DE2603588A1

DE2603588A1 - Verfahren zur herstellung von alkaloiden durch in vitro-zuechtung von zellen von vinca minor l.

Info

Publication number: DE2603588A1
Application number: DE19762603588
Authority: DE
Inventors: Paul-Roger Guinebault; Vincent Petiard
Original assignee: Synthelabo SA
Current assignee: Synthelabo SA
Priority date: 1975-02-04
Filing date: 1976-01-30
Publication date: 1976-08-05
Also published as: FR2300131A1; FR2300131B1; JPS51104094A; BE838232A

Description

PATENTANWÄLTE

TER MEER - MÜLLER - STEINMEISTER D-8000 München 22 D-48OO Bielefeld

Triftstraße 4 Siekerwafl 7

^SEP * 30. Jan. 1976

SYNTHELABO, 1 Avenue de Villars, Paris, Frankreich

Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden durch in vitro-Züchtung vcn Zellen von Vinca minor L.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden durch in vitro-Züchtung von Zellen von Vinca minor L. (Apocynaceae) in flüssigem Medium.

Es ist bekannt, daß die Zellen der höheren Pflanzen in vitro in einer entdifferenzierten Form Undefinierter Gestalt leben und sich vermehren können. Diese Zellen liefern bei der Teilung entweder isolierte Elemente oder kleine Zellhaufen (mit 2 bis 100 Zellen) oder auch größere Formen, die häufig als "Kallus" (CaIs) oder Zellwucherungen bezeichnet werden, die ein verschiedenartiges morphologisches Aussehen aufweisen (vgl. R.J.Gautheret, "La culture des tissus vegetaux", Masson, Paris (1959)).

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R MEER-MÜLLEH-STEINMEISTER

Es ist ferner bekannt, daß die in vitro gezüchteten Zellen von höheren Pflanzen unter gewissen Bedingungen durch Biosynthese Sekundärverbindungen bilden können, die analog zu oder verschieden von jenen Verbindungen sind, die sie in Form einer vollständigen Pflanze, die in situ wächst, liefern. Als solche Sekundärverbindungen wurden die Alkaloide beschrieben (vgl. H.J. Supniewska, Herba Polonica, Suppl. B-18 (1972)). Insbesondere konnten in den Kallussen bzw. Zellwucherungen von Vinca minor L und in den zu ihrer Züchtung verwendeten halbfesten Nährmedien Alkaloide festgestellt werden, insbesondere von der Art des Vincamins (V.Petiard und Y.Demarly, Ann. Amelior. Plantes 22, No. 4 (1972) 361 bis 374). Es ist ferner festzuhalten, daß es möglich ist, aus in situ wachsender Vinca minor L eine große Vielzahl von Alkaloiden (mindestens 30) zu extrahieren, die in Verhältnissen vorliegen, die mit dem analysierten ökotyp und dem Wachstumszustand der Pflanze variieren. Diese Verbindungen können in verschiedenartiger Weise interessant sein, insbesondere für therapeutische Zwecke.

Ganz allgemein behalten die in vitro gezüchteten Pflanzenzellen die Gesamtheit der genetischen Information der Pflanze bei, aus der sie hervorgegangen sind. Diese Tatsache wird häufig dadurch bestätigt, daß man die Wiederbildung von Organen oder Pflanzen, ausgehend von einer einzigen oder einer geringen Anzahl von entdifferenzierten Seilen, beobachtet. Wenn andererseits die eine gegebene Biosynthese betreffende Information praktisch stets konserviert werden soll, ist es nicht evident, daß diese Information stets unverändert bleibt oder so weitergegeben wird, daß sich quantitativ günstige Bedingungen für die Gewinnung der fraglichen Verbindung(en) mit einer guten Ausbeute ergeben.

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ΞΗ MfcEn-MÜLLER-STEINMEISTER

Aufgrund der obigen Bemerkungen hat man es für notwendig erachtet, sich nicht mit der Gewinnung eines einzigen Stammes von Zellen von Vinca minor L. zufriedenzugeben, sondern man hat im Gegensatz eine Population von etwa 40 verschiedenen Stämmen von Zellen dieser Art, die von verschiedenen natürlichen ökotypen abstammen, vermehrt und aufrechterhalten. In dieser Weise konnte insbesondere die Wahrscheinlichkeit dafür gesteigert werden, daß man einerseits über Stämme verfügt, die Alkaloide biosynthetisieren und andererseits mindestens einen Stamm zur Verfügung hat, der sie mit einer hohen Ausbeute durch Biosynthese liefert.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man isolierte Zellen oder kleine Zellgruppen von Vinca minor L. (Apocynaceae), die man in morphogenetisch entdifferenziertem Zustand, hält in vitro in flüssigem Medium züchtet.

Dieses Verfahren wird in einer Fermentiereinrichtung durchgeführt, nachdem man jene Stämme ausgewählt hat, die eine erhöhte biosynthetische Aktivität besitzen, nachdem man diese Stämme an das flüssige Medium angepaßt oder gewöhnt hat, und nachdem man eine progressive Vergrößerung des Volumens der Kulturen erreicht hat. Die erhaltenen Alkaloide werden aus den Nährmedien und der Biomasse extrahiert und gewonnen.

Dieses Verfahren ist darauf gerichtet, die gesamten von Vinca minor L. abgetrennten Alkaloide zu liefern, die für therapeutische Zwecke verwendet werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren führt,zu einer wesentlich besseren Ausbeute als man sie erzielt, wenn man die Alkaloide aus der Pflanze extrahiert, die man in der Natur gesammelt oder gezüchtet hat.

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MEER-MÜLLER-STEINMEISTER

Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit in der Weise durchgeführt werden, daß man einen oder mehrere dieser Stämme (von Zellen), die aktiv Alkaloide durch Biosynthese liefern, an Züchtungsbedingungen anpaßt, die mit der Verwendung dieser Stämme für eine industrielle Herstellung der Alkaloide verträglich sind.

Diese Anpassung oder diese Angewöhnung besteht darin, daß man

1. Kulturen, die auf halbfestem Agar-Agar-Medium wachsen, in Kulturen überführt, die in flüssigem Medium wachsen; und

2. Biomassen mit zunehmender Menge verwendet.

Das Kulturmedium ist ein wichtiges Element der Zellenumgebung, die den Gesamtzustand der genetischen Steuerung des Stammes und unter anderem die genetische Information beeinflußt, die die Biosynthese der gewünschten Verbindungen betrifft.

Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, den Beispielen und den Zeichnungen.

Sie zeigen

in Fig. 1a Zellhaufen von in vitro gezüchteten Zellen von Vinca minor L. in 125-facher Vergrößerung, wie sie in vivomittels der Phasenkontrasttechnik beobachtet werden können;

in Fig 1b einen kurzen Faden von in vitro-gezüchteten Zellen von Vinca minor L. in 250-facher Vergrößerung, wie sie in vivo- mit Hilfe der Phasenkontrasttechnik beobachtet werden können;

.in Fig. 2 anhand einer Kurve die Kinetik des Wachstums und die Entwicklung der Dichte einer Kultur des Stamms 13_T in einem Erlenmeyer-Kolben (x = mittleres Frischgewicht einer Kultur; ο = mittlere Dichte);

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HH MtHR-MULLER-STEINMEISTER

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in Fig. 3a anhand einer Kurve die Wachstumskinetik einer Kultur des Stammes 13_T in einem Erlenmeyer-Kolben;

la

in Fig. 3b anhand einer Kurve die Entwicklung der Dichte einer Kultur des Stammes 13 in einem Erlenmeyer-Kolben;

in Fig. 4 anhand einer Kurve die Kinetik des Wachstums und die Entwicklung der Dichte einer Kultur des Stammes 3 in einem Erlenmeyer-Kolben (x = mittleres Frischgewicht einer Kultur; ο = mittlere Dichte);

in Fig. 5a anhand einer Kurve die Wachstumskinetik einer Kultur des Stammes 3_T in einem Erlenmeyer-Kolben;

in Fig. 5b anhand einer Kurve die Entwicklung der Dichte einer Kultur des Stammes 3_T in einem Erlenmeyer-Kolben;

in Fig. 6 anhand einer Kurve die Entwicklung der Dichte als Frischgewicht einer Kultur des Stammes 3_T in einer Fermentiereinrichtung;

in Fig. 7 die Entwicklung der Dichte als Trockengewicht und des "Trockensubstanzgehalts" einer Kultur des Stammes 3_T in

Ij

einer Fermentiereinrichtung (x = Trockengewicht pro Liter; ο = "Trockensubstanzgehalt");

in Fig. 8a die Entwicklung der Dichte als Frischgewicht einer Kultur des Stammes 3_L in einer Fermentiereinrichtung; und

in Fig. 8b die Entwicklung der Dichte als Trockengewicht einer Kultur des Stammes 3_T in einer Fermentiereinrichtung.

Lt

Sämtliche in den folgenden Beispielen beschriebenen Kulturen werden mit Hilfe von Kulturmedien durchgeführt bzw. gezüchtet, die aus verschiedenen, häufig verwendeten Verbindungen bzw. Bestandteilen aufgebaut sind, nämlich: einer Lösung von Mineralstoffen (mineralischer Hauptelemente), wie efine Lösung nach Heller oder nach Murashigue und Skoog, einer Lösung von Spurenelementen, wie die Lösung nach Heller oder nach Murashigue und Skoog,

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einer Eisenquelle,beispielsweise Eisen(III)-Chlorid oder den Eisen(III)-Komplex von Natrium-äthylendiamintetraacetat, einerHauptquelle für organischen Kohlenstoff, beispielsweise Glukose, Saccharose oder ein anderes Kohlenhydrat, einem Vitaminkoinplex, beispielsweise die als "B₁" bezeichnete Lösung (vgl. Beispiel 1),

pflanzlichen Hormonen, das heißt Wuchsstoffe, beispielsweise Auxine und/oder Kinetine,

und gegebenenfalls weiteren wachstumsfördernden Mitteln, wie das flüssige Albumen der unreifen Kokosnuß (Cocos nucifera L.), Kaseinhydrolysat oder Hefeextrakt.

Es werden allgemein Züchtungsbedingungen angewandt, die jenen des auf einem halbfesten Medium wachsenden Stammes, der aufgrund seines Alkaloidreichtums ausgewählt wurde, identisch sind, mit Ausnahme jener Bedingungen, die mit einer Anpassung an eine industrielle Nutzung des Stammes unvereinbar sind (Verfestigung des Mediums, kostspielige Substanzen, und Züchtung in Behältern geringen Fassungsvermögens). In der Tat wird versucht, den genetischen Steuerungszustand des Stammes auf einem Maximum zu halten, das durch die Selektion hinsichtlich des Produktionsvermögens erreicht wurde.

Beispiel 1

Herstellung von getrennten Kulturen von Zellen von Vinca minor L.

in flüssigem Medium.

Unter der Population von Zeilstammen des blaublühenden Immergrüns hat man durch analytisches Aussortieren einen Stamm herausselektiert, der sich durch seine besonders starke Biosynthese von Alakloiden auszeichnet. Sie kann an den Kallussen und dem halbfesten Nährmedium, in dem er sich während des Züchtungszyklus verteilt hat, nachgewiesen werden.

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Dieser Stamm, der mit der Ziffer 13 bezeichnet wird, weist die folgenden Eigenschaften auf:

1 . Er wächst in Röhrchen, die das Nährmedium VO₁ der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Mineralstofflösung nach Heller:

Bestandteile Konzentration in mg/l des Mediums

Kaliumchlorid 750

Natriumnitrat 600

Magnesiumsulfat-

heptahydrat 250

Mononatriumphosphat-

monohydrat 125

Calciumchlorid-

dihydrat 75

Spurenelementlösung nach Heller:
Bestandteile Konzentration in mg/l des Mediums

Zinksulfat-heptahydrat Borsäure

Mangansulfat-tetrahydrat

Kupfersulfat-pentahydrat

Aluminiuirchloridhexahydrat

Kaliumjodid

Nickelchloridhexahydrat

Eisenquelle:

Eisen (III)-chlorid-hexahydrat Kohlenstoffquelle:

Glukose

1
1
0,1

0,03

0,05 0,01

0,03

1 mg/lg des Mediums 000 mg/l des Mediums

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Vitaminlösung B- ϊ
Bestandteile Konzentration in mg/1 des Jfediums

Calciunpantothenat 1

Pyridoxin 1

Nikotinsäure 1

Thiamin 1

Msso-Inosit 10

Biotin O,1

Wachstumsmodifizierungsmittel%

2-{2,4-Dichior-phenoxy)-essigsäure 0,1 mg/1 des Mediums Verfestigungsmittel:

Agar-Agar 7000 mg/1 des Mediums.

Das Medium wird erforderlichenfalls auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt und während 20 Minuten in einem Autoklaven unter einem Dampfdruck von 0,7 bar sterilisiert.

Nach dem Implantieren des als Inokulum verwendeten Kallus¹ auf das Medium bringt man die Röhrchen unter vollständig homogenen Bedingungen auf eine Temperatur von etwa 23⁰C und unterwirft sie den im folgenden definierten Belichtungsbedingungen :

Lichtspektrum der Lampe des Typs Sylvania Gro-Lux, Lichtintensität: Etwa 5000 Lux
Belichtungsperiode: Etwa 16 Stunden pro Tag.

2. Morphologisch zeigen die Kallusse die folgenden Eigenschaften: Sie sind sehr intensiv grün und daher stark chlorophyllhaltig, sie sind nicht morphogen,
sie sind strikt nicht getrennt und

sie besitzen je nach dem fraglichen Bereich eine variable Zerreibbarkeit oder Bröckeligkeit; so ist der untere Bereich, der mit dem halbfesten Medium in Kontakt steht und sich teilweise in dieses hineinerstreckt, wesentlich leichter zerreibbar als die Oberseite des Kallus.

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3. Die Wachstumsgeschwindigkeit dieses Stammes ist so groß, daß sich beim Umpflanzen (Repikieren) des Stammes alle 6 Wochen pro Züchtungszyklus eine Steigerung der Biomasse um etwa 200% der Menge des Implantats ergibt.

Ausgehend von diesem oben definierten Stamm 13 erhält man eine in flüssigem Medium wachsende Kultur, die in einzelne Zellen und kleine Zellgruppen aufgeteilt ist. Zur Bewirkung dieser Anpassung entnimmt man unter aseptischen Bedingungen die den unteren Bereich eines oder mehrerer Kallusse bildende zerreibbare Biomasse. Man inokuliert die Masse in einen sterilen 250ml-Erlenmeyer-Kolben, der 50 ml eines flüssigen Mediums enthält, das dem Medium VO₁ ähnlich ist, natürlich mit Ausnahme des Agar-Agars. Gegebenenfalls kann man zur Erleichterung der Konditionierung des Mediums durch die Zellen die Mengen des Inokulums steigern, indem man auch einen oder mehrere Fragmente des weniger leicht zerreibbaren Teils der Kallusse zusetzt, wobei diese Fragmente eine Rolle spielen, die üblicherweise als "Nährstoffvorrat" bezeichnet wird.(ncurrice)

Die in dieser Weise inokulierten Erlenmeyer-Kolben werden dann folgenden Bedingungen ausgesetzt:

Einer ständigen kreisförmigen Bewegung in horizontaler Richtung mit 120 Umdrehungen pro Minute,
einer Raumtemperatur von etwa 23⁰C und einer restlichen Raumbelichtung mit einer Intensität von 250 bis 500 Lux, die während 16 Stunden pro 24 Stunden aufrechterhalten wird.

Von den ersten 24 Stunden der Züchtungszeit an beobachtet man eine mechanische Zerkleinerung der inokulierten Gewebemassen in Elemente geringerer Größe mit flockigem Aussehen. Etwa 8 bis 10 Tage nach dem Zeitpunkt der Inokulation kann man makroskopisch den Beginn einer Zunahme der Dichte der Kultur und damit der Biomasse feststellen. 4 bis 6 Tage später, das

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heißt etwa 2 Wochen nach der Inokulation, hat die Kultur so weit zugenommen, daß sie ein Umpflanzen in ein neues Nährmedium erlaubt.

Abgesehen von den gegebenenfalls als "Nährstoffvorrat" (nourrices ) zugesetzten Kallussen und den nicht zerteilten bzw. dissoziierten Kallussen verfügt man über eine Kultur, deren Zellhaufen einen maximalen Durchmesser im Bereich von 1,0 bis 1,5 mm aufweisen, und dessen Chlorophyllgehalt wesentlich geringer ist als derjenige des als Ausgangsmaterial eingesetzten Stammes 13. Das mikroskopische Aussehen der Kultur ist in den Fig. 1a und 1b dargestellt, aus denen man erkennen kann, daß die Zellen in Form von kurzen Fäden wachsen, die in gewissen Fällen zu makroskopisch sichtbaren größeren sphärischen Massen vereinigt sind.

Beispiel 2

Definierte Kulturen von fellen von Vinca minor L. in Erlenmeyer-Kolben

Man pflanzt die in Beispiel 1 erhaltenen dissoziierten bzw. getrennten Kulturen in das gleiche Nährmedium um und behandelt die inokulierten Erlenmeyer-Kolben unter den gleichen Bedingungen, wie sie in diesem Beispiel beschrieben sind.

Hierzu trennt man durch Filtrieren mit Hilfe eines Filtertuchs (Blutex Super set Nr. 50, Porengröße = 48 μπι) das flüssige Nährmedium unter aseptischen Bedingungen von der getrennten bzw. nicht-zusammenhängenden Biomasse ab. Nachdem man von der Biomasse die Kallusse aus den Fragmenten von nicht-getrennten Kallussen abgetrennt hat, inokuliert man das Material je nach Größe entweder teilweise oder vollständig in einem frischen Nährmedium VO ^, das kein Agar-Agar enthält. Im allgemeinen erlaubt es die Dichte der erhaltenen getrennten Kultur nicht, sie in mehrere inokuli aufzutrennen, und zwar aus den beiden folgenden wesentlichen Gründen;

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1. Damit man ein Minimum der Heterogenität erreicht, wurden zu der in Beispiel 1 beschriebenen Auftrennung nur die unteren Teile von 3 oder 4 Kallussen verwendet, was eine relativ geringe Pflanzenmasse darstellt. Bei der ersten Überführung in das flüssige Medium beobachtet man kaum ein merkliches Wachsen der Kultur. Die nach Ablauf der Trennungsphase erhaltene Biomasse ist daher nur geringfügig größer als das ursprünglich eingesetzte Implantat.

2. Durch die Unterdrückung von nicht-getrennten Elementen in der Kultur wird insbesondere ihre Größe noch weiter vermindert .

Da die Konditionierung des verwendeten frischen Nährmediums ein minimales Implantat erfordert, ist man im allgemeinen dazu gezwungen, die gesamte nach Beispiel 1 erhaltene Biomasse erneut zu inokulieren. Die Entfernung von nicht-getrennten Gruppen' und des gegebenenfalls verwendeten "NährstoffVorrats" kompensiert in merklichem Umfang die geringfügige Zunahme des Pflanzenmaterials als Folge des Wachstums der getrennten Elemente. Somit geht dieser zweite Zyklus der Züchtung in flüssigem Medium von ' Inokuli aus, deren Größe ungefähr identisch ist mit derjenigen der der Trennung unterworfenen Implantate.

Wie in Beispiel 1 beschrieben, ist die Dauer dieses zweiten Züchtungszyklus in flüssigem Medium in Abhängigkeit von dem beobachteten Wachstum variabel (von 7 bis 15 Tagen). Erforderlichenfalls kann man den Zyklus verlängern, bis man eine Kultur erhält, deren Dichte eine erneute Umpflanzung erlaubt. Dieses methodische Vorgehen des Umpflanzens und der Selektion der getrennten Elemente wird (im allgemeinen vier- oder fünfmal) wiederholt, da der Wachstumsrhythmus der Kultur es nicht erlaubt, die erhaltene Biomasse in mehrere verschiedene Inokuli aufzuteilen.

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Im allgemeinen beobachtet man in dem Maße,, in dem die Anzahl der bereits in einem flüssigen Medium durchgeführten Zyklen zunimmt, eine progressive Verkürzung der Zeitdauer, die zum Erhalt einer umpflanzfähigen Kultur notwendig ist.

Nach dieser Periode der Anpassung ιnd der Stabilisierung erhält man in dieser Weise ausgehend von dem auf halbfestem Medium gezüchteten Stamm 13 eine in flüssigem Medium stabile Kultur, die durch Filtration umgepflanzt und alle 7 Tage in zwei oder drei gleiche Implantate aufgeteilt wurde.

Dieser Stamm, der als Stamm 13_T bezeichnet wird, besitzt die folgenden morphologischen Eigenschaften: Die Biomasse ist hellgrün und enthält damit deutlich weniger Chlorophyll als diejenige des anfänglich eingesetzten Stammes 13, der Stamm ist immer noch strikt nicht morphogen, er besteht aus Elementen, deren Größe zwischen etwa 50 μπι (isolierte Zelle) und 0,5 bis 1,5 mm (Durchmesser der größten sphärischen Gruppierungen) variiert,

der Trennungsgrad (Dissoziationsniveau) ist stabil, das heißt die Größenverteilung der einzelnen Elemente ist bei den verschiedenen Umpflanzungen im wesentlichen konstant, sein zytologisches Aussehen entspricht noch der in der Fig. wiedergegebenen Gestalt.

Physiologisch kann das Wachstum des Stammes 13_T wie folgt gekennzeichnet werden:

Die Züchtung erfolgt in Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 250 ml, 500 ml oder 1000 ml, die 50 oder 100 ml bzw. 200 ml oder 400 ml des in Beispiel 1 definierten Nährmediums VO₁ ohne Agar-Agar enthalten; diese Kolben werden unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen behandelt;

die Kinetik des Wachstums und die Dichte der Kultur werden durch die in den Fig. 2, 3a und 3b wiedergegebenen Kurven verdeutlicht.

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Die Ermittlung der Kurven erfolgte im Verlaufe einer Zeitdauer von 21 Tagen durch regelmäßiges (alle 2 oder 3 Tage) Ermitteln des mittleren Frischgewichts der Kulturen und der mittleren Volumina des entsprechenden Nährmediums, wonach man die beiden gemessenen Elemente durch Filtration trennt.

Es zeigt sich, daß der "Trockensubstanzgehalt¹¹ des Pflanzenmaterials, der das Verhältnis von Trockengewicht zu Frischgewicht darstellt, im wesentlichen während eines Wachstumszyklus konstant ist. Das mittlere Trockengewicht der Kultur pro Erlenmeyer-Kolben entwickelt sich somit parallel zu dem Frischgewicht der Kultur.

Die Fig. 3a und 3b verdeutlichen, daß die Kinetik der Zunahme des Frischgewichts einer Kultur des Stammes 13_ in Abhängigkeit von der Zeit zwei Phasen umfaßt:

a) In dem Zeitraum von ο bis 8 Tagen beobachtet man ein exponentielles Wachstum, das in dem halblogarxthmischen Koordxnatensystem als gerade Linie erscheint. Es ist festzuhalten, daß die Latenzzeit, die in gewissen Fällen zu Beginn der Züchtung von Zellen von höheren Pflanzen auftritt, in diesem Fall praktisch zu vernachlässigen ist. Während dieser exponentiellen Phase beträgt die zur Verdopplung des Frischgewichts der Biomasse notwendige Zeit etwa 3 bis 3 1/2 Tage.

b) Vom 8. bis zum 21. Tag ergibt sich ein langsameres Wachstum, das in dem gleichen Koordxnatensystem als Kurve erscheint, die sich einer Parallelen zur Abszissenachse annähert.

Die Dichte der Kultur nimmt in ähnlicher Weise wie ihr Frischgewicht zu, jedoch schneller und stärker. In der Tat ist diese Entwicklung das Ergebnis zweier Phänomene, nämlich der Zunahme der Biomasse einerseits und der Konzentration des Nährmediums durch Verdampfung andererseits. Diese Zunahme der Dichte der Kultur verläuft geringfügig schneller und stärker als diejenige ihres Frischgewichts, da die Menge des Pflanzenmaterials in einem Medium mit abnehmendem Volumen

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zunimmt.

Neben einem praktischen Gesichtspunkt (leichte Programmierung der Handhabungen) rechtfertigen diese Beobachtungen die Anwendung eines Umpflanzzyklus von 7 Tagen für diesen Stamm 13_T. In der Tat beträgt nach dieser Züchtungszeit die Zunahme der Biomasse etwa 200 bis 300 % des Gewichts des Implantats, so daß man die erhaltene Pflanzenmasse in 3 oder 4 gleiche Inakuli aufteilen kann, währenddem sich die Kultur im Stadium des exponentiellen Wachstums befindet.

Nach der Verfahrensweise dieses Beispiels 2 erhält man somit einen Stamm von Zellen von Vinca minor L. der Bezeichnung 13_T? der in flüssigem Medium gezüchtet werden kann und von dem eine gewisse Anzahl von charakteristischen Eigenschaften wohl bekannt ist. Dieser Stamm ist stabil und kann beliebig oft durch aufeinanderfolgende Umpflanzungen aufrechterhalten und weitergeführt werden. Sr kann als Referenzmaterial und als Grundlage für Untersuchungen hinsichtlich noch größerer Kulturvolumina angewandt werden.

Beispiel 3

Züchtung eines Stammes von Vinca minor L.der Bezeichnung 13 in einem Reaktor

Mit dem gemäß den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Stamm 13_ führt man die Züchtung in flüssigem Medium in Reaktoren mit einem Gesamtvolumen von 4 Litern und einem Nutzvoiumen von 2,6 Litern durch. Es handelt sich hierbei um ein Zwischenstadium zwischen der Züchtung in dem Erlenmeyer-Kolben und der Züchtung in der Fermentiereinrichtung, das notwendig ist, da man zum Implantieren der Fermentiereinrichtung ein Inokulum ausreichender Größe benötigt.

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Der ausgehend von der Vorrichtung von S.B.Wilson, P.J.King und H.E.Street (Exp.Botany, 22, Nr. 70 (Februar 1971) 177 bis 207) entwickelte Reaktor ist dadurch verbessert worden, daß er mit einer von der Rührerwelle angetriebenen mechanischen Antischäumeinrichtung und einem am Luftaustritt angeordneten Rückflußkühler versehen ist, der eine Verminderung des Kulturvolumens durch einfaches Verdampfen des Nährmediums verhindert. Der Reaktor wurde im Rahmen dieses Beispiels niemals kontinuierlich betrieben.

Die Sterilisation der Vorrichtung, die 1,5 1 des Mediums VO., ohne Agar-Agar enthält, erfolgt im Autoklaven während 30 Minuten unter einem Dampfdruck von 1 bar, wobei man den Dampf durch die Vorrichtung zirkulieren läßt.

Nach dem Abkühlen inokuliert man den Reaktor unter Überdruck. Hierfür benutzt man ein Zwischengefäß, genannt "Inokuliervorrichtung", das vier Anschlüsse aufweist (zwei für die Zuführung und die Abführung von steriler Luft und zwei für die Zuführung und die Abführung des Inokulums). Dieses Gefäß wird zuvor durch Einbringen in den Autoklaven während 30 Minuten und bei einem Dampfdruck von 1 bar sterilisiert. Man beschickt diese Vorrichtung mit:

Einerseits 200 ml einer Kultur des Stammes 13_, die man in einem 500ml-Erlenmeyer-Kolben bereitet hat und die ein Alter von 7 Tagen aufweist und sich somit noch in der exponentiellen Wachstumsphase befindet. Die Pflanzenmasse dieser Kultur besitzt ein Frischgewicht von etwa 20 bis 40 g; und andererseits etwa 900 ml des sterilen Mediums VO₁ ohne Agar-Agar.

Anschließend drückt man das Ganze mit Hilfe von unter Druck stehender steriler Luft in den Reaktor, wodurch man das Inokulum zuführt und das Gesamtvolumen auf 2,6 1 bringt (1,5 1+ O,2 1 + 0,9 1).

Die angewandten Züchtungsbedingungen sind die folgenden; Restliche Beleuchtung: Etwa 250 Lux,

Züchtungstemperatur: 30°C (selbsttätig thermostatisierte Vor-' richtung),

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ILH MLhFi-MULLLIt- b I LINMLISTER

Belüftung: 0,2 bis 0,3 1 sterile Luft pro Minute, das heißt 0,08 1 pro Liter pro Minute bis 0,12 1 pro Liter pro Minute, Rühren mit aufgehängtem Magnetstab, der sich mit einer Geschwindigkeit von 60 bis 80 Umdrehungen pro Minute dreht, teilweise Zerstörung des sich gegebenenfalls bildenden Schaumes durch Rotation einer Antischäumvorrichtung, die sich mit gleicher Geschwindigkeit wie der Rührer bewegt.

Man verfolgt die Entwicklung der Kultur durch tägliche Überwachung der oben angegebenen Parameter und gegebenenfalls durch regelmäßige Entnahme von Proben der Kultur, die steril und unter Überdruck erfolgt.

An einer Probe bestimmt man das Frischgewicht und das Trockengewicht der Biomasse und errechnet daraus ihren "Trockensubstanzgehalt". Man kann erforderlichenfalls auch eine bakteriologische Untersuchung der Kultur durchführen, um ihre Sterilität zu prüfen.

Wenn sich an den Wänden des Reaktors oder den in das Nährmedium eintauchenden Einrichtungen Zellabscheidungen bilden, kann man den gesamten Reaktor manuell bewegen bzw. schütteln, um die Zellabscheidungen wieder in Suspension zu bringen. In dieser Weise verhindert man eine mögliche Nekrose oder ein mögliches Absterben dieser Zellhaufen, was das Risiko einer Zerstörung der gesamten Kultur zur Folge haben könnte.

Nach 10 bis 12 Tagen des Wachstums unter diesen Bedingungen erhält man eine Biomasse, deren Frischgewicht etwa 120 bis 240 g beträgt, was einer Steigerung in Bezug auf das ursprüngliche Implantat um etwa 500 %, das heißt einem ähnlichen Wachstum wie demjenigen entspricht, das man nach 2 1/2 Zellteilungszyklen in der exponentiellen Phase erhält. Insgesamt erzielt man eine scheinbare Verdopplungszeit der Biomasse von etwa 4 bj.s 6 Tagen, die etwas länger ist als die des gleichen in einem Erlenmeyer-Kolben gezüchteten Stammes.

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In der Tat bleibt der Rhythmus im wesentlichen der gleiche, ob man die Züchtung nun in einem Reaktor oder in einem Kolben bewirkt. Die Verminderung der gesamten Wachstumsgeschwindigkeit ist lediglich eine Folge der Tatsache, daß das Wachstum nicht ständig in der exponentiellen Phase erfolgt.

Zunächst tritt in gewissen Fällen eine Latenzzeit in der Größenordnung von 1 bis 2 Tagen auf, die wahrscheinlich darauf zurückgeht, daß das Implantat des Reaktors wesentlich geringer ist (etwa 7 bis 15g pro Liter) als das Implantat des Erlenmeyer-Kolbens (etwa 30 g).

Weiterhin dauert das exponentielle Wachstum nur 7 bis 8 Tage, wonach die Geschwindigkeit der Zunahme der Biomasse schnell nachläßt.

Abgesehen von diesem Unterschied, der lediglich durch Änderungen der experimentellen Bedingungen verursacht wird (Implantationsdichte und Züchtungszeit), bleiben die morphologischen und physiologischen Eigenschaften des in dem Reaktor gezüchteten Stammes 13_T praktisch identisch gegenüber denjenigen des gleichen Stammes, der in einem Erlenmeyer-Kolben gezüchtet wurde (vgl. Beispiel 2).

Nach dem Verfahren dieses Beispiels erhält man die minimale Menge der Biomasse aus Zellen von Vinca minor L. (Stamm 13,), die dazu ausreicht, ein Kulturvolumen von etwa 12 1 zu inokulieren.

Beispiel 4

Züchtung eines Stammes von Zellen von Vinca minor L. der Bezeichnung 3_T in einem Reaktor.

Ll

Man erhält einen Stamm mit der Bezeichnung 3_T von Zellen von

Ij

Vinca minor L,, den mann in flüssigem Medium in Erlenmeyer-Kolben gezüchtet hat, ausgehend von dem Stamm 3, den man auf-

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grund seines Alkaloidreichtums ausgewählt hat und der auf einem halbfesten Medium aufrechterhalten bzw. gezüchtet wird. Dieser Stamm 3 besitzt die folgenden morphologischen Eigen-

Li

schäften:

Seine Biomasse ist weiß und daher absolut frei von Chlorophyll, der Stamm ist strikt nicht morphogen,

er besteht aus Elementen, deren Teilchengröße zwischen einem Durchmesser von etwa 50 μΐη (isolierte Zelle) und 1,5 mm variiert (größere sphärische Zellgruppierungen), sein Trennungsgrad ist stabil,

sein zytologisches Aussehen ist im wesentlichen identisch mit dem des Stammes 13_T, natürlich mit dem Unterschied, daß in dem

Li

letzteren Stamm Chlorophyll vorhanden ist.

Physiologisch kann das Wachstum des Stammes 3 wie folgt charakterisiert werden:

Die Züchtung erfolgt unter den gleichen Bedingungen hinsichtlich des Mediums und der Umgebung, wie sie zur Aufrechterhaltung des Stammes 13_T angewandt wurden,wobei das Volumen des in

Li

einen 250ml-Kolben eingebrachten Nährmediums 50 oder 100 ml betragen kann;

die Wachstumskinetik und die Entwicklung der Dichte der Kultur sind in den Kurven der Fig. 4, 5a und 5b wiedergegeben. Diese Kurven besitzen die gleichen Definitionen, wie sie in Beispiel 2 angegeben sind. Auch in diesem Fall entwickelt sich das Trockengewicht im wesentlichen parallel zu dem Frischgewicht .

Bei diesem Stamm 3_T verläuft das Wachstum nicht identisch zu

Li

dem des oben beschriebenen Stammes 13_T. Es umfaßt drei Phasen

Li

und verläuft nicht in klassischer Weise, das heißt ist nicht mit jenem Wachstum vergleichbar, das man häufig bei Kulturen von Zellen von höheren Pflanzen beobachtet. Diese drei Phasen sind die folgenden:

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a) Vom ersten bis zum sechsten Tag zeigt das Wachstum eine konstante und schnelle Verlangsamung. Dies verdeutlicht sich durch eine gekrümmte Kurve, die sich in einem halblogarithmischen Koordinatensystem an eine Parallele zu der Abszisse annähert.

Im Gegensatz dazu wird bei anderen Stämmen während dieser Zeitdauer zu Beginn des Züchtungsvorganges häufig eine Latenzzeit durchlaufen, die sich durch eine mehr oder weniger starke Beschleunigung der Geschwindigkeit der Zunahme der Biomasse auszeichnet.

Für den Stamm 3_T kann diese anfängliche Entwicklung wie folgt interpretiert werden: Es tritt praktisch keine Latenzzeit auf und die beim Umpflanzen bzw. Repikieren unterbrochene exponentielle Phase setzt sich fort. Sie endet nach 1 oder 2 Tagen, wonach man, nach etwa 2 bis 6 Tagen, ein konstantes Nachlassen der Zunahme des Frischgewichts feststellt. Biologisch ist dieses Phänomen durch das schnelle Auftreten einer Situation gekennzeichnet, in der das Wachstum der Kultur mehr und mehr in deutlicher Weise durch einen physikalischen oder chemischen Faktor hinsichtlich der Zellenumgebung eingeschränkt wird.

b) Vom 6.bis zum 15. Tag beobachtet man ein exponentielles Wachstum der Kultur, das sich in dem halblogarithmischen Koordinatensystem als eine gerade Linie bemerkbar macht.

c) Vom 15. bis zum 21. Tag zeigt die Zunahme der Biomasse erneut eine Periode der konstanten Verlangsamung.

Wie zuvor manifestiert sich dies in dem gewählten Koordina- _Λ tensystem in einer gekrümmten Kurve, die sich an eine Parallele zu der Abszissenachse annähert.

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TbH Mi.LH- MULLLH SILINMLISIEH

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Diese beiden letzteren Phasen sind ähnlich jenen, die man üblicherweise bei Kulturen von Zellen von höheren Pflanzen feststellt, einschließlich der Kultur des Stammes 13_ (siehe

L Beispiel 2). Wie im Falle des letzteren Stammes entwickelt sich die Dichte der gebildeten Kultur ähnlich wie ihr Frischgewicht, jedoch schneller und stärker.

Die Häufigkeit der zur Aufrechterhaltung des Stammes 3_T not-

Li

wendigen Umpflanzungen oder Repikierungen beträgt 7 Tage. Nach Ablauf dieser Zeit beträgt die Zunahme der Biomasse 100% in Bezug auf das Implantat, waS₇ grob gesprochen.einem Zyklus der Zellteilung entspricht. Man kann somit diesen Stamm dadurch aufrechterhalten, daß man die erhaltene Pflanzenmasse alle 7 Tage in zwei gleiche Inokuli aufteilt. Die Kultur wird in dieser Weise in den Grenzen der Phasen a und b umgepflanzt.

Die Kultur dieses Stammes 3_T in dem Reaktor erfolgt in der Vorrichtung und unter den Bedingungen hinsichtlich der Inokulation und der Entwicklung, wie sie in Beispiel 3 beschrieben sind, mit Ausnahme der Beleuchtungsbedingungen. In der Tat kann die Züchtung entweder in vollständiger und permanenter Dunkelheit oder bei geringer belichtung erfolgen.

Ausgehend von einem Inokulum, dessen Frischgewicht etwa 30 g beträgt, erhält man unter diesen Bedingungen nach 15 Tagen des Wachstums eine Biomasse mit einem Frischgewicht von etwa 120 g, was in Bezug auf das ursprüngliche Implantat einer Zunahme von 300% entspricht. Die Entwicklung des Stammes 3_T zeigt somit eine

Li

Kinetik und ein Gesamtergebnis, die im wesentlichen identisch sind, gleichgültig ob die Züchtung in einem Erlenmeyer-Kolben oder in einem Reaktor erfolgt. Die oben beschriebenen morphologischen und physiologischen Eigenschaften bleiben ebenfalls unverändert.

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ILM Ml I M- MUl I 1 M IiILINMLKiItH

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Beispiel 5

Züchtung e:

Vinca minor L. in einer Fermentiereinrichtung.

Züchtung eines Stammes der Bezeichnung 3_ von Zellen von

Xj

Die Herstellung von Alkaloiden durch Züchtung von Zellen von Vinca minor L. kann für eine industrielle Nutzung nur mit ausreichend großen Vorrichtungen vom Typ eines Fermenters durchgeführt werden. In der Tat sind die Ausbeuten an den durch Biosynthese gebildeten Verbindungen, selbst im Fall eines selektionierten Stammes, relativ niedrig, gleichgültig ob man die Züchtung in situ oder in vitro bewirkt.

Doch ist in gewissen Fällen der Gehalt an Alkaloiden, die von Gewebekulturen synthetisiert wurden, größer als jener, den man im allgemeinen in den Pflanzen feststellt, aus denen die Gewebekulturen bereitet wurden.

Sämtliche oben beschriebenen Beispiele betreffen die verschiedenen Stufen, die in der Praxis unerläßlich sind, um die Stämme anzupassen und das vorliegende Stadium zu erreichen.

Der Ausdruck "Fermenter" oder "Fermentiereinrichtung", wie er hierin verwendet wird, steht für die verwendete Vorrichtung, bedeutet jedoch nicht, daß es sich um Fermentationen im bakteriologischen Sinne des Ausdrucks handelt.

Bei dem für die in diesem Beispiel 5 beschriebenen Arbeiten eingesetzten Fermenter handelt es sich um eine Vorrichtung mit einem Gesamtvolumen von 15 1 und einem Nutzvolumen von 12 1, die unter der Bezeichnung "Magnaferm" von der Societe New Brunswick vertrieben wird. Er ist mit einer Einrichtung versehen, die die sterile Entnahme einer Probe der Kultur zu jedem Zeitpunkt ermöglicht. Dieses System umfaßt einen 150ml-Kolben, der mit einem in die Kultur eintauchenden Rohr und einer Wasserreserve zum Spülen der Entnahmeleitungen verbunden

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TER MEfciR-MÜLLER-STEINMElSTER

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ist. Andererseits ist die Hauptvorrichtung mit Einrichtungen zur Bestimmung, zur Aufzeichnung und zur Steuerung des pH-Wertes und der in dem Kulturmedium gelösten Sauerstoffmenge ausgerüstet.

Man beschickt den Fermenter mit 10 1 des Mediums VO.., das keinen Agar-Agar enthält, und sterilisiert das Ganze, einschließlich der Entnahmeeinrichtung, im Autoklaven während 40 Minuten unter einem Dampfdruck von 1 bar. Eine notwendige Vorsichtsmaßnahme besteht darin, den Dampf durch die Vorrichtung und die verschiedenen damit verbundenen Leitungen und Filter strömen zu lassen.

Nach dem Abkühlen eicht man die Vorrichtungen zur Bestimmung des pH-Wertes und der Dichte des gelösten Sauerstoffs unter den physikalischen Bedingungen (Temperatur, Bewegung und Belüftung) , die anschließend aufrechterhalten werden.

Man inokuliert den Fermenter derart,, daß man die zuvor erwünschte Zellendichte zu Beginn der Züchtung erreicht (im Prinzip 5 bis 15 g/l). Hierzu drückt man, nachdem man unter sterilen Bedingungen eine Leitung von einem Reaktor mit einer anderen des Fermenters verbunden hat, mit Hilfe von steriler Luft eine Kombination aus dem Medium und den Zellen eines Teils der etwa 2,5 1, die in dem Reaktor enthalten sind und zur Erzielung einer homogenen Durchmischung gerührt werden, in den Fermenter.

Die Größe des inokulierten Volumens wird durch zwei Kriterien definiert, nämlich die Dichte der Kultur gegen Ende des Zyklus in dem Reaktor einerseits und die gewünschte Dichte der Kultur zu Beginn des Zyklus in dem Fermenter andererseits.

Wenn man somit über ein Gesamtinokulum mit einem Frischgewicht von 120 g verfügt, so daß sich eine Dichte von 48,Og pro Liter /120 ergibt, und man die Züchtung in dem Fermenter mit einer

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TER MEER- MULLEH -ÜTEINMEISTER

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Dichte von etwa 6 g pro Liter beginnen will, inokuliert man demzufolge 1,5 1.

In diesem Fall beträgt das Gesamtvolumen zu Beginn des Zyklus 11,5 1 (10 1 + 1,5 1) .

Der restliche Teil des Inokulums wird im allgemeinen dazu verwendet, gewisse Eigenschaften des Inokulums zu bestimmen, wie seine genaue Dichte und seinen genauen "Trockensubstanzgehalt", zur Überprüfung der Sterilität und des Gesamtalkaloidgehaltes des inokulierten Nährmediums und der inokulierten Biomasse.

Die zur Züchtung in dem Fermenter angewandten Bedingungen sind die folgenden:

Vollständige und permanente Dunkelheit, Temperatur des Nährmediums: 30°C + 0,2°C, Belüftung: 1,5 1 sterile Luft pro Minute, das heißt 0,121 1 pro Liter pro Minute,

man rührt mit einer Achse, die Schaufelblätter in zwei Ebenen aufweist, und rührt mit einer Rührgeschwindigkeit von 100 Umdrehungen pro Minute,

erforderlichenfalls bewegt man die AntiSchäumeinrichtung mit einer Geschwindigkeit zwischen 300 und 1500 Umdrehungen pro Minute, je nach dem Umfang des Schaumes, der sich auf der Oberfläche des Nährmediums bildet.

Sämtliche oben definierten Parameter werden regelmäßig überwacht (zweimal täglich) und gegebenenfalls nachreguliert. In gleicher Weise bringt man, falls erforderlich, täglich die gesamten oder einen Teil der Zellabscheidungen wieder in Suspension, die sich an den Wänden oder den Inneneinrichtungen des Fermenters ansammeln können und für die das Risiko einer Nekrose besteht. Hierzu beschleunigt man die Rührgeschwindigkeit stark und sehr kurz, wodurch Wirbel gebildet werden, die diese Abscheidungen mitnehmen.

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IH MEEFi- MÜLLER - ti I fc INMEISTEH

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Han entnimmt ebenfalls regelmäßig entsprechend der Wachstumsphase und den beabsichtigten Kontrollen unter sterilen Bedingungen eine repräsentative Probe der Kultur mit einem Volumen von etwa 100 ml. Anhand dieser Probe bestimmt man das Frischgewicht, das Trockengewicht und damit den "Trockensubstanzgehalt" und gegebenenfalls den Gehalt an den gesamten Alkaloiden, die in dem Nährmedium verteilt sind. Man kann natürlich auch die in dieser Weise bestimmten Werte auf einen Liter beziehen, das heißt die verschiedenen die Dichte der Kultur betreffenden Eigenschaften definieren. Bei dieser Gelegenheit kann man auch das entnommene Material bakteriologisch untersuchen, um die Sterilität der Kultur zu überprüfen.

Der pH-Wert des Mediums und sein Gehalt an gelöstem Sauerstoff werden kontinuierlich gemessen und registriert. Der pH-Wert variiert zwischen 5,2 bis 5,4 und 6,0 bis6,5. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff nimmt vom Beginn bis zum Ende des Wachstumszyklus um etwa 20% des Gehaltes ab, den man bei maximalem Betrieb der Vorrichtung hinsichtlich der Belüftung (15 l/Min) und des Rührens (700 UpM) mißt. So beträgt der Sauerstoffgehalt vor der Inokulation unter normalen Züchtungsbedingungen etwa 80% des maximalen Gehalts, während der Sauerstoffgehalt zum Ende des Zyklus nur noch etwa 60 % des Maximums entspricht.

21 Tage nach der Inokulation schaltet man die Vorrichtung ab und gewinnt das Nährmedium einerseits und die Biomasse andererseits, indem man diese Bestandteile mit Hilfe eines Filtertuchs (Blutex Superset Nr. 50) trennt. Das erhaltene Volumen des Mediums beträgt etwa 10 1. Es entspricht dem Volumen zu Beginn des Wachstumszyklus abzüglich der verschiedenen Entnahmen (etwa 10 bis 15), die im Verlaufe der 21 Tage durchgeführt wurden. Die Abnahme des Materials durch Verdampfen ist wegen des am Luftauslaß der ursprünglichen Vorrichtung angeordneten Rückfluß kühl er s und wegen des angewandten geringen Belüftungs<-

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TEH MEtFi-MULLfcK- STtINMtISTER

- 25 grades sehr gering.

Die in dieser Weise von dem Nährmedium abgetrennte Biomasse besitzt ein Frischgewicht von etwa 540 g, was einer Dichte von etwa 54 g/l entspricht.

Die Fig. 6, 7, 8a und 8b zeigen die Entwicklung der verschiedenen Parameter im Verlaufe des 21-tägigen Züchtungszyklus, der von einem Inokulum von 70 g ausgeht, das sich in einem bekannten Differenzierungszustand befindet.

Die Entwicklung der Wachstumskinetik umfaßt drei Phasen (siehe die Fig. 8a und 8b).

a) Vom nullten bis zum 2,5. Tag beobachtet man eine klassische Latenzphase, die durch eine progressive Zunahme der Wachstumsgeschwindigkeit gekennzeichnet ist. Diese Phase trifft man üblicherweise bei den Kinetiken der Züchtung von Zellen von höheren Pflanzen an. Im Fall der Zellen des Stammes 3_T kann

Li

sie auftreten oder nicht auftreten oder durch eine Phase ersetzt sein, bei der die Zunahme der Biomasse konstant nachläßt (vgl. Beispiel 4). Diese unterschiedlichen Arten der Entwicklung des Wachstums im Verlaufe der ersten Tage des Züchtens von Zellen des Stammes 3_ zeigen sich sämtlich bei der Untersuchung in dem Fermenter. Ihr Auftreten ist neben anderen Faktoren mit dem Zustand der Differenzierung der Zellen des Inokulums, der Größe des Inokulums und demzufolge der Dichte zu Beginn des Zyklus verknüpft.

b) Von 2,5 Tagen bis 14 Tagen erfolgt eine exponentielle Zunahme der Biomasse, was sich in dem halblogarxthmischen Koordinatensystem in einer geraden Linie manifestiert.

c) Von 14 bis 21 Tagen beobachtet man eine Phase des "Eintretens in ein Plateau", in dessen Verlauf das Wachstum sich konstant

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TER MiILH-MULLLM -SILINMbIbItR

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verlangsamt, was in dem gleichen Koordinatensystem als gekrümmte Kurve erscheint, die sich einer Parallelen zu der Abszissenachse annähert.

Aus den Fig. 7, 8a und 8b ist festzustellen, daß die Entwicklung der Dichte der Kultur, ausgedrückt als Trockengewicht pro Liter, im wesentlichen identisch ist der Dichte der Kultur, die als Frischgewicht ausgedrückt wird. Der einzige merkliche Unterschied betrifft die Phase c, die im Fall des als Trockengewicht ausgedrückten Wachstums weniger deutlich und weniger schnell verläuft als im Fall des als Frischgewicht ausgedrückten Wachstums. Diese Tatsache ist mit einer merklichen Zunahme des "Trockensubstanzgehaltes" nach 13 oder 14 Tagen verknüpft und drückt eine erhebliche Zellendifferenzierung aus, die wahrscheinlich eine Ansammlung von Substanzen in dem Zytoplasma umfaßt. Das Wachstum,als Trockengewicht gerechnet, ist in der Tat das Ergebnis der Zellenteilung, jedoch auch der Entwicklung der Menge des Trockenmaterials pro Zelle, das heißt ein Element der Differenzierung.

Die Dichten zu Beginn und zum Ende des Zyklus der Züchtung des Stammes 3 in dem Fermenter sind sehr variabel (5 bis 15 g/l bzw. 40 bis 120 g/l). Obwohl die Art der Entwicklung der oben beschriebenen verschiedenen Parameter klassisch ist, ist es nicht die einzige Art, die man im Verlaufe dieser Untersuchungen beobachtet. Die merklichen Unterschiede zwischen den verschiedenen erreichten Wachstumskinetiken beeinflussen im wesentlichen die Eigenschaften der Phase a und die entsprechenden Dauern der Phasen a, b und c. Da die Änderungen des pH-Wertes und des Gehalts des in dem Nährmedium gelösten Sauerstoffs direkt oder indirekt mit den Änderungen des Wachstums in Korrelationstehen, ist die Art der Entwicklung dieser Parameter ebenfalls entsprechend der betreffenden Ausführungsform variabel.

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TER MEER-MULLEH-STEINMEISTER

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Abgesehen von den obengenannten eventuell auftretenden Unterschieden behalten die Kulturen der in dem Fermenter gezüchteten Zellen (Stamm 3_T) von Vinca minor L. ihre charakteristischen

Ll

morphologischen und physiologischen Eigenschaften bei, die identisch sind mit jenen Eigenschaften, die zur Definition dieses Stammes in Beispiel 4 beschrieben wurden.

Nach diesem Beispiel 5 erhält man somit einerseits etwa 540 g (Frischgewicht) Zellen von Vinca minor L., Stamm 3_T, und

Xj

andererseits 10 1 eines Kulturmediums, das zu ihrer Vermehrung gedient hat. An diesen beiden Bestandteilen einer Kultur kann man Untersuchungen in Bezug auf Sekundärverbindungen, wie Alkaloide, durchführen.

Beispiel 6

Züchtung eines Stammes von Zellen von Vinca minor L.,Stamm 13^, in einem Fermenter

Nach Beispiel 3 züchtet man Zellen des Stammes 13_L in einem Reaktor und erhält in dieser Weise eine Biomasse, die dazu ausreicht, ein Volumen von 12 m zu inokulieren.

Unter Bedingungen,die strikt gleichartig den in Beispiel 5 beschriebenen sind, mit Ausnahme der Beleuchtung, die hier auf einem Restniveau von 250 Lux gehalten wird, züchtet man diesen Stamm 13_ in einem Fermenter. Nach 21 Tagen ergibt die Züchtung eine Biomasse, deren physiologische und morphologische Eigenschaften ähnlich denen sind, die in Beispiel 2 hinsichtlich des Stammes beschrieben sind, der in einem Erlenmeyer-Kolben gezüchtet wurde.

In dieser Weise erhält man gemäß Beispiel 6 Proben eines Pflanzenmaterials von Vinca minor L. (Stamm 13.) und das zu seiner Vermehrung benutzte Nährmedium in einer solchen Menge, daß man Untersuchungen in Bezug auf Sekundärverbindungen, wie Alkaloide, durchführen kann.

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TER MEER-MÜLLER-SIEINMEISTER

7603588

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Beispiel 7

Extraktion von Alkaloiden aus der Biomasse und dem Nährmedium, die beim Züchten von Zellen von Vinca minor L. (Stamm 3 ) in einem Fermenter anfallen.

Nach der Verfahrensweise des Beispiels 5 erhält man eine Biomasse aus Zellen von Vinca minor L. (Stamm 3_T), deren Frischgewicht etwa 540 g beträgt. GIe' :hzeitig erhält man etwa 10 1 eines Nährmediums, das zur Vermehrung dieser Zellen gedient hat.

Man extrahiert die gesamten Alkaloide aus diesen Proben und trennt, falls es für die angestrebte Produktion notwendig ist, gegebenenfalls die darin enthaltenen Verbindungen, um sie zu identifizieren.

Hierzu gewinnt man nach dem Ende eines Wachstumszyklus von 21 Tagen unter nicht-aseptischen Bedingungen und unter Anwendung von Überdruck das aus dem Nährmedium und den Zellen bestehende, in dem Behälter enthaltene Material.

Man trennt die beiden Bestandteile der Kultur durch Filtration über ein Filtertuch, dessen Porenweite 48 μΐη beträgt. Die Trennung des Nährmediums von der Pflanzenmasse erfolgt hierdurch in reproduzierbarer Weise. Es bleiben jedoch Pflanzenbruchstücke in dem Filtrat in Suspension, während in ähnlicher Weise die Zellgruppen auch noch Teile des Mediums enthalten. Die Grenze der Trennung ist somit willkürlich auf das Element festgelegt, das die gleiche Größe besitzt wie die isolierte Zelle, wodurch jedoch ein leichter Vergleich der Ergebnisse möglich wird.

Die erhaltene Biomasse besitzt ein Frischgewicht von 540 g (siene Beispiel 5). Wenn man sie nicht sofort behandeln kann, konserviert man sie durch Gefrieren oder durch Gefriertrocknung.

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TER MEER-MÜLLER-SIEINMEISTER

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Die flüssige Phase muß nach sehr kurzer Zeit nach dem Austreten aus dem Fermenter extrahiert werden. In dieser Weise hat eine Verunreinigung weder die Zeit dazu, sich zu entwickeln noch dazu, die chemische Zusammensetzung der untersuchten Probe zu verändern.

Die zur Extraktion der gesamten Alkaloide angewandten Techniken sind die folgenden:

1. Wenn man von dem Nährmedium ausgeht:

Man engt bei 6O°C unter vermindertem Druck ein, bis man eine Verminderung des Volumens um 9/10 seines anfänglichen Wertes erreicht hat, das heißt bis man ausgehend von 10 1 einen Rückstand von etwa 1 1 erhalten hat;

man säuert mit 5%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 1 an;

man stellt mit konzentriertem Ammoniak auf einen pH-Wert von 9 bis 10 alkalisch;

man setzt 1 Volumen analysenreines Chloroform pro 2 Volumen der wässrigen Phase zu;

man rührt das Ganze lang und heftig;

man filtriert über eine Glasfritte Nr. 3; man dekantiert;

man trennt die beiden Phasen durch Filtration über ein hydrophobes Filter voneinander. Diese Stufe erleichtert die Verhinderung von Emulsionen, die durch die Anwesenheit von starken Glukosekonzentrationen in dem Nährmedium auftreten (siehe Beispiel 1);

man trocknet die Chloroformphase durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat;

man engt bei 40⁰C und unter vermindertem Druck bis zum Erhalt eines trockenen Rückstands ein;

man gewinnt diesen Rückstand;

man untersucht mit Hilfe des Reagens nach Meyer die Alkaloidart der in dieser Weise erhaltenen Verbindungen; man führt eine gravimetrische Bestimmung des Trockenextrakts

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EH MEER-MULLEH-SrtilNMEISTER

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durch.

Die Wahl dieser vereinfachten Methode, die keine strikt klassische Methode darstellt, ist durch die Art des zu behandelnden Produkts gerechtfertigt. In der Tat enthält ein Nährmedium, das zur Vermehrung von Zellen von höheren Pflanzen in einem Fermenter eingesetzt wurde, wesentlich weniger Verbindungen, die mit den Alkaloiden in Wechselwirkung treten oder auf diese einwirken könnten, als die trockenen Pflanzen der gleichen Art, was auf der Unlöslichkeit dieser Verbindungen in wässrigem Medium oder ihre strikte Lokalisation in gewissen Zellbereichen beruht. Andererseits sind die anfänglich in das Nährmedium eingeführten Produkte gut bekannt und das maximale Ausmaß ihrer gegebenenfalls auftretenden Wechselwirkung kann leicht quantitativ ermittelt werden.

In Abhängigkeit von der durchgeführten Herstellung werden verschiedene trennende und analytische Untersuchungen des erhaltenen Alkaloidextrakts ausgewählt und durchgeführt, nämlich: Spezifische Reaktionen;

Dünnschichtchromatographien in Gegenwart von Kontrollverbindungen und Bestimmung von R_f-Werten; Chromatographien auf dicker Schicht; Flüssigkextschromatographien unter hohem Druck; Spezifische Nachweise;

Untersuchung der Absorptionsspektren der getrennten Verbindungen im Ultraviolett- und Infrarot-Bereich; Elementaranalyse; etc.

Das gemäß Beispiel 5 erhaltene Nährmedium ergibt in dieser Weise einen trockenen Extrakt der gesamten -Alkaloide, dessen »Eigenschaften die folgenden sind:

Quantitativ besitzt der Extrakt ein Trockengewicht von etwa 450 mg, was einem Alkaloidgehalt des Nährmediums von

45 mg/1 bzw. 0,04 5 _ ₀ ^ des Trockengewichts des diese Ver- ~T7ä~ - 2,b %

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TER MtEER-MULLEH-STEINMEISTER

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bindungen enthaltenden Pflanzenmaterials entspricht, da die Dichte der Kultur nach Ablauf von 21 Tagen 1,8 g/l (Trockengewicht) beträgt.

Es ist festzuhalten, daß der Gesamtgehalt an Alkaloiden von Vinca minor L bei der in situ gezüchteten Pflanze selten mehr als 1 % des Trockengewichts beträgt.

Qualitativ umfaßt der Trockenextrakt etwa 20 verschiedene Alkaloide, von denen gewisse typische Vincaminderivate darstellen.

2. Wenn man von der von dem Medium abgetrennten Biomasse ausgeht :

Je nach der Art der Konservierung trocknet man das Material gegebenenfalls durch Entwässern in einer "Feststoffbirne" (poire a solides) mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei einer Temperatur von 50⁰C bis 60°C unter vermindertem Druck. In dieser Weise erhält man etwa 18 g des trockenen Materials; man zerkleinert das Material bis zum Erhalt eines feinen Pulvers;

man siebt das Material;

man stellt mit einer 5%igen wässrigen Natriumcarbonatlösung alkalisch;

man homogenisiert das Material;

man entwässert unter vermindertem Druck im Ofen bei 40°C; man zerkleinert erneut und siebt anschließend; man extrahiert das zerkleinerte Material in der Kälte während 30 Stunden in einer Doppelextraktionsvorrichtung mit Hilfe von Benzol, das man seinerseits mit 5%iger Schwefelsäure zurückextrahiert;

* man zieht die beiden flüssigen Phasen ab; . . dekantiert sie in einen Kolben;

trennt und entfernt die Benzolphase und gewinnt die wässrige Phase;

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TEH MELFH-MÜLLER- :>[ EINMEISTER

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stellt mit konzentriertem Ammoniak auf einen pH-Wert von 9 bis 10 alkalisch;

extrahiert diese wässrige alkalische Phase dreimal mit analysenreinem Chloroform;

crocknet die vereinigten Chloroformphasen über wasserfreiem Natriumsulfat;

engt unter vermindertem Druck bei 40⁰C bis zum Erhalt eines trockenen Rückstands ein;
gewinnt diesen Rückstand;

prüft die Alkaloidart der in dieser Weise erhaltenen Verbindungen mit Hilfe des Reagens nach Meyer; und führt eine gravimetrische Bestimmung des Trockenextrakts durch.

Diese Extraktion in der Kälte wird angewandt, um die stets möglichen Veränderungen der gewünschten Verbindungen weitgehend zu vermeiden.

Den in dieser Weise erhaltenen trockenen Rückstand unterwirft man den Trennverfahren und analytischen Untersuchungen, die ähnlich jenen sind, die man auf den Extrakt aus dem Nährmedium angewandt hat.

Nach dieser Technik gewinnt man eine Mischung der gesamten Alkaloide, deren Eigenschaften die folgenden sind: Quantitativ besitzt sie ein Trockengewicht von etwa 35 mg, was einem Alkaloidgehalt des Trockenmaterials von 0,035 ,

18

das heißt etwa 0,2% entspricht. Dieser Gehalt ist um den Faktor 12,5 geringer als der des Nährmediums, das auf die Trockengewichtdichte der Kultur gebracht worden ist (2,5%).

Qualitativ sind die Verschiedenartigkeit einerseits und die Art andererseits der verschiedenen Verbindungen des Extrakts der Biomasse vollständig vergleichbar den entsprechenden

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TER MEER-MÜLLER- ί-,Ί EINMEIÖTER

- 33 Eigenschaften des Extrakts aus dem Nährmedium.

In dieser Weise beträgt die Gesamtmenge der Alkaloide in der Kultur von Zellen von Vinca minor L. (Stamm 3 ), die in einem Fer-

JLj

menter gezüchtet wurde, nach einer Wachstumszeit von 21 Tagen 4 50 + 35 = 485 mg. Die insgesamt produzierte Menge, bezogen auf das Trockenmaterial, beträgt daher 0,485 _ _o ,».,

~T8 " ^/i>y*

was wesentlich mehr ist (fast das Dreifache) als den Gehalt, den man häufig in der trockenen Pflanze antrifft, obwohl die Herstellung der Materialien in diesem Fall in vitro wesentlich schneller (21 Tage) erfolgt als in situ (wo 1 bis 2 jährliche Ernten möglich sind).

Andererseits verteilt sich die Hauptmenge der durch Biosynthese gebildeten Produkte in dem Nährmedium (etwa 92,8 %), was einen erheblichen technologischen Vorteil darstellt.

Gemäß der Verfahrensweise des Beispiels 7 erhält man somit etwa 485 mg der gesamten Alkaloide, die Vxncamxnderivate enthalten und die aus einer Kultur von Zellen von Vinca minor L. (Stamm 3_T) extrahiert worden sind, die ihrerseits

Ij

nach der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrensweise in einem Fermenter gezüchtet wurde.

Beispiel 8

Extraktion von Alkaloiden aus der Biomasse und dem Nährmedium einer Kultur von Zellen von Vinca minor L. (Stamm 13_T),

die in einem Fermenter gezüchtet wurde.

Nach Beispiel 6 erhält man im Verlaufe von 21 Tagen durch Züchten in einem Ferjnenter eine Biomasse aus Zellen von Vinca minor L, (Stamm 13,.),wobei man das für die Vermehrung verwendete Nährmedium aufbewahrt hat.

Unter Anwendung von Techniken, die ähnlich den in Beispiel 7

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beschriebenen sind, extrahiert, trennt und analysiert man die Mischung der gesamten Alkaloide, die in diesen Proben enthalten sind.

In dieser Weise gewinnt man Alkaloidverbindungen in vergleichbarer Menge, die ähnlich jenen sind, die man ausgehend von einer Kultur des Stammes 3_T (Beispiel 7) erhält.

Il

Insbesondere sind gewisse der erhaltenen Alkaloide Alkaloide vom Vincamintyp, wobei die Hauptmenge der durch Biosynthese gebildeten Substanzen in dem Nährmedium verteilt ist und die Herstellungsausbeute sehr viel größer ist als die sich bei der Extraktion der in situ gezüchteten Pflanze ergebende.

Die obigen Beispiele betreffen ein Verfahren zur Gewinnung der gesamten Alkaloide von Vinca minor L. Diese Technik beruht auf der Ausnutzung der Fähigkeit zur Biosynthese, die sich im Verlaufe der Evolution in der genetischen Information der Zellen dieser Pflanze vergrößert hat. Diese Fähigkeit ermöglicht die Durchführung von Stufen der Biosynthese mit einer erhöhten Ausbeute aufgrund der Spezifität der Zellenenzyme und ermögicht die Herstellung einer großen Vielzahl von verschiedenartigen Verbindungen. Abgesehen von der Extraktion aus der in der Natur gesammelten oder gezüchteten Pflanze sind diese Möglichkeiten industriell nie ausgenützt worden.

Erst die vorliegende Erfindung ermöglicht die Ausnützung dieser Möglichkeiten ohne daß es notwendig ist, den verschiedenen einschränkenden Vorschriften hinsichtlich des Pflanzens oder in situ-Züchtens Genüge zu tun, die sonst bei der Gewinnung der Ausgangsmaterialien eingehalten werden müssen. Sie umfaßt demzufolge jegliche Herstellung von Alkaloiden von Vinca minor L, durch in vitro und in flüssigem Medium gezüchtete Zellen dieser Art, die in einem klassischen morpho-

genetisch entdifferenzierten Zustand gehalten werden. Somit

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sind sämtliche Abänderungen der Züchtungsbedingungen, der Zellenumgebung und der Wachstumsentwicklung, die mit einer Biosynthese der gewünschten Verbindungen verträglich sind oder sie begünstigen, erfindungsgemäß möglich. Man kann beispielsweise die Beleuchtungsbedingungen (von der Dunkelheit bis zum Sonnenlicht), die Temperaturbedingungen (von 20°C bis 40°C), die Gaszirkulation (beispielsweise 0,01 bis 1,0 1 Luft pro Liter und pro Minute) und die Rührbedingungen (50 bis 100 Umdrehungen pro Minute) variieren, die bei der Durchführung der Züchtung angewandt werden. Weiterhin kann man die Zusammensetzung des Nährmediums innerhalb weiter Grenzen verändern, und zwar sowohl hinsichtlich der Art der Bestandteile als auch hinsichtlich ihrer relativen Mengen. So kann man irgendwelche chemischen oder biologischen Substanzen, die die Bildung einer gegebenen Verbindung begünstigen oder die Durchführung einer bestimmten biologischen Umwandlung ermöglichen, dem Nährmedium kontinuierlich oder nicht-kontinuierlich zusetzen.

In den Beispielen sind die verschiedenen Arten der Kinetik des Wachstums angegeben. Sie werden durch eine Reihe von Faktoren bestimmt, wie der Dichte zu Beginn der Züchtung, dem zytologischen und biochemischen Differenzierungszustand des Implantats, der Gesamtheit der Züchtungsbedingungen und zum Teil von den synthetisierten Produkten selbst. Somit ist jeder Verlauf der Kinetik, der die Bildung der gewünschten Verbindungen begünstigt, anwendbar. So kann man die Dauer der Züchtung innerhalb sehr großer Grenzen von einigen Tagen bis zu zwei Monaten variieren, wobei auch ein konstantes Erneuern des Mediums (kontinuierliche Züchtung) möglich ist.

Die*mit dieser Herstellungstechnik erzielten quantitativen und qualitativen Ergebnisse hängen von dem Stamm der gezüchteten Zellen und der zu ihrer Herstellung angewandten Selektionsart ab. Wie in der Einleitung bereits angegeben wurde, kann die

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genetische Information, deren Fähigkeit zur Biosynthese man ausnützt, in sehr unterschiedlicher Weise weitergegeben werden. So kann man in Abhängigkeit von den Stämmen Situationen des "alles oder nichts" beobachten, was die Anwesenheit von Alkaloiden oder die eines bestimmten Alkaloids in der gesamten Alkaloidmischung betrifft. Weiterhin kann der Zustand der Weiterführu. j oder NichtUnterdrückung dieser Information mit dem Zustand der Zellendifferenzierung verbunden sein, der unter anderem durch die Kinetik des Wachstums gekennzeichnet ist.

Der Besitz einer großen Population von verschiedenartigen Stämmen ermöglicht die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Selektion mehrerer dieser Stämme hinsichtlich ihrer biosynthetischen Eignung. Die Bedingungen der Züchtung, der Zellenumgebung, der Art des Implantats und die Richtung der Entwicklung des Wachstums wurden und werden stets in Abhängigkeit von dem Stamm derart ausgewählt, daß die Weiterführuhg von genetischen Strukturen begünstigt wird, deren Stabilität und deren Regulierungszustand man im Verlaufe der verschiedenen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens überwacht bzw. untersucht. Die Mengen der erhaltenen Produkte variieren mit der Verknüpfung der ^.oen beschriebenen verschiedenen Faktoren.

Weiterhin kann man daran denken, die genetischen Fähigkeiten von zweit oder mehreren Stämmen aus identischen oder nicht-identischen Varietäten zu vereinigen, indem man sie in dem gleichen Fermenter züchtet.

Die in Beispielen beschriebenen aufeinanderfolgenden Stufen sind in»der Praxis unerläßlich, um leicht zu einer Kultur in einer Vorrichtung mit einem Fassungsvermögen von 12 1 zu gelangen. In ähnlicher Weise ist die Ausweitung auf noch größere Produktionsvolumina durch progressive Steigerung der Größe der

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Volumen der Kultur möglich.

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Claims

TER MtEH-MULLLH-STEINMEISTER - 38 - Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Alkaloiden, dadurch gekennzeichnet, daß man isolierte Zellen oder kleine Zellgruppen von Vinca minor L. (Apocynaceae), die man in morphogenetisch entdifferenziertem Zustand hält, in vitro in flüssigem Medium züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen von Stämmen züchtet, die aufgrund ihrer erhöhten biosynthetischen Aktivität durch Selektion ausgehend von einer großen Population von Stämmen von Gewebekulturen von Vinca minor L., die von unterschiedlichen natürlichen ökotypen abstammen, ausgewählt sind.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurc h gekennz eichnet, daß man es in einer Vorrichtung nach Art eines Fermenters durchführt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennz eichnet, daß man eine große Population von Stämmen von Zellen von Vinca minor L. in halbfestem Medium bildet; daß man die Stämme auswählt, die eine erhöhte Biosynthetische Aktivität aufweisen, was man insbesondere durch Analysen der Biomasse und des Nährmediums feststellt; daß man die ausgewählten Stämme an die Züchtung in flüssigem Medium anpaßt/ daß man die erhaltenen angepaßten Stämme stabilisiert/ daß man nach und nach die Volumen der Kultur und die Größen

,des Implantats erhöht, bis man Biomassen erhält, die eine solche Größe aufweisen, daß sie in Fermentoren wachsenden Volumens gezüchtet werden können, und die die Alkaloide in einer für die industrielle Produktion ausreichenden Menge

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liefern.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der Züchtung verwendeten Medien Mineralstoffe und/oder mineralische Spurenelemente und/oder eine Eisenquelle und/oder eine Kohlenstoffquelle und/oder Vitamine und/oder mindestens ein das Wachstum modifizierendes Mittel und/oder gegebenenfalls mindestens einen Wachstumsförderer enthalten.

6. Verfahren nach Anspruch 5₇ dadurch gekenn-

z e ic hnet, daß das Züchtungsmedium mit Ausnahme der zur Gelbildung eingesetzten Substanz ähnlich dem Medium ist, das zur Herstellung des Stammes auf halbfestem Medium eingesetzt wurde.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennz eichnet, daß die Züchtungsbedingungen an den ausgewählten Stamm angepaßt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprürche 1 bis 7, dadurch gekennz eichnet, daß die Züchtung im Dunkeln oder gegebenenfalls unter Restbeleuchtung erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur durch Einleiten von Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,01 bis 1,0 1 pro Liter pro Minute mit Sauerstoff versorgt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,08 bis 0,121 1 pro Liter pro Minute einführt.

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11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennz eichnet, daß die Temperatur der Kultur zwischen 2O°C und 40°C gehalten wird,

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur von etwa 30°e arbeitet.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennz eichnet, daß man die Kultur mit 50 bis 150 Umdrehungen pro Minute rührt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man mit 100 Umdrehungen pro Minute rührt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennz eichnet, daß man eine Züchtungszeit zwischen einigen Tagen und zwei Monaten anwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Züchtungsdauer von etwa 21 Tagen anwendet.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennz eichnet, daß man die Alkaloide durch Extraktion desr-Kulturmediums und der Biomasse gewinnt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennz eichnet, daß man die Alkaloide nur durch Extraktion des Kulturmediums gewinnt,

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die gesamten Alkaloide extrahiert.

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20* Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis ^,dadurch gekennzeichnet, daß man die einzelnen Alkaloide aus der erhaltenen Mischung der gesamten Alkaloide abtrennt.

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