변이주 IS2는 돌연변이에 의해 면역활성촉진기능이 향상된 효모변이주이다.
상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 효모 변이주(KCTC 0959BP) 유래 수용성 글루칸 올리고머는 분자량이 50,000 이하이고, 바람직하게는 분자량이 1,000 내지 10,000이다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 효모 유래 수용성 글루칸 올리고머를 유효성분으로 함유하는 면역저하로 인한 질환 또는 암질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 효모 유래 수용성 글루칸 올리고머는,
(a) 효모 IS2(KCTC 0959BP)를 포도당 0.5 내지 10 w/v%, 효모추출물 0.1 내지 5 w/v% 및 펩톤 0.1 내지 10 w/v%을 함유하는 접종용 액체배지에서 배양하는 제1 단계;
(b) 상기 1단계의 효모배양액을 접종원으로 포도당 0.5 내지 10 w/v%, 효모추출물 0.1 내지 5 w/v%, 황산암모늄 0.01 내지 2w/v%, 이인산칼륨 0.001 내지 1 w/v% 및 황산마그네슘 0.001 내지 1 w/v%를 함유하고, pH가 5.0 내지 6.0인 초기 액체배지에 0.1 내지 10%(v/v)의 양으로 접종한 후, 온도 30℃, 회전수 100 내지 400rpm, 통기량 0.3 내지 3vvm의 조건으로 12시간 내지 48시간동안 배양하면서, 포도당 0.5 내지 10 w/v%, 효모추출물 0.1 내지 5 w/v%, 황산암모늄 0.01 내지 2w/v%, 이인산칼륨 0.001 내지 1 w/v% 및 황산마그네슘 0.001 내지 1 w/v%을 함유하는 성장배지를 사용하여 유가배양한 후, 원심분리하여 효모를 수득하는 제 2 단계;
(c) 상기 제 2단계에서 수득한 효모에 1 내지 10%의 수산화나트륨 용액을 첨가하여 분산시키고, 70 내지 100℃에서 30분 내지 5시간동안 반응시킨 다음 원심분리하여 고형성분을 수득하는 과정을 1회 내지 5회 반복수행한 후, 수득된 고형성분을 염산 및 황산과 같은 강산을 사용하여 pH 4.0 내지 5.0이 되도록 적정하고, 다시 수산화나트륨 용액에 분산시킨 후, 다시 75℃에서 1시간동안 반응시킨 후 원심분리하여 수산화나트륨 용액과 고형성분을 분리하고, 고형성분을 1회 내지 5회에 걸쳐 증류수로 세척하여 효모 IS2 세포벽으로부터 함수 베타글루칸을 추출하는 제 3단계;
(d) 상기 제 3단계에서 추출한 함수 베타글루칸에 1배 내지 10배의 증류수 및 함수 베타글루칸 무게의 1/20 내지 1/5 부피에 해당하는 베타글루칸 분해효소를첨가한 후, 30 내지 80℃에서 6 내지 24시간 반응시킨 후, 반응이 종료되면 원심분리하여 상등액만을 회수하고, 회수한 상등액을 한외여과막에서 걸러, 50,000 이하의 분자량을 가지는 글루칸 올리고머만을 포함하는 액상을 수득하는 제 4단계; 및
(e) 얻어진 액상을 -70℃ 이하에서 12시간 내지 48시간 방치한 후, 동결건조하여 수용성 글루칸 올리고머 건조분말을 수득하는 제 5단계로 이루어진 제조공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 글루칸 올리고머의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 제법으로 제조된 효모 돌연변이 균주인 IS2(KCTC 0959BP) 유래 수용성 글루칸 올리고머를 제공한다.
본 발명은 상기 제법으로 제조된 수용성 글루칸 올리고머를 유효성분으로 함유하는 면역활성 및 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 제법으로 제조된 수용성 글루칸 올리고머를 유효성분으로 함유하는 면역저하질환 및 면역저하로 인한 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 면역저하로 인한 질환에 면역증강 또는 면역활성용으로 사용될 수 있으며, 상기 면역저하로 인한 질환은 세균이나 바이러스에 의한 감염성 질환을 포함한다.
본 발명은 상기 제법으로 제조된 수용성 글루칸 올리고머를 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암질환은 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종이 있으며, 본 발명의 약학조성물을 암의 치료에 사용할 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 수용성 글루칸 올리고머를 함유하는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 수용성 글루칸 올리고머를 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 수용성 글루칸 올리고머를 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 수용성 글루칸 올리고머의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 분획물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 수용성 글루칸 올리고머를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 수용성 글루칸 올리고머를 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 수용성 글루칸 올리고머에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 수용성 글루칸 올리고머의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 수용성 글루칸 올리고머의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 수용성 글루칸 올리고머는 기타 식품의 주, 부원료 및 식품첨가제로서 사용이 가능하다.
또한 본 발명은 수용성 글루칸 올리고머 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 면역증강 및 암질환 예방을 위한 건강기능성식품을 제공한다.
본 발명의 수용성 글루칸 올리고머를 포함하는 조성물은 면역증강 및 암질환 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 수용성 글루칸 올리고머을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명의 수용성 글루칸 올리고머 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명의 상기 수용성 글루칸 올리고머는 면역증강 및 암질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 필수 성분으로서 상기 수용성 글루칸 올리고머을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예 1 : 효모변이주 IS2의 배양 및 수확
초기배지는 포도당(glucose) 10 g/ℓ, 효모추출물(yeast extract) 6 g/ℓ, 황산암모늄((NH4)2SO4) 3 g/ℓ, 이인산 칼륨(K2HPO4) 1.5 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO4ㆍ 7H2O) 0.5 g/ℓ의 조성을 가진 액체배양액을 사용하였다.
접종을 위한 접종원의 배양액은 액상 YPD 배지(포도당 20 g/ℓ, 효모추출물 10 g/ℓ, 펩톤(peptone) 20 g/ℓ)를 사용하였고, 성장배지는 포도당 400 g/ℓ, 효모추출물 30 g/ℓ, 황산암모늄 40 g/ℓ, 이인산칼륨 15 g/ℓ, 황산마그네슘 5.7 g/ℓ의 조성을 가진 액체배양액을 사용하였다..
성장배지 2 ℓ를 5 ℓ 발효조에 넣어 살균한 후, 효모변이주 IS2(KCTC 0959BP) 접종원(seed) 100 ㎖을 접종하고, 회전속도 300 rpm, 통기량 1 vvm, 배양온도 30℃, pH 5.5에서 회분식으로 배양한 후, 성장배지를 공급하는 유가배양을 통해 50-55 g/ℓ에 해당하는 효모균체(DCW, dried cell mass)를 수득하였다.
실시예 2 : 효모변이주 IS2로부터 베타글루칸의 추출
상기 실시예 1에서 얻어진 효모균체 80 g을 4% 수산화나트륨(NaOH) 1,000 ㎖에 분산시킨 후, 95℃에서 1시간동안 반응시켰다. 2,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 수산화나트륨 용액과 고형성분을 분리하였다. 분리된 고형성분을 3% 수산화나트륨 용액 2,000 ㎖에 분산시킨 후, 75℃에서 3시간동안 반응시켰다. 2,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 수산화나트륨 용액과 고형성분을 분리하였다. 수확된 고형성분을 염산을 사용하여 pH 4.5가 되도록 적정하고, 최종부피 2,000 ㎖에 분산시킨 후, 다시 75℃에서 1시간동안 반응시켰다. 2,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 수산화나트륨 용액과 고형성분을 분리하고, 고형성분을 3번에 걸쳐 증류수로 세척하여 효모변이주의 세포벽으로부터 160 g의 함수 베타글루칸(wet β-glucan)을 추출하였다.
실시예 3 : 효모변이주 IS2 유래의 베타글루칸으로부터 수용성 글루칸 올리고머의 생산
상기 실시예 2에서 얻어진 160 g의 함수 베타글루칸을 1,000 ㎖ 유리용기에 넣고 480 ㎖의 증류수와 함수 베타글루칸 무게의 1/10 부피에 해당하는 베타글루칸 분해효소(β-glucanase, Novozyme사)를 첨가한 후 40℃에서 15시간 반응시켰다. 반응이 종료되면 7,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상등액만을 회수하고, 회수한 상등액을 한외여과막(Filtron사, MWCO 10K)에서 걸러, 반응시 사용했던 효소를 제거하고 10,000(dalton) 이하의 분자량을 가지는 글루칸 올리고머만을 포함하는 액상을 수득하였다. 얻어진 액상을 -74℃에서 하루 방치한 후 동결건조하여 수용성 글루칸 올리고머 파우더 5.8 g을 수확하였다.
실험예 1 : 수용성 글루칸 올리고머의 NO(Nitric Oxide) 생산능 실험
상기 실시예 3에서 수확된 수용성 글루칸 올리고머를 인산완충액(PBS , 2.56 g/ℓ NaH2PO4.H2O, 22.5 g/ℓ Na2HPO4.7H2O, 87.9 g/ℓ NaCl, pH 7.2)에 5 mg/㎖의 농도로 녹여 0.2 ㎖ 취한 후, 5-6주령의 수컷 C57BL/6계 마우스((주)바이오링크)의 복강에 투여하였다.
본 실험예 및 하기 실험예의 대조군에는, 야생효모인 KCTC 7911 균주로부터 상기 실시예 1 내지 3의 방법에 따라 수득된 수용성 글루칸 올리고머를 제조하여, 각 실험예에서의 투여방법과 동일한 방법으로 투여하였다.
투여 3일 후, 복강주사한 마우스로부터 비장을 채취하여 행크스 용액(Hank's blanced salt solution, 0.185g/ℓ Calcium Chloride.2H2O, 0.09767g/ℓ MgSO4(anhydrous), 0.4g/ℓ Potassium Chloride, 0.06g/ℓ Potassium Phosphate Monobasic (anhydrous), 0.8g/ℓ Sodium Chloride, 0.04788g/ℓ Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous), 1.0g/ℓ D-Glucose, 0.011g/ℓ Phenol Red.Na, 0.35g/ℓ Sodium Bicarbonate, pH 7.0)에서 멸균된 망으로 부드럽게 림프구를 유리시켰다. 포함된 적혈구는 염화암모늄(NH4Cl)처리를 하여 제거하며, 분리된 림프구는 완전배지에 부유시켰다.
복강 대식세포는 갈리일 등의 방법(Gallily, R., and M. Feldman.,Immunology 12, p197, 1967)에 따라 분리하였다. 마우스의 복강내에 시료를 주사한 3일 후 행크스 용액을 이용하여 체취하였으며, 체취한 세포는 완전배지에 부유시켰다. 부유시킨 복강대식세포를 세포 배양판에 2×105세포/㎖의 세포농도가 되도록 재부유하여 Con A(5 ㎍/㎖)와 LPS(1 ㎍/㎖)의 자극하에 20시간 배양한 후 배양 상등액 내의 NO(nitric oxide)를 측정하였다. NO(nitric oxide)는 공기중에서 쉽게 안정성이 있는 아질산염(nitrite)로 산화되기 때문에 이 아질산염을 그리즈(grease) 반응으로 측정하였다. 0.1 ㎖의 배양 상등액에 1% 설파닐아마이드(1% sulfanilamide in 30% acetic acid)와 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아민 디히드로클로라이드(N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride in 60% acetic acid) 혼합액 0.1 ㎖을 가하여 실온에서 방치하고, 20분 후 ELISA 판독기를 사용하여 550nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
NO 생산능의 측정결과 야생효모인 KCTC 7911과 효모변이주 IS2의 수용성 글루칸 올리고머를 주사하였을 때 음성대조구인 PBS에 비해 NO 생산능이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, KCTC 7911보다 IS2의 수용성 글루칸 올리고머를 주사하였을 때 더 높은 수치의 NO 생산능이 측정되어 면역세포의 활성에 더욱 긍정적인 영향을 주는 것으로 확인되었다(도 1 참조).
도 1은 수용성 글루칸 올리고머를 복강주사하였을 때, 마우스의 면역세포의 NO 생산능에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
실험예 2 : 수용성 글루칸 올리고머의 IL-2 생산능 실험
상기 실시예 3에서 수확된 수용성 글루칸 올리고머를 복강 주사한 마우스로부터 채취한 비장을 멸균된 망을 사용하여 림프구를 적출하였다. 림프구 적출시 포함된 적혈구는 NH4Cl 처리를 하여 제거하고 분리된 림프구는 완전배지에 부유시켰다. 채취한 세포를 2×105세포/㎖의 세포가 되도록 부유하여 편평한 바닥을 가진 96 웰 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고 ConA(Sigma사)로 자극 총량이 0.2 ㎖이 되도록 조정한 후, 37℃, 5% CO2항온반응기에 넣어 48시간 동안 배양하였다. ConA 자극 후 분비된 IL-2의 양을 IL-2 ELISA 키트(Endogen사)를 사용하여 측정하였다. 24시간동안 항 IL-2 항체(Bacton Dikinson사)를 96 웰 플레이트에 부착시킨 뒤 세척하고 여기에 검체 0.1㎖을 넣고 1시간동안 96 웰 플레이트에서 반응시켰다, 트윈 20(Tween 20)이 10% 되게 첨가된 인산완충용액(PBS)으로 세척한 후 탐지 항체(detection Ab)를 반응시키고 다시 세척한 다음 스트렙트아비딘-HRP(streptavidin-HRP)를 처리하여 실온에서 1시간 정도 반응시킨 후 세척하였다. TMB 기질(Bacton Dikinson사)을 첨가한 후 반응종료액(stop solution)을 넣고 실온에서 30분 정도 방치하여 반응을 정지시킨 후, 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
대조군인 KCTC 7911 유래의 수용성 글루칸 올리고머를 투여하였을때는 Con A의 자극에도 IL-2의 생성에 변화가 없었으나 효모변이주 IS2 유래의 수용성 글루칸 올리고머을 투여하여 Con A로 자극을 주었을 때 복강대식세포로부터 IL-12 생산을 증진시키는 결과를 확인할 수 있었다(도 2 참조). 도 2는 수용성 글루칸 올리고머를 마우스에 복강주사하였을 때, 비장세포내 IL-2 생산에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
이상의 NO 생산능과 IL-2 생산능 확인 결과에 의하면, 효모변이주 IS2 유래의 수용성 글루칸 올리고머에 의해 대식세포를 비롯한 면역활성과 관련된 세포들의 기능이 촉진됨을 확인할 수 있었다.
실험예 3 : 수용성 글루칸 올리고머의 암세포 증식억제능력 실험
MTT 검색법은 투여된 시료가 세포의 증식촉진 또는 억제효과가 있을 경우 세포의 생존율이 증가하거나 감소하게 되는데 시료중 살아있는 세포들만이 세포내의 효소작용에 의해 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)의 환원으로 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 생성하게 된다. 이때 생성된 포르마잔 크리스탈의 양을 흡광도로 측정하여 세포의 생존율을 측정하여 세포의 증식이 얼마나 촉진되었는지 혹은 억제되었지를 측정하는 방법으로 흡광도의 증가는 생존세포의 증가 혹은 활성화의 결과이며, 반대로 흡광도의 감소는 세포증식이 억제되었음을 의미하는 것이다.
실험에 사용한 세포주들로는 마우스 골수 유래의 IL-3 의존성 조혈모세포주(haematopoietic stem cell line)인 LyD9 세포주, 마우스 대식세포주(mouse macrophage cell line)인 Raw264.7 세포주, 마우스 T 림프종 세포주(mouse T lymphoma cell line)인 EL4 세포주, 인간 T 림프종 세포주(human T lymphoma cell line)인 Jurkat 세포주, 인간 자궁경부암 세포주(human cervicalcarinoma cell line)인 HeLa 세포주, 인간 위장암 세포주 KATO3 세포주를 사용하였으며, 표기된 농도의 시료를 넣고 44시간동안 배양한 후 MTT를 넣고 세포의 활성도를 측정하였다.
암세포를 편평한 바닥을 가진 96 웰 플레이트의 한 웰에 2×105세포/㎖의 농도로 들어가도록 조정하였다. 상기 실시예 3에서 수확된 수용성 글루칸 올리고머는 농도별(0.5 내지 5mg/㎖로 처리)로 조정하여 배양 초기에 첨가하고 완전배지를 이용하여 37℃에서 5% CO2항온반응기에서 48시간 배양하였다. 살아 있는 세포의 활성도는 MTT 방법을 이용하여 측정하였다. 배양이 종료되기 4시간 전에 암세포가 배양되고 있는 각각의 웰에 MTT 시약을 첨가하고, 이소프로판올(isopropanol)에 염산이 최종농도 0.04 N로 첨가된 용액 100 ㎕를 넣고 약 20분간 실온에서 혼합한 후, ELISA 판독기를 사용하여 550nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과에 따르면 수용성 글루칸 올리고머의 암세포 증식억제 능력은 인간 위장암 세포주 KATO3 외의 모든 암세포주들에서 탁월한 효능을 나타냈으며, 특히 KCTC 7911유래의 수용성 글루칸 올리고머에 비해 효모변이주 IS2 유래의 수용성 글루칸 올리고머를 투여하였을 때 암세포 억제능력이 극대화됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 실험에 사용된 대부분의 암세포주들에서 효모변이주 수용성 글루칸 올리고머의 적정농도는 2.5 - 5.0 mg 정도로 예상되며, 동일한 농도의 KCTC 7911 유래의 수용성 글루칸 올리고머의 억제능력에 비해 암세포주에 따라 차이는 있지만 약 2배에서 6.6배 정도 더 뛰어난 효능을 보였다 (도 3 내지 8 참조).
실험예 4. 효모 IS2 유래 수용성 글루칸 올리고머를 이용한 동물실험
실시예 3에서 제조된 수용성 글루칸 올리고머의 독성을 확인하기 위하여 동물실험을 실시하였다.
ICR계 마우스(서울대학교 실험동물센터)와 5주령의 스프라그 도울리 (Sprague Dawley: SD)계 250 내지 300g 정도의 수컷을 각각 10 마리씩 4군으로 나눈 다음, 본 발명의 수용성 글루칸 올리고머를 생물학적 유효 농도보다 20배 높은 4g/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구 투여 후, 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다.
본 발명의 수용성 글루칸 올리고머는 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
제제예 1. 주사제제의 제조
실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머 100 ㎎
소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎
메틸파라벤 0.8 ㎎
프로필파라벤 0.1 ㎎
주사용 멸균증류수 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머 200 ㎎
유당 100 ㎎
전분 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 적량
통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캡슐제의 제조
실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머 100 ㎎
유당 50 ㎎
전분 50 ㎎
탈크 2 ㎎
스테아린산마그네슘 적량
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 액제의 제조
실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머 1000 ㎎
설탕 20 g
이성화당 20 g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 5. 건강식품의 제조
실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 6. 건강 음료의 제조
실시예 3의 수용성 글루칸 올리고머 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 효모변이주 IS2 세포벽 유래의 불용성 베타글루칸을 상업적 사용이 가능한 베타글루칸 분해효소를 처리하여 분자량이 1,000에서 10,000사이의 수용성 글루칸 올리고머를 생산하였으며, 생산된 수용성 글루칸 올리고머가 면역활성 촉진과 암세포 성장억제에 탁월한 효능을 보임을 확인하여, 본 발명의 수용성 글루칸 올리고머는 면역증강제 및 암질환의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 면역활성촉진 및 암세포 증식억제 효능을 갖는 효모 IS2(KCTC 0959BP) 유래 수용성 글루칸 올리고머.
  2. (a) 효모 (Saccharomyces cerevisiae) IS2 (KCTC 0959BP)를 접종용 액체배지에서 배양하는 제 1단계; (b) 상기 효모배양액을 액체배지에 접종하여 유가배양한 후 원심분리로 효모를 수득하는 제 2 단계; (c) 수산화나트륨을 첨가하여 효모 IS2 세포벽으로부터 베타글루칸을 추출하는 제 3 단계; (d) 추출한 베타글루칸을 베타글루칸 분해효소와 반응시킨 후 여과하여 수용성 글루칸 올리고머를 생산하는 제 4 단계; 및 (e) 상기 수용성 글루칸 올리고머를 동결건조하여 건조분말을 수득하는 제 5 단계로 이루어진 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자량이 50,000이하인 수용성 글루칸 올리고머의 제조방법.
  3. 제 2항의 제조방법에 의해 제조된 효모 IS2 유래 수용성 글루칸 올리고머를 유효성분으로 함유하는 면역저하질환 및 면역저하로 인한 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
  4. 제 2항의 제조방법에 의해 제조된 효모 IS2 유래 수용성 글루칸 올리고머를 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 암질환은 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 하나이상 선택되는 것인 약학조성물.
  6. 면역증강 또는 암질환 예방을 위한 효모 IS2 (KCTC 0959BP) 유래 수용성 글루칸 올리고머 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품.
KR10-2003-0016665A 2003-03-18 2003-03-18 효모변이주 아이에스투 유래 수용성 글루칸 올리고머를함유하는 면역활성용 또는 암질환 예방 및 치료용 조성물,및 이의 제조방법 KR100457270B1 (ko)

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