KR100517254B1 - 미강을 이용한 면역활성물질 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미강을 포함하는 배지에서 모나스커스속 미생물을 배양하고, 이로부터 다당류의 면역활성물질을 수득하는 단계를 포함하는 면역활성물질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 미강을 이용한 면역활성물질의 제조방법은 미강을 탄소원으로 사용하여 모나스커스속 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 배양액으로부터 면역활성을 나타내는 다당분획을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명에서 제공하는 면역활성물질은 면역세포 및 대식세포와 같은 면역관련 세포들을 활성화시키고, 림프구 분열촉진물질의 활성을 향상시킬 수 있으므로, 새로운 기능성 식품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 미강을 이용한 면역활성물질의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 미강을 포함하는 배지에서 모나스커스속 미생물을 배양하고, 이로부터 다당류의 면역활성물질을 수득하는 단계를 포함하는 면역활성물질의 제조방법에 관한 것이다.
미강은 현미의 도정 중 생산되는 부산물로 많은 양의 지방, 비타민 B군 및 양질의 단백질, 섬유질 등을 함유하고 있다(참조: Juliano, B.O., Rice bran. pp647-687, 1985). 연간 385,000톤에 달하는 생산량을 보이는 미강은 이러한 우수한 영양적 가치에 비해 30%정도가 미강유 제조에 사용되고 있을 뿐, 나머지 70%는 사료나 비료 등의 저가치물질로 이용되거나 농산 폐기물로 처리되고 있어, 미강의 고부가가치화 및 폭넓은 산업적 이용에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다. 최근에 와서, 건강식품으로서의 인식이 새로워지면서 미강가공품 및 미강성분을 포함하는 건강보조식품에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 일본에서는 미강 발효액으로부터 추출한 물질이 첨가되어 피부 보습효과가 우수한 화장품, 입욕제 등을 개발하여 시판하고 있으며(참조: Nakayama, Y. and Horii,I., Skin moisturization and NMF, pp8-12, 1988), 국내에서는 미강을 세포벽 가수분해 효소로 처리하여, 페루린산(feruric acid), 폴리페놀(polyphenol), 아라비노키실란(arabinoxylan) 등의 유용한 생리물질을 제조하려는 연구가 활발히 진행되고 있다(참조: 대한민국 특허출원 제 10-2000-0067244호).
근래에 들어, 곰팡이류와 버섯류를 포함하는 균류가 많은 연구자들에게 관심을 받고 있다(참조: Yamada, H., Carbohydr. Res., 125:107-115, 1984; Saito, K. et al., Chem. Pharm. Bull., 40:1227-1230, 1992). 이는 균류에서 추출된 고분자 다당류에 기인한 것으로서, 전기 다당류는 항암효과 뿐만 아니라 항보체활성, 림프구 분열 유도활성등의 면역활성을 나타내는 것으로 알려져 있기 때문에, 신규한 면역조절물질을 개발하기 위하여, 균류에서 생산되는 다당류가 집중적으로 연구되고 있다(참조: Ohmori, T. et al., Chem. Pharm. Bull., 36:4512-4518, 1988; Kanayama, H. et al., Chem. Pharm. Bull., 31:1115-1118, 1983; Saito, K. et al., Chem. Pharm. Bull., 40:1227-1230, 1992; Hara, C. et al. Chem. Pharm. Bull., 39: 1615-1616, 1991). 기생생활을 하는 담자균류의 특성을 고려하면, 담자균류에서 생산되는 다당류는 숙주 또는 배지에서 유래되었을 것으로 예측되므로, 미강과 같은 다양한 유효성분을 포함하는 탄소원을 이용하여 균류를 배양할 경우, 더욱 다양한 유용물질을 생산할 수도 있을 것으로 예측되지만, 이에 대하여 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
따라서, 미강을 이용하여 유용한 생리활성물질을 생산할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 미강을 이용하여 유용한 생리활성물질을 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 미강을 탄소원으로 사용하여 모나스커스속 미생물을 배양할 경우, 배양액으로 면역활성물질이 분비됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 미강을 이용하여 면역활성물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 미강을 이용한 면역활성물질의 제조방법은 미강을 탄소원으로 사용하여 모나스커스속 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 배양액으로부터 면역활성을 나타내는 다당분획을 수득하는 단계를 포함한다: 이때, 모나스커스속 미생물은 특별히 제한되는 것은 아니나, 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) 균주를 사용함이 바람직하다. 또한, 모나스커스속 미생물의 배양조건이 특별히 제한되는 것은 아니나, 모나스커스속 미생물을 1 내지 10%(w/v)의 미강을 포함한 모나스커스속 미생물 배양용 배지에 접종하고, 15 내지 35℃의 온도조건에서 1 내지 3일간 배양함이 바람직하다.
또한, 전기 면역활성물질의 최적의 생산조건을 확립하기 위하여, 다양한 조건을 이용한 결과, 모나스커스 필로서스 균주를 액상배지(2%(w/w) 미강, 5%(w/w) 펩톤, 0.1%(w/w) KH2PO4, pH 5.0)에 접종하고, 20℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 3일간 배양할 경우에, 면역활성을 나타내는 다당분획을 가장 높은 효율로 수득할 수 있음을 알 수 있었다.
전기 방법으로 제조된 면역활성을 나타내는 다당분획은 면역세포 및 대식세포와 같은 면역관련 세포들을 활성화시키고, 림프구 분열촉진물질(lymphocyte mitogen)의 활성을 향상시킬 수 있으므로, 새로운 기능성 식품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상적의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 미강발효에 사용할 생산 균주 선별
미강 내에 존재하는 면역활성물질을 수득하는 방법을 개발하고자, 주류, 장류 등 발효식품 제조에 많이 사용되는 아스퍼질러스(Aspergillus) 2개 균종과 모나스커스(Monascus) 5개 균종을 각각 액체배양과 고체배양의 조건으로 배양하여, 총 14개의 다당 획분을 용해한 시료를 수득한 후, 이를 시료로하여 아래에 기술한 방법으로 생리활성, 즉 면역활성을 측정하였다. 생리활성의 측정은 장관면역 활성(intestinal immune system modulating activity) 측정, 대식세포(Macrophage) 활성 측정, 림프구 분열촉진물질(lymphocyte mitogen) 활성 측정을 이용하였다.
실시예 1-1: 미강발효를 위한 균주 배양 및 다당분획 시료의 수득
미강을 포함하는 매생물 배지에서 가장 효과적으로 면역활성물질을 생산하는 균주를 선별하고자, 미강배지를 이용하여 각종 균주를 고체배지 및 액체배지에서 배양하고, 배양액을 대상으로 생리활성을 측정하였다. 각 균주들은 한국종균협회에서 분양받았으며, 균종으로는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae, KCCM 11530), 아스퍼질러스 소재(Asp. sojae, KCCM 60354, ATCC 9362), 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus KCCM 60029, ATCC 22080), 모나스커스 퍼퍼래서스(M. purpureus KCCM 11832, ATCC 16360), 및 모나스커스 안카(M. anka, ATCC 36928)를 사용하였다(참조: 표 1).
실험군 | 종명 | 배지조건 |
rb1 | 아스퍼질러스 소재 | 액체배지 |
rb2 | 아스퍼질러스 오리재 | |
rb3 | 모나스커스 필로서스 | |
rb4 | 모나스커스 안카 | |
rb5 | 모나스커스 아나네서스 | |
rb6 | 모나스커스 퍼퍼래서스 | |
rb7 | 모나스커스 러버 | |
rbA | 아스퍼질러스 소재 | 고체배지 |
rbB | 아스퍼질러스 오리재 | |
rbC | 모나스커스 필로서스 | |
rbD | 모나스커스 안카 | |
rbE | 모나스커스 아나네서스 | |
rbF | 모나스커스 퍼퍼래서스 | |
rbG | 모나스커스 러버 |
먼저, 액체배지(5% 미강, 0.15% NaNO3, 0.1% MgSO4·7H2O, 0.25% KH2
PO4, pH 6.0)에 각 균주를 접종하여 30℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 5일간 배양한 후, 배양이 종료된 배양액을 5℃ 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상징액을 수득하고, 이에 4배 부피의 에탄올을 가하여 5℃에서 12시간 방치함으로써, 침전된 다당분획을 수득하였으며, 전기 다당분획을 동결건조시킨 것을 100mg/㎖(w/v)의 농도로 생리식염수에 용해시켜서, 시료로 사용하였다.
또한, 고체배지(100㎖ 증류수, 80g 미강)에 각 균주를 접종하여 25℃에서 15일간 배양한 후, 배양이 종료된 배지 100g과 250㎖의 증류수를 혼합하고, 균질화한 후, 5℃, 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 수득한 상징액에 4배 부피의 에탄올을 가하고, 12시간동안 5℃에서 방치하여 침전된 다당분획을 수득하였으며, 이를 동결건조한 것을 100mg/㎖(w/v)의 농도로 생리식염수에 용해시켜서, 시료로 사용하였다.
실시예 1-2: 장관세포의 면역 활성화 정도의 측정
전기 실시예 1-1에서 수득한 시료를 이용하여 장관세포의 면역세포 활성화 정도를 홍 등의 방법에 의해 측정하였다(참조: Hong et al. Phytomedicine,5:353-360, 1998).
먼저, 7주령 C3H/HeN 자성 마우스로부터 소장벽에 부착된 패이어 패치(Peyer's patch)를 추출하고, HBSS 완충용액(Hank's balanced salt solution, Sigma Chem. Co.)이 있는 페트리디쉬로 옮기고, 금속체(100mesh)를 패이어 패치 위에 놓은 다음, 주사기 고무마개로 누르면서 패치로부터 세포를 방출시켜서 세포현탁액을 수득하였다. 전기 세포현탁액을 금속체(200mesh)로 여과하고, HBSS로 세척한 후, 세포농도가 2.0 X 106 세포/㎖로 되도록 RPMI-1640 배지(Sigma Chem. Co.)와 혼합하고, 이를 200㎕씩 각각 플레이트에 분주한 다음, 전기 실시예 1-1에서 각각 수득한 시료를 20㎕ 첨가하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 5일간 배양한 후, 배양 상등액을 수득하였다.
한편, 동일종의 마우스 대퇴골로부터 골수세포를 수득한 다음, 상기와 동일한 방법으로 세척한 다음, 세포농도가 2.5×105세포/㎖로 되도록 RPMI-1640 배지와 혼합하고, 이를 100㎕씩 각각 플레이트에 분주한 다음, 전기 수득한 배양 상등액 50㎕와 RPMI 1640 배지 50㎕를 각각 플레이트에 분주한 다음 37℃ 5% CO2 배양기에서 6일간 배양하였다. 골수세포 배양 종료 18시간 전에 AlamarBlueTM(Biosource, USA)용액 20㎕를 첨가하여 반응시킨 후, 형광정도를 자극(excitation) 544nm와 방출(emission) 590nm에서 형광분석기(Luminescence spectrophotometer, Perkin Elmer Limited. U.K)로 측정하였다(참조: 도 1). 도 1은 각 균주로부터 생산된 다당분획의 장관면역활성도를 나타낸 그래프이다. 이때, 음성대조군으로는 시료대신 생리식염수를 이용하였으며, 양성대조군으로는 박테리아 외막에 존재하는 물질로 각종 면역 활성능이 우수하다고 알려진 LPS(lipopolysaccharide)를 사용하였다. 도 1에서 보듯이, 대조군보다 미강 발효액 100㎍/㎖ 첨가시에 대체로 높은 활성이 나타났으며, 특히 rb2, rb3 및 rbC에서 높은 활성을 보였고, rb4, rbA, rbD 및 rbE에서도 양호한 결과를 얻었다.
실시예 1-3: 대식세포 활성 측정
리소좀 포스파타아제(lysosomal phosphatase)의 활성측정을 이용하여 대식세포의 활성도를 측정하였다.
먼저, 6주령 웅성 ICR 마우스의 복강으로부터 대식세포를 수득한 다음, RPMI-1640로 2번 세척하고, 세포수가 1X106세포/㎖ 되도록 RPMI-1640에 재분산시켰다. 이 분산액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 200㎕씩 분주한 후, 37℃ 5% CO2 배양기에서 2시간 배양하여 모노레이어를 형성시켰다. 2시간 후, 부착되지 않은 세포들은 RPMI-1640으로 세척하여 제거하고, 10% FBS를 함유한 RPMI-1640을 각 웰에 180㎕씩 분주하고, 전기 실시예 1-1에서 수득한 각각의 시료 20㎕을 가하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 24시간 재배양하여 대식세포를 활성화시켰다. 이렇게 활성화된 대식세포의 모노레이어에 25㎕의 0.1% triton-X 100을 가하여 대식세포의 세포막을 용해시키고, 이때 분비되는 리소좀 포스파타아제의 기질로 150㎕의 p-니트로페닐 인산 및 0.1M 구연산염(citrate) 완충액을 가하여 반응을 정지시켜 ELISA 리더로 405nm에서 흡광도를 측정하였다(참조: 도 2). 도 2는 각 균주로부터 생산된 다당분획의 농도변화에 따른, 대식세포 활성변화를 나타낸 그래프이다. 도 2에서 보듯이, rb1, rb2, rb3, rb4, rbA, rbC, rbD 및 rbE의 시료에서 높은 활성화 양상을 보였으며, 대체로 농도 의존적인 경향을 나타냈다.
실시예 1-4: 림프구 분열촉진물질(lymphocyte mitogen) 활성 측정
MTT 조사법을 이용하여, 림프구 분열촉진물질의 활성을 측정하였다. 먼저, ICR 마우스로부터 수득한 비장세포를 RPMI-1640으로 3번 세척한 후, 세포농도를 5X106세포/㎖로 조정하여, 90㎕씩 96-웰 플레이트에 분주하고, 전기 실시예 1-1에서 수득한 각 시료 10㎕를 첨가하였다. 이어, 배양기에서 72시간동안 반응시키고, MTT 용액 50㎕를 가하여 배양기에서 5시간 방치한 후, MTT 포르마잔(formazan) 침전물을 수득하였다. 그런 다음, 전기 침전물에 100㎕의 0.04N HCL/이소프로파놀을 가하여 5분간 용해하고 동량의 물을 넣은 후, 570nm에서 흡광도를 비교하였다(참조: 도 3). 도 3은 각 균주로부터 생산된 다당분획의 림프구 분열촉진물질의 활성정도를 나타내는 그래프이다. 이때, 양성대조군으로는 LPS와 conA(concanavalin A)를 사용하였는데, LPS가 B 세포의 활성물질인데 반해 conA는 T 세포 활성물질로서, 두과식물에서 추출된 렉틴(lectin)의 일종이며 림프구에 대해 분열촉진 활성이 높다고 알려져 있다. 도 3에서 보듯이, rb2, rb3, rb4, rbC, rbD 및 rbE의 시료에서 양성 대조군보다는 낮지만 무첨가군인 음성대조군에 비해 높은 활성도를 나타내었다.
이상의 결과로부터, 비교적 높은 활성을 나타내는 시료는 rb2, rb4, rb4, rbA, rbC, rbD 및 rbE이며, 특히 rb3이 높은 활성도를 나타내었기 때문에, 면역활성 효과를 나타내는 다당분획을 제조하기 위하여는 미강을 포함하는 액체배지를 사용하여 모나스커스 필로서스를 배양한 배양액을 이용함이 가장 바람직함을 알 수 있었다.
실시예 2: 배양조건의 최적화
전기 실시예 1에서 결정된 모나스커스 필로서스의 최적의 배양조건을 확립하기 위하여, 탄소원, 질소원, 무기질, pH, 온도 및 배양시간을 달리하여 배양하고, 배양액에서 수득한 다당분획의 중량과 모나스커스 균의 성장을 측정할 수 있는 물질인 글루코스아민의 함량을 비교하였다.
실시예 2-1: 탄소원의 선별
미강, 슈크로스, 글루코스, 과당, 엿당, 녹말, 자이로스, 락토스 또는 솔비톨을 탄소원으로 2%(w/w) 포함하는 기본배지(pH 6.0)에, 모나스커스 필로서스를 접종하고, 30℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 5일간 배양하고, 배양액에 함유된 다당분획의 중량 및 글루코스아민의 함량을 측정하였다(참조: 도 4). 이때, 대조군으로는 탄소원을 첨가하지 않은 실험군을 사용하였다.
전기 배양이 종료된 배양액에 함유된 다당분획의 중량은 박 등의 방법에 준하여 측정하였다(참조: Park et al. Letters Appli. Microbiol. 33:76-81, 2001). 즉, 배양액을 5℃, 12,000g에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액에 4배 부피의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 13시간 방치한 후, 5℃ 12,000g에서 10분간 원심분리하여 얻은 침전물을 80℃에서 12시간동안 건조하고, 이의 중량을 측정하였다.
또한, 글루코스아민의 함량을 측정하기 위하여, 배양액을 80℃에서 12시간 건조시키고 분쇄한 후, 그 중 400mg을 취하여 5㎖의 6N HCl을 첨가하고 121℃에서 60분간 처리하였다. 이를 2,800g에서 15분간 원심분리하고, 상등액 0.5㎖을 취하여 로터리 진공증발기(rotary vaccum evaporator)를 이용하여 HCL을 완전히 제거한 다음, 1㎖의 증류수로 용해시켜 시료를 수득하고 공지된 스위프트(Swift)의 방법에 따라 글루코스아민 함량을 측정하였다(참조: Swift, m.j., Soil Biol. Biochem., 5:321-326, 1968).
도 4는 각각의 탄소원을 사용하여 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 다당분획의 중량은 미강을 탄소원으로 사용하였을 경우에 가장 높은 13.8mg/㎖이었으나, 균체증식을 나타내는 글루코스아민의 함량은 74.1㎍/㎖로서 슈크로스(86.7㎍/㎖)와 엿당(77.2㎍/㎖)을 탄소원으로 사용하였을 때보다는 다소 낮은 함량을 나타내었다. 또한, 자이로스 첨가시 다당분획의 중량은 13.2mg/㎖로 비교적 높은 다당 생산을 보였으나, 글루코스아민 양은 44.2㎍/㎖로 낮은 균사체량을 보였다.
따라서, 모나스커스 필로서스의 탄소원으로 미강을 사용할 경우 다당분획을 가장 많이 수득할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 질소원의 선별
질소원으로 펩톤, 효모 추출물, 소이톤, 질산 암모늄, 염화 암모늄, 암모늄 황산염 또는 질산 나트륨이 각각 5%(w/w) 첨가된, 2%(w/w) 미강을 포함하는 기본배지(pH 6.0)에, 모나스커스 필로서스를 접종하고, 30℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 5일간 배양하고, 전기 실시예 2-1의 방법으로 배양액에 함유된 다당분획의 중량 및 글루코스아민의 함량을 측정하였다(참조: 도 5). 이때, 대조군으로는 질소원을 첨가하지 않은 실험군을 사용하였다. 도 5는 각각의 질소원을 사용하여 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 질소원으로서 펩톤을 첨가한 경우에 가장 높은 다당분획의 중량을 나타내었다.
실시예 2-3: 무기질의 선별
무기질로서 MgSO4, KH2PO4, CaCl2, CuSO4, FeSO
4, ZnSO4, MnSo4 또는 NaCl이 각각 0.1%(w/w) 첨가된, 2%(w/w) 미강 및 5%(w/w)을 펩톤을 포함하는 기본배지(pH 6.0)에, 모나스커스 필로서스를 접종하고, 30℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 5일간 배양하고, 전기 실시예 2-1의 방법으로 배양액에 함유된 다당분획의 중량 및 글루코스아민의 함량을 측정하였다(참조: 도 6). 이때, 대조군으로는 무기질을 첨가하지 않은 실험군을 사용하였다. 도 6은 각각의 무기질을 사용하여 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, KH2PO4를 첨가한 경우에, 가장 높은 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내었다.
실시예 2-4: pH의 선별
pH를 각각 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 또는 8.0으로 조절한 액상배지(2%(w/w) 미강, 5%(w/w) 펩톤, 0.1%(w/w) KH2PO4)에 모나스커스 필로서스를 접종하고, 30℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 5일간 배양하고, 전기 실시예 2-1의 방법으로 배양액에 함유된 다당분획의 중량 및 글루코스아민의 함량을 측정하였다(참조: 도 7). 도 7은 각각의 pH에서 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다. 도 7에서 보듯이, pH 5에서 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량이 가장 높은 수치를 나타내었다.
실시예 2-5: 온도의 선별
상기 실시예 2-1 내지 2-4에 의하여 확립된 액상배지(2%(w/w) 미강, 5%(w/w) 펩톤, 0.1%(w/w) KH2PO4, pH 5.0)에 모나스커스 필로서스를 접종하고, 20, 30, 40 또는 50℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 5일간 배양하고, 전기 실시예 2-1의 방법으로 배양액에 함유된 다당분획의 중량 및 글루코스아민의 함량을 측정하였다(참조: 도 8). 도 8은 각각의 온도에서 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이, 20℃ 에서 다당분획의 중량이 가장 높은 수치를 나타내었다.
실시예 2-6: 배양시간
액상배지(2%(w/w) 미강, 5%(w/w) 펩톤, 0.1%(w/w) KH2PO4, pH 5.0)에 모나스커스 필로서스를 접종하고, 20℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 1, 2, 3, 4 또는 5일간 배양하고, 전기 실시예 2-1의 방법으로 배양액에 함유된 다당분획의 중량 및 글루코스아민의 함량을 측정하였다(참조: 도 9). 도 9는 각각의 시간동안 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다. 도 9에서 보듯이, 배양시간이 증가함에 따라 다당분획의 중량도 증가함을 알 수 있었다.
한편, 이처럼 증가된 다당분획이 모두 면역활성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 각 실험군에서 수득한 다당분획의 대식세포 활성도를 전기 실시예 1-3의 방법으로 측정하였다(참조: 도 10). 이때, 음성 대조군으로는 생리식염수를 이용하고, 양성대조군으로는 LPS를 사용하였다. 도 10은 각 시간동안 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 대식세포 활성도를 나타낸 그래프이다. 도 10에서 보듯이, 4일 및 5일 동안 배양하여 수득한 다당분획의 활성도와 3일 동안 배양하여 수득한 다당분획의 활성도가 거의 차이가 없음을 알 수 있었는 바, 3일 이후에는 면역활성을 나타내지 않는 당이 생성되는 것으로 예측되었다.
이상에서 보듯이, 모나스커스 필로서스 균주를 액상배지(2%(w/w) 미강, 5%(w/w) 펩톤, 0.1%(w/w) KH2PO4, pH 5.0)에 접종하고, 20℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 3일간 배양할 경우에, 면역활성을 나타내는 다당분획을 가장 높은 효율로 수득할 수 있음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 미강을 포함하는 배지에서 모나스커스속 미생물을 배양하고, 이로부터 다당류의 면역활성물질을 수득하는 단계를 포함하는 면역활성물질의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 미강을 이용한 면역활성물질의 제조방법은 미강을 탄소원으로 사용하여 모나스커스속 미생물을 배양하는 단계; 및, 전기 배양액으로부터 면역활성을 나타내는 다당분획을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명에서 제공하는 면역활성물질은 면역세포 및 대식세포와 같은 면역관련 세포들을 활성화시키고, 림프구 분열촉진물질의 활성을 향상시킬 수 있으므로, 새로운 기능성 식품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 각 균주로부터 생산된 다당분획의 장관면역활성도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 각 균주로부터 생산된 다당분획의 농도변화에 따른, 대식세포 활성변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 각 균주로부터 생산된 다당분획의 림프구 분열촉진물질의 활성정도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 각각의 탄소원을 사용하여 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 각각의 질소원을 사용하여 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 각각의 무기질을 사용하여 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다.
도 7은 각각의 pH에서 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다.
도 8은 각각의 온도에서 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다.
도 9는 각각의 시간동안 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 중량과 글루코스아민의 함량을 나타내는 그래프이다.
도 10은 각 시간동안 배양한 모나스커스 필로서스에서 생산된 다당분획의 대식세포 활성도를 나타낸 그래프이다.
Claims (6)
- (ⅰ) 배지전체에 대하여 1 내지 10%(w/v)의 미강을 포함하는 배지에서 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) 균주를 15 내지 35℃의 온도조건에서 1 내지 3일간 배양하는 단계; 및,(ⅱ) 전기 배양액으로부터 면역활성을 나타내는 다당분획을 수득하는 단계를 포함하는, 미강으로부터 유래된 면역활성물질의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 모나스커스 필로서스 균주를 액상배지(2%(w/w) 미강, 5%(w/w) 펩톤, 0.1%(w/w) KH2PO4, pH 5.0)에 접종하고, 20℃ 에서 120rpm으로 교반하면서 3일간 배양한 다음, 전기 배양액으로부터 면역활성을 나타내는 다당분획을 수득하는 단계를 포함하는, 미강을 이용한 면역활성물질의 제조방법.
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