KR101727251B1

KR101727251B1 - 녹조류 유래 다당류 분해능을 갖는 슈도모나스 제니귤라타 균주 ｋｃｔｃ12651ｂｐ

Info

Publication number: KR101727251B1
Application number: KR1020150071147A
Authority: KR
Inventors: 박용일; 하산 술리만 시마; 정미경; 김우중
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-05-21
Publication date: 2017-04-17
Also published as: KR20160137788A

Abstract

본 발명은 녹조류(green algae) 유래 다당류 분해능을 갖는 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata) 균주 KCTC12651BP 및 이의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 녹조류 유래 다당류를 다양한 생리 활성을 갖는 올리고당으로 분해할 수 있고, 생성된 올리고당은 식품, 화장품, 의약품 및 공업 원료 등 다양한 산업에 적용될 수 있다.

Description

녹조류 유래 다당류 분해능을 갖는 슈도모나스 제니귤라타 균주 ＫＣＴＣ12651ＢＰ{Pseudomonas geniculata KCTC12651BP having the Ability to Degrade Green Algae derived Polysaccharides}

본 발명은 녹조류 유래 다당류 분해능을 갖는 슈도모나스 제니귤라타 균주 ＫＣＴＣ12651ＢＰ에 관한 것이다.

해조류는 특유의 대사양식을 가지고 있어서 육상 자원식물과는 다른 새로운 생리활성 물질을 보유하고 있으며, 한국과 일본, 중국 등 동양에서는 오래 전부터 식용으로 이용해 왔다. 반면에 서양에서는 화학원료로서 해조류를 사용하였으며 이에 대한 연구도 상당히 진행되었다(Shimizu, 1978. Chemical and biological perspectives. In Marine Natural Products. Academic Press, New York, p. 1; Kobayashi 와 Ishibashi, 1993. Bioactive metabolites of symbiotic marine microorganism. Chem. Rev. 93, 1753).

해조류를 구성하고 있는 주요 성분은 다당류로 해조류 유래 기능성소재로서 대표적인 해조류 다당류로는 알긴산(alginic acid), 카라기난(carrageenan), 한천 (agar) 및 푸코이단(fucoidan) 등이 있다. 이들 해조류 유래 다당류는 음식, 화장품, 의학 및 공업 원료 등으로 다양하게 이용될 뿐만 아니라 근래 들어 건강과 웰빙에 대한 관심이 깊어지면서 생체조절기능을 가진 다기능성 올리고당의 소재로도 각광받고 있다(김 등, 2011. 해양 미생물 유래 해조 다당류 분해 효소의 특성 및 산업적 응용. Korean J. Microbiol. biotechnol. 39, 189-199). 현재까지 해조류 유래 다당류가 항암, 항산화, 항균 및 항바이러스활성이 있다는 연구 보고 외에 심근경색, 동맥경화 및 고혈압 등의 예방효과도 있는 것으로 알려졌다 (Nagayama 등, 2002. Bactericidal activity of phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome. J. Antimicrob. Chemother. 50, 889-893). 이렇게 해조류에서 유래된 다당류가 다양한 생리활성을 지니고 있음이 밝혀짐에 따라 최근 해조류에서 추출한 다당류의 생리활성 효과에 대한 연구가 많이 수행되고 있다.

매생이 (Capsosiphon fulvescens)는 녹조식물문(Chlorophyta) 갈파래목 갈파래과 매생이 속에 속하는 녹조식물로 전 세계에 분포하며 우리나라에서는 남해안 청정해역의 조간대 상부바위에서 서식한다. 매년 12월에서 2월까지만 생산되는 식품으로 특유한 향기와 맛을 지니고 있어 오래 전부터 식용으로 애용되어 왔다. 초창기 매생이에 대한 연구는 종의 분류학적 기재 및 번식, 생태 및 생활사, 분포, 형태 및 분류, 인공채묘 등 기초 생물학적인 연구가 주로 이루어졌으나 이후에 이화학적 성분 및 유용성분, 매생이 추출물의 효능에 대한 연구가 많이 수행되고 있다(양 등, 2005. 매생이의 이화학적 성분. 한국식품과학회지, 37. 912-917; Chung 등, 2005. Changes of food components in Mesangi (Caqpsosiphon fulvecense), Gashiparae (Enteromorpha prolifera), and Cheonggak (Codium fragile) depending on harvest times. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 34, 687-693; Bae 등, 2012. Biological analysis of enzymatic extracts from Capsosiphon fulvescens using the Microbulbifer sp AJ-3 marine bacterium. J Life Science 22, 627-633).

매생이 추출물을 이용한 연구에서 매생이 추출물이 혈소판 응집을 억제하고 총콜레스테롤을 감소시켜 심혈관계 질환에 유효하다는 보고가 있었으며(박과 김, 2005, 매생이 추출물이 난소를 절제한 흰쥐의 혈소판 응집과 혈청 내 지질 조성에 미치는 영향. J Life Science, 15, 1028-1033; 이 등, 2006. 매생이 추출물이 고콜레스테롤 식이를 급여한 흰쥐의 지질대사에 미치는 영향. 한국식품영양과학회지, 35, 402-409; Kwon and Nam, 2006. Effects of Mesangi(Capsosiphon fulvecens) powder on lipid metabolism in high cholesterol fed rats. J. korean Soc. Food Sci. Nutr. 35, 530-535), 또한 매생이 열수추출물을 이용한 면역 및 항암 활성 연구에서 장관면역 활성 및 마우스 육종 세포의 억제 효과 등이 관찰되었다(Park 등, 2006. Immunostimulating and anticancer activities of hot water extract from Capsosiphon fulvescens. J Korean Soc. Appl. biol. Chem 49, 343-348). 매생이에서 추출한 당단백질을 이용한 실험에서는 위암세포주에서 아폽토시스를 유발하여 세포 증식 억제 및 항암효과를 가진다는 것이 확인되었다(김 등, 2011. 매생이 당단백질에 의한 인간 위암세포 사멸기전. Kor J Fish Aquat Sci 44, 216-224). 그 외 매생이 열수 추출물과 에탄올 추출물의 항산화능, 혈압 및 혈당 강화효능, 미용효과, 골다공증, 숙취해소 등에 대한 연구를 통해 매생이를 활용한 기능성 소재를 개발하려는 시도가 이뤄지고 있다(문 등, 2005. 매생이 추출물의 멜라닌 생성 억제효과. 약학회지 49. 375-379; Park 및 Kim, 2006. Effect of Capsosiphon fulvecense extract on collagen content of connective tissues in ovariectomized rats. J Life Science 16, 1219-1224; Cho 등, 2011. Inhibitory effects of Maesaengi extracts on angiotensisn converting enzyme and a-glucosidase. J Life Science. 21, 811-818).

매생이에서 추출한 다당류를 이용한 생리적 활성 효능에 관련된 출원 및 등록 특허들을 살펴보면 다음과 같다. 대한민국 등록특허 제10-0714221호에서는 매생이를 급속 동결건조한 후 분쇄한 고형분을 물에 침지하여 추출한 뒤 알코올로 침전시켜 얻은 매생이 조다당 추출물이 항암효과가 있다고 하였고, 대한민국 등록특허 제10-0808129호에서는 매생이를 동결건조한 뒤 분쇄하여 제조된 고형분이 혈중 중성지질과 콜레스테롤을 저하시켜 고지혈증 개선용 식품에 응용될 수 있다는 점을 설명하고 있다. 아울러, 대한민국 등록특허 제10-0832520호에서는 매생이를 동결건조하고 분쇄한 뒤 에탄올을 이용하여 추출해서 얻은 조-추출액을 감압 농축, 동결 건조시킨 분말 형태의 매생이 추출물이 알카라인 포스파타제의 화성을 억제할 뿐만 아니라, 콜라겐과 콜라겐 가교물질인 피리디놀린 및 디옥시피리디놀린의 연골 중의 함량을 증가시킴으로써 특히 여성의 폐경기성 골다공증의 치료 또는 예방에 효과가 있다고 하였다. 대한민국 등록특허 제 10-0842941호에서는 매생이를 동결건조 및 분쇄한 뒤에 물에 침지시켜 열수 추출한 뒤 에탄올을 가하여 침전된 다당류로서 자일로즈와 람노우즈를 주성분으로 하는 다당류가 알코올에 의한 위장점막 손상을 억제한다고 보고하였다.

상기 매생이의 생리적 활성 효능과 관련한 연구들은 모두 열수추출 또는 에탄올 추출에 의해서 획득한 매생이 유래 고분자 다당류를 이용한 것들이다.

매생이 유래 다당류에서 생산된 올리고당에 관한 것으로는 상업적으로 판매되고 있는 당분해효소(viscozyme, celluclast, pectinex, lysing enzyme)와 단백질 분해효소(alcalase, flavourzyme)를 이용하여 매생이 추출물을 가수분해해서 올리고머를 추출, 생리활성을 측정하고 성분을 규명한 것이 있다(Kim and Lee, 2013. Analysis of angiotensin I converting Enzyme inhibitory activity of oligosacchride extracted from Capsosiphon fulvescens. Korean Biotech. Bioeng. J 28, 131-136; Kim and Lee, 2013. Production and characterization of B-glucan type oligomer produced with enzymatic hydrolysis of Capsosiphon fulvescens. Korean Biotech. Bioeng. J 28, 151-156). 또한 이 연구를 특허출원하여 등록된 대한민국 특허 제 10-1324652호에서는 매생이에서 유래한 다당류를 기존에 밝혀진 상업적으로 시판되는 효소들을 처리하여 얻은 올리고당이 항고혈압 또는 항당뇨 효과가 있다고 하였다.

지금까지 해조류 유래 고분자 다당류에서 유용성분을 추출하기 위하여 여러 가지 방법이 시도되었는데, 대부분이 물리적인 조작이나 화학물질을 이용한 산분해를 하기 때문에 제조에 많은 비용이 소요된다. 또한 균질화된 올리고당의 생산이 쉽지 않기 때문에 의약품이나 화장품, 건강기능식품에 적용하기에는 안전성이 확보되지 않아 산업적으로 활용이 원활하지 못한 상태이다. 따라서 미생물에서 유래한 효소를 이용하여 가수분해, 저분자화시켜 일정한 구성 성분과 구조를 가진 균질화된 저분자 다당류 또는 올리고당을 제조하면 다양한 용도로 이용성이 크게 확대되어 산업적인 활용도가 크게 증가할 것으로 예상된다(Na 등, 2010. Purification, characterization and immunostimulating activity of water soluble polysaccharide isolated from Capsosiphon fulvescens. Int. Immunopharmacol, 10, 364-370; 김 등, 2011. 해양 미생물 유래 해조 다당류 분해 효소의 특성 및 산업적 응용. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 39, 189-199; Kim and Lee, 2013. Production and characterization of B-glucan type oligomer produced with enzymatic hydrolysis of Capsosiphon fulvescens. Korean Biotech. Bioeng. J 28, 151-156).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 생물학적 방법을 이용하여 녹조류 유래 다당류를 올리고당으로 분해하고자 노력하였다. 그 결과, 신규 미생물인 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata) 균주 KCTC12651BP를 발견하고 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP의 녹조류 유래 다당류 분해 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata) 균주 KCTC12651BP를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 녹조류(green algae) 유래 다당류 분해능을 갖는 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata) 균주 KCTC12651BP를 제공한다.

본 발명자들은 생물학적 방법을 이용하여 녹조류 유래 다당류를 올리고당으로 분해하고자 노력하였다. 그 결과, 신규 미생물인 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata) 균주 KCTC12651BP를 발견하고 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP의 녹조류 유래 다당류 분해 활성을 확인하였다.

본 발명의 상기 녹조류는 원생생물(Protista) 중 녹색의 조류를 통칭한다. 상기 녹조류는 단세포, 다세포, 비세포성 다핵체 등을 모두 포함하며, 해수 또는 민물에 서식한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 녹조류는 매생이속(Capsosiphon) 조류이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 매생이속 조류는 매생이(Capsosiphon fulvescens)이다.

본 발명의 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 녹조류 유래 다당류 분해능을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 다당류는 울반(ulvan)-타입 다당류이다.

본 명세서에서 용어 ‘울반-타입 다당류’는 녹조류 유래 황산화 다당류로, 우론산에 연결된 황산화된 람노오스를 주요 구성으로 갖는 다당류를 의미한다(Valerie Jaulneau et. al., 2010. Ulvan, a Sulfated Polysaccharide from Green Algae Activates Plant Immunity through the Jasmonic Acid Signaling Pathway Journal of Biomedicine and Biotechnology Article ID 525291).

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 울반-타입 다당류는 황산화 글루쿠로노람노자일란(sulfated glucuronorhamnoxylan)이다.

상기 황산화 글루쿠로노람노자일란은 총 탄수화물 64 중량%, 황산에스테르 15.4 중량%, 우론산 13.2 중량%, 단백질 0.5 중량% 및 상기 탄수화물은 람노오스 37-47 mol%, 프럭토즈 0.0-1.5 mol%, 아라비노즈 0.0-1.5 mol%, 자일로즈 37-47 mol%, 만노오즈 3.5-11.0 mol%, 글루코즈 0.0-2.5 mol%, 갈락토오즈 0.0-2.8 mol% 및 글루쿠론산 6.0-12.0 mol%을 포함하는 분자량 385 kDa의 황산화 글루쿠로노람노자일란이다.

본 발명의 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 녹조류 유래 다당류를 올리고당(oligosaccharide)으로 분해한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 올리고당은 2.0 내지 3.5 kDa의 분자량을 갖는다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 올리고당은 2.2 내지 3.2 kDa, 2.3 내지 2.9 kDa 또는 2.4 내지 2.8 kDa의 분자량을 갖는다.

본 발명의 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 최소 배지 또는 영양 배지에서 배양할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 질소원만을 포함하는 최소 배지에서 녹조류 유래 다당류를 올리고당을 분해할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질소원은 펩톤(peptone)이다.

상기 영양 배지는 상기 균주의 성장 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 영양 배지는 탄소원으로서 글루코오즈와 같은 단당류, 이당류, 유기산류 및 알코올류를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 영양 배지는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원이 이용될 수 있다. 또한, 상기 영양 배지는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있으며, 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 중성 조건에서 최적의 녹조류 유래 다당류 분해능을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 pH 5.5-8.5 조건에서 최적의 녹조류 유래 다당류 분해능을 나타낸다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 pH 6.0-8.0 조건에서 최적의 녹조류 유래 다당류 분해능을 나타낸다.

본 발명의 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 15-38℃ 조건에서 최적의 녹조류 유래 다당류 분해능을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 20-38℃ 조건에서 최적의 녹조류 유래 다당류 분해능을 나타낸다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 15-35℃, 17-30℃ 또는 19-27℃ 조건에서 최적의 녹조류 유래 다당류 분해능을 나타낸다.

본 발명의 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 0.5-4.0 중량% 염(salt) 농도 조건에서 최적의 녹조류 유래 다당류 분해능을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 0.8-3.7 중량%, 1.0-3.4 중량% 또는 1.5-3.2 중량% 염(salt) 농도 조건에서 최적의 녹조류 유래 다당류 분해능을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 녹조류 유래 다당류, 탄소원 및 질소원을 포함하는 배양 배지에 접종하여 pH 5.5-8.5, 15-38℃ 및 0.5-4.0 중량% 염(salt) 농도의 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP의 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상기 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP의 배양 방법으로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 녹조류(green algae) 유래 다당류 분해능을 갖는 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata) 균주 KCTC12651BP를 제공한다.

(b) 본 발명의 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP는 녹조류 유래 다당류를 다양한 생리 활성을 갖는 올리고당으로 분해할 수 있다.

(c) 본 발명의 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP에 의해 생성된 올리고당은 식품, 화장품, 의약품 및 공업 원료 등 다양한 산업에 적용될 수 있다.

도 1은 선별된 매생이 다당류 분해 균주들의 다당류 분해능을 나타낸 것으로, 시간별로 환원당의 흡광도를 측정하여 분해능을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 매생이 다당류 분해 균주 PS-1을 배양한 후 상등액 및 균주, 각각의 환원당 흡광도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 매생이 다당류 분해 균주 PS-1에 의한 매생이 다당류 분해 후의 점성도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 매생이 다당류 분해 균주 PS-1에 의한 매생이 다당류의 분해능을 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 매생이 올리고당의 분자량을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 매생이 다당류 분해 균주 PS-1의 계통분석도를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 매생이 다당류 분해 균주 PS-1의 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscopy) 사진을 나타낸다.
도 8a 내지 8c는 매생이 다당류 분해 균주 PS-1의 pH, 온도 및 염농도 변화에 따른 성장률을 측정한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 한국산 매생이에서 고분자 다당류의 추출 및 정제

실험에 사용한 고분자 다당류는 전라남도 완도에서 채취하여 완도군 수협에서 판매하는 매생이(Capsosiphon fulvescens)를 구입하여 추출해서 사용하였다.

건조 후 중량 39.58 g의 매생이를 0.01 N 염산에 넣어 상온에서 24시간 동안 정치하였다. 가수분해된 추출물을 여과하여 얻은 여액을 1 N 수산화나트륨으로 중화시켰다. 중화된 여액에 3배 용량의 95% 에탄올을 첨가하여 침전시킨 뒤 원심분리(6,000 rpm, 30분)하여 침전물(1차 침전물)을 얻었다. 1차 침전물을 증류수에 다시 용해시킨 뒤, 염산을 사용해서 pH 2.0으로 적정한 다음 염화칼슘(CaCl₂)을 최종농도가 2 M이 되도록 첨가하였다. 침전물을 동일한 방법으로 원심분리하여 제거한 후 상등액에 다시 3배 용량의 95% 에탄올을 첨가하여 재침전시켰다. 재침전물을 원심분리로 회수한 다음, 증류수에 녹여 4℃에서 48시간 동안 투석(MWCO 14,000)한 것을 동결건조하여 매생이 다당류를 회수하였다. DEAE-셀룰로오스 칼럼(3×42 ㎝, Sigma)에 매생이 다당류 40 ㎎을 증류수에 녹여 주입하여 정제하였다. 시료의 용출은 증류수에 NaCl을 0.5 M, 1.0 M, 1.5 M, 2.0 M, 2.5 M, 및 3.0 M이 되게 각각 녹인 용출액으로 당이 검출되지 않을 때까지 단계적으로 용출시켰다. 용출액을 분획분취기로 8 ㎖씩 모은 후 페놀-황산법으로 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 분획을 합쳐 증류수에 24시간 투석(MWCO 14 kDa)한 후 농축하여 동결건조 하였다.

매생이 유래 다당류의 특성 분석

공지된 방법을 이용하여 상기 매생이로부터 추출한 고분자 다당류의 특성을 분석하였다. 본 발명진의 2015년 Marine Biotechnology에 게재될 Structural Features and Anticoagulant Activity of the Sulphated Polysaccharide SPS-CF from a Green Alga Capsosiphon fulvescens(in print)에 따르면, 상기 매생이 유래 고분자 다당류는 표 1의 특성을 갖는다.

-

함량(w/w%)

단당류 함량(mol%)_e

분자량(kDa)

TC^a

SE^b

UA^c

P^d

Rha

Fuc

Ara

Xyl

Man

Glc

Gal

GlcA

매생이 유래 고분자 다당류

64.0

15.4

13.2

0.5

45.0^f

-

44.1^f

10.2^f

-

ND^f

385

39.6^g

-

tr^g

38.6^g

9.7^g

tr^g

9.9^g

39.9^h

1.1^h

1.2^h

49.4^h

4.2^h

1.8^h

2.3^h

ND^h

상기 표 1의 ‘TC(Total Carbohydrate; 총 탄수화물)’는 페놀-황산 법으로 490 ㎚에서 검출하였고(첨자 ‘a’), 상기 ‘SE(Sulphate esters; 황산에스테르)’는 Na₂SO₄를 기준으로하여 루이스법(Loui's method)로 측정하였으며(첨자 ‘b’), 상기 ‘US(Uronic acid; 우론산)’은 블루멘크란츠&아스보-한센(Blumenkrantz & Asboe-Hansen) 법에 따라 3-하이드록시바이페닐(3-hydroxybiphenyl) 시약으로 결정하였고(첨자 ‘c’), 상기 ‘P(Protein; 단백질)’은 브래드포드 방법으로 측정하였으며(첨자 ‘d’), 각 단당류는 PMP-라벨링/HPLC(첨자 ‘f’), HPAEC-PAD(첨자 ‘g’) 및 GC-FID(첨자 ‘h’)로 결정하였다. ‘tr(trace amount)’은 미량을, ND(Not determined)은 검출되지 않음을 의미한다. 정제된 다당류의 분자량은 크기-배제 HPLC를 이용하여 측정하였다. 상기 표 1의 ‘Man’은 만노오스(mannose)이고, ‘Rha’는 람노오스(rhamnose)이고, ‘Fuc’는 프럭토즈(fructose)이며, Ara’는 아라비노즈(arabinose)이고, ‘Xyl’은 자일로즈(xylose)이며, ‘Man’은 만노즈(mannose)이고, ‘Glc’는 글루코즈(glucose)이며, ‘Gal’은 갈락토즈(galactose)이고, ‘GlcA’는 글루쿠론산(glucuronic acid)이다. 이의 몰 백분율은 HPAEC-PAD(High-Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) 분석으로 측정하였다. 종합하건데, 상기 매생이 유래 고분자 다당류는 황산화 다당류로 황산화 글루쿠로노람노자일란(sulfated glucuronorhamnoxylan)이다.

실시예 2: 매생이 다당류 분해 미생물의 선별 및 다당류 분해능 측정

매생이 다당류 분해 미생물의 분리

매생이 다당류인 황산화 글루쿠로노람노자일란에 대해 분해능을 가진 미생물을 탐색하기 위해 해수 및 바닷가 모래에서 총 30 개의 시료를 채취하였다. 채취한 시료에서 매생이 다당류 분해 균주를 분리·배양하기 위해 사용된 배지의 조성과 배양방법은 다음과 같다. 매생이에서 추출한 매생이 다당류인 황산화 글루쿠로노람노자일란 0.3%(w/v) 및 0.2%(w/v) 펩톤을 멸균한 배지에 각각의 시료를 배양액의 10%(w/v)가 되도록 첨가한 후 150 rpm으로 30℃에서 7일 동안 배양하였다. 상기 배양액과 같은 조성 및 1.5%(w/v) 한천을 첨가한 한천 평판배지에 각각 100㎕씩 도말한 후 30℃에서 2일 동안 배양하여 성장이 우수한 16개의 균주를 분리하였다. 16개 균주를 액체 배양액에서 150 rpm으로 30℃에서 3일 동안 배양한 후 이 배양액을 100℃에서 10분 동안 처리하여 균의 증식 및 효소활성을 저지하고 매생이 다당류 분해능을 측정하였다. 분해능의 측정은 소모기-넬슨법(Somogyi-Nelson 법, Chaplin 및 Kennedy, In Carbohydrate Analysis, 3-4, 1994)으로 후술되는 ‘매생이 다당류 분해균의 다당류 분해능 측정’과 동일하게 실시하여 환원당을 측정하였다.

매생이 다당류 분해균의 다당류 분해능 측정

0.5%(w/v) 황산화 글루쿠로노람노자일란 및 펩톤 0.5%(w/v)를 첨가한 후 pH 7.0으로 맞추었다. 이 배지를 멸균한 후 앞서 분리한 16개의 균주를 각각 접종하였다. 3 일간 배양한 후 1 ㎖의 배양액을 취하여 원심분리 후 100℃로 가열하여 반응을 정지시켰다. 200 ㎕의 배양액에 1 ㎖의 소모기(Somogyi) 시약을 첨가하고 100℃에서 5분 동안 가열한 후 실온으로 냉각하고 1 ㎖의 넬슨(Nelson) 시약을 첨가하였다. 이를 원심분리한 후 분광광도계로 510 ㎚에서 흡광도를 측정하여 이를 효소활성으로 환산하였으며 표준당으로는 L-글로코스 용액을 사용하였다. 상기와 같은 방법으로 최초 16개의 분리 균주들로부터 매생이 다당류 분해능이 우수한 미생물 균주를 선별하였다.

그 결과, 황산화 글루쿠로노람노자일란의 분해능이 가장 우수한 1개의 균주를 최종 선별하였다(도 1). 일례로서 분리균 S-25, S-27 등은 분리 과정에서 임의로 붙여진 분해균주의 이름이며, 환원당 측정 결과 PS-1 균주가 다른 균주들과 비교해 보았을 때, 약 6배 정도 환원당 값이 높게 나타났고 이를 통해 황산화 글루쿠로노람노자일란 분해능이 가장 우수한 균주를 선별하였다. 상기 균주 PS-1는 2014년 8월 19일자로 한국생명공학연구원내 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC12651BP를 부여받았다.

실시예 3: 매생이 다당류 분해균주 PS-1의 효소 반응 위치 탐색

매생이 다당류인 황산화 글루쿠로노람노자일란의 분해능이 있는 분해 균주 PS-1(KCTC12651BP)을 500 ㎖의 최소배지 [0.3%(w/v) 황산화 글루쿠로노람노자일란 및 1%(w/v) 펩톤]에서 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상등액과 침전물을 따로 모아서 각각 0.2% 황산화 글루쿠로노람노자일란 용액과 반응 후 소모기-넬슨법을 이용하여 환원당을 측정하였다(도 2). 측정 결과 상등액에서는 환원당 값이 거의 나오지 않았지만, PS-1 세포(침전물)에서는 시간이 지나면서 환원당 값이 증가하였다. 이는 매생이 다당류를 분해하는 PS-1의 효소는 PS-1 세포 표면 또는 세포막에 존재하여 매생이 다당류와 반응하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 점도계를 이용한 PS-1 에 의한 매생이 다당류 분해 산물의 분석

매생이 다당류 분해균주인 PS-1(KCTC12651BP)에 의한 매생이 다당류의 점성도 변화를 측정하기 위해 10 mM Tris-Cl(pH 7.0) 완충액에 녹인 0.3% 황산화 글루쿠로노람노자일란 용액을 30℃에서 PS-1 분해균주와 반응시킨 후 시간별로 반응액을 수거하였다. 25℃ 항온수조에서 브룩필드 점도계(Brookfield Engineering Labs, USA)에 오스왈드 형 점도측정기를 사용하여 시료를 넣은 후 1 rpm에서 3회 반복 측정하여 평균값을 계산하였다.

시간이 경과함에 따라 반응액의 점성도는 점차 감소하여 0 시간 대비 24 시간째에는 점성도가 70% 이상 감소하였다(도 3). 이는 분해균주 PS-1이 반응액 내의 매생이 다당류를 분해하여 점성도가 감소하는 것을 보여주고 있으며, 분해산물에 대한 환원당 반응은 지속적으로 증가세를 나타냈다.

실시예 5: HPLC 를 이용한 PS-1 매생이 다당류 분해 산물의 분석

매생이 다당류 분해균주 PS-1(KCTC12651BP)을 1% 펩톤 및 0.5% 황산화 글루쿠로노람노자일란을 함유한 배지 1ℓ에서 3 일 동안 배양한 후 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액에 75% 에탄올 처리하여 원심분리한 후 상등액을 농축, 동결건조하여 매생이 올리고당을 획득하였다. HPLC(Waters, USA)를 이용한 올리고당 측정은 Shodex OHpak SB-804 HQ(MW: -4×10⁶ Da, 8.0×300 ㎜, Showa, Japan)과 RID(refractive index detecto)(Waters, USA)를 사용하여 확인하였다. 1% 매생이 올리고당을 증류수에 용해하고 용출용매는 증류수를 사용하여 유속은 0.7 ㎖/분으로 하여 분석하였다. 도 4는 매생이 다당류가 분해된 후 생성된 매생이 올리고당을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 0 시간에는 황산화 글루쿠로노람노자일란만 검출되었으나, 시간이 경과함에 따라 매생이 다당류는 PS-1 균주에 의해 분해되어 3일 째에 하나의 저분자 매생이 올리고당 피크가 생성되었다. 표준물질로 풀루란을 분자량(1320, 5900, 22800 및 47300 Da) 별로 측정하여, HPLC로 확인된 매생이 올리고당의 분자량을 계산하였다(도 5). 그 결과 385 kDa 의 분자량을 가진 황산화 글루쿠로노람노자일란을 PS-1 균주로 분해하여 얻은 매생이 올리고당의 분자량은 약 2800 Da임을 확인 하였다.

실시예 6: 생화학적 특성 및 16s rDNA 및 염기서열에 의한 매생이 다당류 분해 미생물의 동정

PS-1의 생화화적 특성 분석

실시예 2에서 분리한 매생이 다당류 분해능이 있는 PS-1(KCTC12651BP) 균주를 그람염색 및 생화학적 특성을 분석을 통해 일차적으로 동정하였다(표 2).

상기 PS-1 균주는 영양 상태에서 활발한 운동성을 가진 통성혐기성 그람음성 간균으로 밝혀졌다.

시험	반응/효소	결과	시험	반응/효소	결과
NO3	질산염(nitrates)을 아질산염(nitrites)으로 환원	+	NAG	N-아세틸-글루코사민의 흡수	+
ESC	가수분해(β-글루코시다아제)	+	MAL	말토스의 흡수	+
TRP	인돌 생성	-	GNT	글루콘산염의 흡수	-
GLU	산성화	-	CAP	카프린산염의 흡수	+
ADH	아르기닌 디히드롤라제	-	ADI	아디핀산염의 흡수	-
URE	우레아제	-	MLT	말산염의 흡수	+
GEL	가수분해(프로테아제)	+	CIT	구연산염의 흡수	+
PNPG	β-갈락토시다아제	+	PAC	페닐-아세테이트의 흡수	-
ARA	아라비노스의 흡수(Assimilation)	-	MAN	만니톨의 흡수	-
MNE	만노오스의 흡수	+

DNA 분리 정제 및 PCR 의 반응 조건

매생이 다당류 분해균주 PS-1에서 DNA를 분리하기 위해 구아니딘 티오시아네이트/페놀/클로로포름 방법을 사용하였다. 약 0.5 ㎖의 PS-1 배양액에 0.25 ㎖의 용액(4 M 구아니딘 티오시아네이트, 0.25 M 소듐 시트레이트 및 0.5% 사르코실)과 0.5 ㎖의 페놀-클로로포름(1:1)을 첨가하여 약 1시간 정도 혼합한 후 원심분리하여 상등액을 회수하고 DNA를 이소프로필알코올로 침전하였다. 회수된 침전물을 70% 알코올로 세척한 후 말려서 증류수에 녹여 PCR에 사용하였다.

PCR 반응액에는 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 200 μM dNTPs, 2.5 units Taq DNA 폴리머라제, 100 pmol 프라이머 및 DNA 주형을 넣어 총 부피를 100 ㎕가 되도록 하였다. 각 시료는 증폭기에서 증폭 사이클을 시작하기 전에 94℃에서 5분 동안 DNA를 변성시킨 후 PCR을 실시하였으며, 45 사이클을 종료한 후 72℃에서 7분 동안 연장 반응시킨 다음 반응을 종료하였다. 각 사이클은 94℃ 1분, 35℃ 2분 및 72℃ 2분으로 하였다.

16s rDNA 의 염기서열을 이용한 계통분석

결정된 염기서열(5’-TGCAAGTCGAACGGCAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGA GTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTCTGTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCYGGCTAATACCYGGTTGGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGT-3’; 서열목록 제1서열)의 상동성 검사는 GenBank의 데이터베이스에 등록된 정보를 대상으로 블라스트 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)으로 수행하였다. 계통분석은 DNAstar의 MegAlign 프로그램을 사용하여 결정하였다. GenBank에 등록된 다른 균주들의 16s rDNA 염기서열 정보와 MegAlign 프로그램을 이용하여 이웃 결합 방법(neighbor-joining method)에 의해 염기 서열간의 계통수를 얻었다(Saitou 및 Nei, Mol. Biol. 4:406-425, 1987).

PCR로 증폭된 16s rDNA 부분 염기를 이용하여 매생이 다당류 분해능을 가진 PS-1의 염기서열 검색을 통해 유사도를 조사한 결과 슈도모나스 속에 속하는 세균으로 판단되었다. 슈도모나스는 현재 213 종 18아종이 존재하며 이 들 중 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata)와 100%의 높은 유사도를 나타냈다.

한편, 901 bp의 염기서열을 사용한 계통수 분석에 의하면 PS-1균주는 슈도모나스 제니귤라타 표준균주와 동일 가지를 형성하는 것으로 나타났고, 계통수 심화분석을 통해 슈도모나스 제니귤라타와 동일가지를 형성하는 정도가 99%로 나타나 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata)로 동정하는 것이 타당할 것으로 생각되었으며, 상기의 생화학적 방법과 동일한 결과를 보여줌을 확인하였다. 결정된 염기서열과 유사한 유형의 균주들과의 유연관계를 조사한 결과는 표 2 및 도 6에 표시하였다. 하기 표 3의 ‘T’는 ‘Type strain’을 의미한다.

실시예 7: 매생이 다당류 분해 균주 PS-1의 투과전자현미경( TEM ) 분석

한천 배지(0.5% 황산화 글루쿠로노람노자일란, 0.5% 펩톤 및 1.5% 아가)에서 PS-1(KCTC12651BP)을 3일 동안 배양 후 배지에서 백금이(platinum pool)를 이용하여 PS-1를 슬라이드 글라스(slide glass)에 도말하였다. 30% 에탄올을 이용하여 PS-1 탈수 작업을 거친 후 임계점 건조기(critical point dryer)를 이용하여 완전히 건조시켰다. 건조된 PS-1는 구리양면 테이프를 붙인 원반형 스터브(stub) 위에 고정시켰다. 건조된 PS-1은 투과전자현미경(TEM)으로 형태를 관찰하였다(도 7). 관찰된 PS-1 분리균주는 길이가 약 1.3 ㎛, 폭은 약 0.5 ㎛인 짧은 간균의 형태로 한 개의 편모를 지니고 있다.

실시예 8: 매생이 다당류 분해 균주 PS-1의 효소활성에 필요한 적정 pH 및 온도, 염농도 측정

분해균주 PS-1의 성장 및 효소 활성의 적정 pH 측정

매생이 다당류 분해균주 PS-1(KCTC12651BP)을 1% 펩톤 및 0.5% 황산화 글루쿠로노람노자일란을 함유한 배지 1 ℓ에서 3 일 동안 배양한 후 원심분리하여 세포를 회수하였다. PS-1 세포들은 각각의 pH로 적정된 0.5% 매생이 다당류 반응액에 넣고 반응시킨 후 시간별로 PS-1 균주의 성장률을 측정하였다. pH 4.0 과 pH 5.0은 50 mM 소디움 아세테이트 완충액을 사용하였고, 50 mM Tris-Cl 완충액을 사용하여 pH 6.0, 7.0, 8.0, 9.0의 반응액을 제조하였다.

매생이 분해균주 PS-1 은 pH 6-8에서 가장 증식이 잘 되었으며, 특히 pH 7에서 가장 높은 증식률을 보였다(도 8a). 도 8에서 보여주는 바와 같이 pH 5, pH 9 및 pH 10의 산성 과 염기성에서는 분해균주 PS-1의 성장이 저해를 받는 것으로 나타났다.

분해균주 PS-1의 성장 및 효소 활성의 적정 온도 측정

매생이 다당류 분해균주 PS-1을 1% 펩톤 및 0.5% 황산화 글루쿠로노람노자일란을 함유한 배지 1 ℓ에서 3 일 동안 배양한 후 원심분리하여 세포를 회수하였다. PS-1 세포들을 pH 7.0 으로 적정된 0.5% 황산화 글루쿠로노람노자일란 반응액에 넣고 각각의 온도(10, 20, 25, 30, 35, 40 및 50 ℃)에서 반응시킨 후 시간별로 PS-1 균주의 성장률을 측정하였다.

매생이 분해균주 PS-1은 30℃에서 가장 높은 증식율을 보였다(도 8b). 도 8b에서 보여주는 바와 같이 10℃의 낮은 온도나 40℃ 이상의 높은 온도에서는 분해균주 PS-1의 성장이 저해를 받는 것으로 나타났다.

분해균주 PS-1의 성장 및 효소 활성에 대한 염 농도의 영향 측정

매생이 다당류 분해균주 PS-1을 1% 펩톤 및 0.5% 황산화 글루쿠로노람노자일란 함유한 배지 1 ℓ에서 3 일동안 배양한 후 원심분리하여 세포를 회수하였다. PS-1 세포들을 pH 7.0 으로 적정된 0.5% 황산화 글루쿠로노람노자일란 반응액에 넣고 각각의 염 농도(w/v) (0.5%, 1%, 2%, 3% 및 4%)에서 반응시킨 후 시간별로 PS-1 균주의 성장률과 환원당을 측정하였다.

매생이 분해균주 PS-1은 염농도 0.5-3% 에서는 증식이 잘 되었으나(도 8c), 염농도 3% 이상에서는 세포 증식이 저하되었다. 이 결과를 바탕으로 매생이 분해균주 PS-1은 약호염성균인 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12651BP

20140814

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pseudomonas geniculata KCTC12651BP having the Ability to Degrade Green Algae derived Polysaccharides <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 901 <212> DNA <213> Pseudomonas geniculata PS-1 KCTC 12651BP 16s rDNA <400> 1 tgcaagtcga acggcagcac agaggagctt gctccttggg tggcgagtgg cggacgggtg 60 aggaatacat cggaatctac tctgtcgtgg gggataacgt agggaaactt acgctaatac 120 cgcatacgac ctacgggtga aagcagggga ccttcgggcc ttgcgcgatt gaatgagccg 180 atgtcggatt agctagttgg cggggtaaag gcccaccaag gcgacgatcc gtagctggtc 240 tgagaggatg atcagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc 300 agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc cataccgcgt gggtgaagaa 360 ggccttcggg ttgtaaagcc cttttgttgg gaaagaaatc cagcyggcta ataccyggtt 420 gggatgacgg tacccaaaga ataagcaccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgaagggtgc aagcgttact cggaattact gggcgtaaag cgtgcgtagg tggtcgttta 540 agtccgttgt gaaagccctg ggctcaacct gggaactgca gtggatactg ggcgactaga 600 gtgtggtaga gggtagcgga attcctggtg tagcagtgaa atgcgtagag atcaggagga 660 acatccatgg cgaaggcagc tacctggacc aacactgaca ctgaggcacg aaagcgtggg 720 gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccctaa acgatgcgaa ctggatgttg 780 ggtgcaattt ggcacgcagt atcgaagcta acgcgttaag ttcgccgcct ggggagtacg 840 gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagtatgtgg 900 t 901

Claims

녹조류(green algae) 유래 황산화 글루쿠로노람노자일란(sulfated glucuronorhamnoxylan) 분해능을 갖는 슈도모나스 제니귤라타(Pseudomonas geniculata) 균주 KCTC12651BP.
삭제
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제 1 항에 있어서, 상기 균주는 황산화 글루쿠로노람노자일란을 분자량 2.0 내지 3.5 kDa의 올리고당으로 분해하는 것을 특징으로 하는 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 녹조류 유래 황산화 글루쿠로노람노자일란을 탄소원으로 하고 질소원을 포함하는 배양 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP.
녹조류 유래 황산화 글루쿠로노람노자일란을 탄소원으로 하고 질소원을 포함하는 배양 배지에 접종하여 pH 5.5-8.5, 온도 15-38℃ 및 0.5-4.0 중량% 염(salt) 농도의 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 슈도모나스 제니귤라타 균주 KCTC12651BP의 배양 방법.