RU2770690C1 - Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 - продуцент фенолоксидазных ферментов - Google Patents
Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 - продуцент фенолоксидазных ферментов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2770690C1 RU2770690C1 RU2021118470A RU2021118470A RU2770690C1 RU 2770690 C1 RU2770690 C1 RU 2770690C1 RU 2021118470 A RU2021118470 A RU 2021118470A RU 2021118470 A RU2021118470 A RU 2021118470A RU 2770690 C1 RU2770690 C1 RU 2770690C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vkpm
- strain
- phenol oxidase
- dated
- fomentarius
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм базидиомицета Fomes fomentarius F-1531 обладает способностью синтезировать комплекс внеклеточных фенолоксидазных ферментов. Он задепонирован в коллекции ВКПМ РФ как Fomes fomentarius ВКПМ F-1531. Изобретение обеспечивает продукцию синтезируемых грибом Fomes fomentarius F-1531 фенолоксидазных ферментов в условиях поверхностно-жидкофазного роста с фенолоксидазной активностью 14-20 МЕ/мл (по пирокатехину) в течение 12-14 сут. 2 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму базидиомицета Fomes fomentarius ВКПМ F-1531, который при культивировании поверхностно-жидкофазным методом синтезирует внеклеточные фенолоксидазы, обнаруживаемые по окислению или пирокатехина (10 мМ) или 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты)диаммониевой соли (ABTS, 4 мМ) в 0,1 М ацетатном буфере при выявленных оптимальных условиях: рН 5,4 и температуре 54-56°C. При этом ферментативная активность термолабильных/термостабильных оксидаз составляет 14-20 МЕ/мл (по пирокатехину) и 720-830 МЕ/мл (по ABTS). Время полу инактивации ферментов составляет 70 мин при температуре 65-67°C.
Известно, что практическое значение имеют как очищенные препараты фенолоксидаз (лакказ, пероксидаз и др.), так и комплексные препараты оксидазных ферментов с мажорным лакказным ферментом у базидиальных грибов. Поэтому препарат фенолоксидазных ферментов, полученный культивированием гриба F.fomentarius ВКПМ F-1531, может быть использован в технологиях делигнификации или детоксикации отходов деревообрабатывающей, целлюлозо-бумажной, текстильной, фармацевтической, пищевой и косметической промышленностей, содержащих лигнины, фенолы и полифенолы.
Известны примеры использования препаратов фенолоксидаз, в т.ч. лакказы различных базидиальных грибов в следующих отраслях:
- пищевой промышленности при получении подкисленного молочного напитка с использованием фермента, обладающего фенолоксидазной активностью (патент США 2010/0266724 А1 от 21.10.2010 г.); при получении напитков на основе водных экстрактов разнообразных грибов, в т.ч. Forties fomentarius (патент WO 2005/029977 А1 от 07.04.2005 г.);
- целлюлозо-бумажной промышленности при обработке бумажной пульпы (патент США 6610172 В1 от 26.08.2003 г.; патент США 6207009 В1 от 27.03.2001 г.; патент США 2328125А1 от 28.10.1999 г.; патент ЕР 0429422 А1 от 29.05.1991 г.; патент США 2017058459 А1 от 02.03.2017 г.; патент WO 9509946 А1 от 13.04.1995 г.);
- текстильной промышленности для отбеливания (патент РФ №96103261 С1 от 10.05.1998 г.) и расшлифовки тканей (патент РФ 2070243 С1 от 10.12.1996 г.);
- химической промышленности для получения полимеров на основе лигнинов и органических соединений (пат. РФ 2165978 от 20.04.2001 г.); для синтеза высокомолекулярных фенольных соединений посредством обработки различных ксенобиотиков препаратами фенолоксидаз (ЕР 0919628 А1 от 02.06.1999 г.);
- приборостроении для создания биосенсоров или биочипов детектирования, например, бета-1,3-глюкана (патент США 2002/0197662 А1 от 26.12.2002 г.).
Штаммы базидиомицета Fomes fomentarius известны для получения разнообразных препаратов:
- хитинсодержащего композита из гименофора плодового тела гриба (патент РФ 2404996 от 13.07.2009 г.);
- препарата с противоопухолевой активностью (патент CN 104055803 A1 от 24.09.2014 г.);
- фильтрующего материала, полученного при обработке целлюлозы лакказами грибов, в том числе Fomes fomentarius (патент KR 101300076 B1 от 30.08.2013 г.);
- композитного материала на основе мицелия и синтезируемых им ферментов (патент US 2012225471 A1 от 06.09.2012 г.);
- препаратов полисахаридов для защиты растений (патент JPH 0621122 В2 от 21.11.1989 г.) и с высокой антиоксидантной активностью (патент CN 109912726 A от 21.06.2019 г.);
- противовирусных препаратов для пчел на основе экстракта мицелия (патент DK 3110260 T3 от 05.11.2018) и этанольных экстрактов мицелия (патент США 2016/0000754 А1 от 07.01.2016 г.);
- препаратов БАВ для медицины: с расслабляющим (патент KR 102035281 В1 от 30.10.2019 г.) и сосудорасширяющим (патент KR102035281B1 от 30.10.2019 г.) действием на кровеносные сосуды; а также для профилактики и лечения черепно-мозговых нервов (патент US 20180289758 A1 от 11.10.2018 г.);
- косметического препарата для отбеливания кожи на основе лакказ гриба (патент KR 101551243 В1 от 09.09.2015 г.).
В то же время штаммы гриба Fomes fomentarius упоминаются как продуценты ферментов:
- протеолитических (коллагенолитических) ферментов (заявка на изобретение РФ 2018100380 от 09.01.2018 г.);
- эндо-глюконаз (патент ЕР 2563910А1 от 03.06.2013 г.).
Таким образом, не существует аналогов использования F.fomentarius в качестве источника термостабильных высокоактивных фенолоксидазных ферментов, которые обладают активностью 14-20 МЕ/мл (по пирокатехину) или 720-830 МЕ/мл (по ABTS).
Прототипом могут служить штаммы грибов Coriolus hirsutus (WulfexFr.) Quel. ле0935, который обладал активностью 4,8-7,8 ME в глубинной культуре (патент РФ 2349 644 С2 от 20.03.2009) и Panus tigrinus 8/18, синтезирующий комплекс лигнолитических ферментов с фенолоксидазной активностью 7-11 ед/мл на 10-12 сут роста (патент РФ 2021371 от 15.10.1994 г.).
Предлагаемый штамм F. fomentarius ВКПМ F-1531 расширяет набор штаммов микроорганизмов, осуществляющих синтез фенолоксидазных ферментов, способных к окислению ряда фенолсодержащих соединений - пирокатехина, 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты) диаммониевой соли (АВТС); 2,6-диметоксифенола, пирогаллола, гидрохинона, фенола, лигносульфоната натрия, а также некоторых ароматических гетероциклических синтетических красителей (метилового зеленый, метиловый оранжевый, метиловый красный, кислотный хром темно-синий, конго красный, бромтимоловый синий, метилтимоловый синий, бриллиантовый зеленый, ремазол, пиразоновый желтый, ксиленовый оранжевый).
Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 продуцирует внеклеточные фенолоксидазные ферменты при росте на поверхности жидких сред (модифицированные Чапека или глюкозо-пептонной) в течение 12-14 сут с оксидазной активностью (по пирокатехину) в культуральной жидкости на уровне 14-20 МЕ/мл.
Штамм гриба F.fomentarius BKnMF-1537выделен из плодового тела F. fomentarius (трутовик настоящий), который был обнаружен на валеже лиственного дерева и выделен в чистую культуру. Его принадлежность к представителям Fomes fomentarius определена на основе идентификации штамма по последовательности области ITS - D1/D2 рДНК.
При секвенировании участка ДНК, кодирующего область ITS - D1/D2 рДНК исследуемого штамма, получена следующая последовательность:
Анализ сходства нуклеотидной последовательности гена, кодирующего область ITS - D1/D2 рДНК, изучаемого штамма был проведен с помощью сервера BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast]. Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующей систематической группе: Eukaryota; Fungi; Dikarya; Basidiomycota; Agaricomycotina; Agaricomycetes; Polyporales; Polyporaceae; Fomes.
Штаммы, принимающие участие в анализе, и уровень сходства последовательности области ITS - D1/D2pJTHK изучаемого штамма представлены в таблице:
Анализ филогенетического родства, построенный с использованием штаммов близкородственных микроорганизмов, показал, что наиболее близким к исследуемому штамму является вид Fomes fomentarius.
Культурально-морфологические особенности грибного штамма Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 на среде сусло-агар (4°Б):
Гриб образует ватообразный, воздушный мицелий белого цвета, который на 10-12 сут полностью колонизирует агаризованную питательную среду на ч. Петри (90 мм). Цвет реверзума - бесцветный, цвет обратной стороны колонии белый или светло-бежевый.
Колония округлая, концентрически зональная, пушится вокруг инокулюма. Край колонии менее плотный. Высота мицелия в период роста на 5-8 сут в среднем составляет 3-5 мм, и в период 14-17-суточного роста составляет 7-10 мм.
Мицелий гриба имеет окраску белого цвета в течение 15-25 сут на различных средах (Чапека, глюкозо-пептонная, сусло-агар), однако при более длительном культивировании (более 30 сут) приобретает светло-кремовую окраску. Мицелий оседает и уплотняется на поверхности среды, приобретая войлочный вид, плохо разделяемый даже с помощью скальпеля.
Образует на поверхности пленки экссудаты в виде жидкости светло-коричневого цвета, которые могут появляться после 25 сут роста.
Морфологические признаки:
Для штамма F. fomentarius F-1531 в условиях поверхностно-жидкофазного роста характерно наличие гифов простого ветвления. Между гифами наблюдается формирование единичных анастомозов, которые у высших базидиомицетов обеспечивают эффективный обмен и передвижение питательных веществ и ядер в мицелии. Вегетативный мицелий состоит из тонкостенных, септированных и ветвящихся гифов размером 5-7,5 мкм (на 4-5 сут) и 10-15 мкм со множественными пряжками в период роста на 12-17 сут. Также отмечается образование немногочисленных мицелиальных тяжей.
Условия хранения
Штамм F. fomentarius ВКПМ F-1531 хранится на агаризованной среде (Чапека-Докса, ГПС, сусло-агар) при температуре +4°C без пересевов в течение 10-12 мес.
Наличие генетической модификации
Штамм F. fomentarius ВКПМ F-1531 не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик.
Культуральные признаки
Твердофазное культивирование штамма F. fomentarius ВКПМ F-1531 осуществляется на увлажненных лигноцеллюлозных субстратах (опилки, овсяный хлопья, шелуха подсолнечник, измельченная солома и др.) при ряде выявленных оптимальных условий: отсутствии освещения, влажности 65-70%,рН 6.0 среды; начальной температуре 28-30°C в течение 3-4 сути 24±2°C в дальнейшем.
Поверхностно-жидкофазный рост гриба F. fomentarius ВКПМ F-1531 осуществляется на питательных средах (модифицированных Чапека или глюкозо-пептонной) при условии: отсутствии освещения; начальном рН 6.0 среды; начальной температуре 28-30°C в течение 3 сут и 24±2°C в течение 12-14 сут.
В результате образуется ферментный раствор (культуральная жидкость) с активностью фенолоксидазных ферментов (по пирокатехину) 7-20 МЕ/мл в оптимальных условиях: рН 5,4 и температуре 55-56°C.
Для выделения фенолоксидазных ферментов используется метод преципитации, который при 70-80% насыщении раствором сульфата аммония высаливается до 79-82% фенолоксидазных ферментов с конечной активностью (по пирокатехину) 184-190 МЕ/мл в оптимальных условиях: рН 5,4 и температуре 55-56°C.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Поверхностно-жидкофазное культивирование
Для получения ферментного препарата на основе гриба F. fomentarius ВКПМ F-1531 в условиях поверхностно-жидкофазного культивирования гриб выращивают на жидкой среде Королевой-Скоробогатько (КС) состава (г/л): глюкоза - 20 г/л; KH2PO4*2H2O - 0,6 г/л; K2HPO4*3H2O - 0,4 г/л; MgSO4*7H2O - 0,5 г/л; пептон - 3 г/л; CuSO4*5H2O - 0,25 г/л; CaCl2 - 0,5 г/л; ZnSO4*7H2O - 0,001 г/л; FeSO4*7H2O - 0,0005 г/л). Начальный рН среды составляет 6,0. Рост гриба осуществляют в термостате при температуре 28-30°C в течение 3 сут, затем температуру понижают до 22-24°C и далее выращивают до 12-14 сут.
Посевной материал вносят в виде 7-9-суточных агаровых блочков (10*10 мм). Выращивание посевного материала производят в термостате на среде сусло-агар (4°Б) при температуре 28-30°C.
Фенолоксидазную активность оценивают по скорости окисления пирокатехина (10 мМ) или ABTS (5 мМ) в 0,1М ацетатном буфере при рН 5,4 и температуре 55-56°C.
Фенолоксидазная активность 14-ти суточной культуральной жидкости составляет 17-20 МЕ/мл или 720-830 МЕ/мл (по АВТ8).Концентрация внеклеточного белка, определенная по методу Бредфорда составляет 120-140 мг/л.
Пример 2. Поверхностно-жидкофазное культивирование с добавлением стимуляторов
Штамм продуцента культивируют поверхностно-жидкофазным способом в конических колбах объемом 500-750 мл, содержащих 100-250 мл модифицированной глюкозо-пептонной среды и лигносульфонат, в качестве стимулятора синтеза ферментов, в концентрации 0,05 г/л.
Начальный рН среды составляет 6,0. Культивирование проводят при 28-30°C, в темноте. Продолжительность жидкофазного культивирования составляет 12 сут.
Посевной материал вносят в виде 9-ти суточных агаровых блочков размером 1*1 см. Выращивание посевного материала производили на плотной среде сусло-агар (4°Б) при температуре 28-30°C.
Фенолоксидазную активность оценивают по скорости окисления пирокатехина (10 мМ) или ABTS (5 мМ) в 0,1М ацетатном буфере при рН 5,4 и температуре 55-56°C.
Полученная культуральная жидкость имеет оксидазную активность 19,4-23,5 МЕ/мл.
Claims (1)
- Штамм базидиомицета Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 – продуцент фенолоксидазных ферментов в условиях твердофазного и жидкофазного культивирования.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2021118470A RU2770690C1 (ru) | 2021-06-23 | 2021-06-23 | Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 - продуцент фенолоксидазных ферментов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2021118470A RU2770690C1 (ru) | 2021-06-23 | 2021-06-23 | Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 - продуцент фенолоксидазных ферментов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2770690C1 true RU2770690C1 (ru) | 2022-04-21 |
Family
ID=81306317
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2021118470A RU2770690C1 (ru) | 2021-06-23 | 2021-06-23 | Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 - продуцент фенолоксидазных ферментов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2770690C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2021371C1 (ru) * | 1992-07-23 | 1994-10-15 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН | Способ получения лигнинолитических ферментов |
RU2349644C2 (ru) * | 2005-11-21 | 2009-03-20 | Государственное образовательное учреждение ОГРН 1037739174406 "Московский государственный университет инженерной экологии" Федерального агентства по образованию | Способ получения ферментного препарата лакказы |
-
2021
- 2021-06-23 RU RU2021118470A patent/RU2770690C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2021371C1 (ru) * | 1992-07-23 | 1994-10-15 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН | Способ получения лигнинолитических ферментов |
RU2349644C2 (ru) * | 2005-11-21 | 2009-03-20 | Государственное образовательное учреждение ОГРН 1037739174406 "Московский государственный университет инженерной экологии" Федерального агентства по образованию | Способ получения ферментного препарата лакказы |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WASSER SP. Medicinal mushroom science: History, current status, future trends and unsolved problems. Int J Med Mushrooms. 2010: 12(1): 1-16. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kachlishvili et al. | Modulation of Cerrena unicolor laccase and manganese peroxidase production | |
CN102037856B (zh) | 一种简易蛹虫草菌种复壮的方法 | |
CN103305430B (zh) | 一株产漆酶齿毛菌及其应用 | |
WO2021158179A1 (en) | SCHIZOPHYLLUM COMMUNE STRAIN PLNP13 AND β-GLUCAN OBTAINED FROM CO-CULTURING THE STRAIN WITH GANODERMA LUCIDUM | |
CN107502561B (zh) | 冠突散囊菌及其应用、黑茶及其加工方法 | |
RU2770690C1 (ru) | Штамм Fomes fomentarius ВКПМ F-1531 - продуцент фенолоксидазных ферментов | |
KR20190100711A (ko) | 중성지방 흡수 저해율이 높은 신규 교잡 신품종 버섯 균주 gbn2wp0970 및 그 자실체 | |
KR101756683B1 (ko) | 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이를 포함하는 생물 농약 | |
KR20040047730A (ko) | 펠리누스 린테우스 균사체 배양용 배지 조성물 | |
Kachlishvili et al. | Evaluation of lignin-modifying enzyme activity of Trametes spp.(Agaricomycetes) isolated from Georgian forests with an emphasis on T. multicolor biosynthetic potential | |
KR101407231B1 (ko) | 락토바실러스 헬베티커스 rmk85를 이용한 gaba 증진 발효 식물 추출물 제조방법 | |
KR100706132B1 (ko) | 펠리누스 린테우스 균사체 배양용 배지 조성물 | |
RU2315098C1 (ru) | Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых и слабокислых протеаз | |
KR100398677B1 (ko) | 감귤농축액을 이용한 버섯균사체의 배양방법 및 그버섯균사체 | |
RU2189395C2 (ru) | Способ получения белковой биомассы гриба | |
KR20120037174A (ko) | 신규한 담자균류의 치마버섯 에스티0516 11489와 이 균주로부터 생산된 다량의 다당류의 제조방법 및 이를 함유하는 피부외용제 조성물 | |
KR100517254B1 (ko) | 미강을 이용한 면역활성물질 제조방법 | |
KR20200108748A (ko) | 베타글루칸 함량을 극대화한 상황버섯균사체의 배양방법 | |
RU2808749C2 (ru) | Питательная среда для культивирования базидиального гриба Inonotus obliquus | |
RU2354698C2 (ru) | Способ получения молокосвертывающего фермента | |
KR100403146B1 (ko) | 신규한 모나스커스 속 미생물, 이를 함유한 미생물제 및제조방법 | |
RU2186851C2 (ru) | Способ получения белковой биомассы гриба | |
KR102189632B1 (ko) | 신규 균주 페니실리움 애시둠 및 이의 용도 | |
Haileka | Screening, isolation and characterization of laccase enzymes from Namibian Termitomyces schimperi and Kalaharituber pfeilii | |
KR20010004813A (ko) | 콩섬유박을 이용한 버섯류의 배양법 |