CN1209168A - 由植物细胞培养物生产植物化学物质的生产和筛选方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于从植物细胞培养物生产植物化学物质的方法。该方法包括培养植物细胞的步骤,所述植物细胞在多相培养基中生产特定的植物化学物质,所述培养基包括一个含水相和一个相对于含水相而言对paclitaxel具有高分配系数的疏水相。从疏水相回收植物化学物质。还提供了从植物细胞培养物筛选植物细胞系的方法,利用所述生产方法所述植物细胞系产生特定的植物化学物质。优选的植物化学物质是paclitaxel。

Description

由植物细胞培养物生产植物化学 物质的生产和筛选方法
发明技术领域
本发明的领域是涉及从植物细胞培养物筛选用于植物化学物质的生产的细胞系的技术。更具体地说，本发明涉及筛选液体悬浮细胞系，所述细胞系能够将植物化学物质分泌到与培养基和细胞相一起存在的第二相中。利用该技术还能从培养的植物细胞生产植物化学物质。
发明背景
用于生产植物化学物质和用于筛选细胞系以识别植物化学物质生产者的现有技术依赖于通过在半固体培养基或悬浮培养的重复继代培养使细胞系获得的特性，而忽略了其它的增强过程方案。一旦发现高产量的细胞系，然后应用增强过程方案，再使该过程的条件最佳化。这样产生的缺点是在初级筛选过程中可能忽略了适用于增强过程方案例如两相培养的细胞系。在经典的筛选方法中，最佳化的培养条件是两个步骤的方法；一次是筛选过程，然后是处理状态。此外，在经典的方法中，牺牲细胞以检测胞内植物化学物质的水平。
各种代谢控制原理妨碍了细胞产生非必要的代谢产物。这与由植物细胞培养物产生植物化学物质的整个目的相矛盾，其中应用培养的植物细胞以生产有价值的次级代谢产物。为了从方法工程的观点来解决该问题，通过整合一个初级下游加工步骤从反应位点去除产物是可能的方案之一。
在植物细胞培养中应用整合发酵和分离的主要促进作用是避免反馈抑制和产物的降解。反馈抑制包括细胞中的一组控制机理，它通过应用应答高产物浓度的相应的酶活动调节细胞的产生能力。因此对于特定的产物而言，高产物浓度降低了细胞的最大生产能力。尤其是在初级代谢产物的生产期间出现了反馈抑制，因为生长和生产不是直接结合的。当与生物质的生长相比时，如果产物浓度太高，导致产物形成能力降低，由此导致相对于底物或前体物质而言，代谢产物的产量降低。在植物细胞培养物的发酵过程中避免产物降解在利用整合的方法中起着关键的作用。植物细胞发酵通常持续几个星期，并且在该时间框架内，胞外酶或弱结合的反应可以降解次级代谢产物，导致产物产量的损失。
这就仍然需要新的生产和筛选技术，该技术在初级筛选技术中结合了增强过程方案。优选的是该技术是非破坏性的和快速的。
发明概述
一方面，本发明提供了生产植物化学物质的方法。该方法包括在多相培养基中培养产生植物化学物质的植物细胞的步骤，该培养基包括含水相和疏水相。疏水相相对于含水相而言对植物化学物质具有高分配系数，以便将通过培养细胞生产的植物化学物质吸附到疏水相。在优选的实施方案中，多相培养基是两相培养基。优选的植物化学物质是paclitaxel。
优选的是疏水相相对于其它相而言对植物化学物质和植物细胞营养物具有低分配系数。优选的是疏水相包括高分子量的醇类，酯类，醚类，甘油三酯类，卤代的溶剂或硅氧烷。尤其优选的疏水相包括1，2，3-三辛酰甘油。在一个优选的实施方案中，用含水相预调节疏水相。
含水相包括那些保持植物细胞培养物的存活性必需的因子，并且包括或不包括刺激植物化学物质产生的因子。所述因子包括植物激素，植物化学生物合成的前体，激发剂和信号偶合剂。
列举的和优选的植物激素包括植物生长激素，2-萘氧乙酸，1-萘乙酸，细胞激动素，激动素，6-苯甲基氨基嘌呤，4-氯苯氧乙酸，对-氯苯氧乙酸，2，4，5-三氯苯氧乙酸，毒莠定，N6-(22-异戊基)腺嘌呤，玉米素和6-(苯甲基氨基)-9-(2-四氢吡喃)-9H-嘌呤。列举的和优选的paclitaxel的生物合成前体包括苯丙氨酸和赤霉素。用于生产paclitaxel的列举的和优选的激发剂包括Cytospora abietis或Penecilliumminoluteum的提取物。用于生产paclitaxel的可列举的和优选的信号偶合剂包是茉莉酸或其盐。
用于本发明方法生产paclitaxel的优选的植物细胞培养物是红豆杉细胞系的悬浮培养物。本发明的paclitaxel生产方法进一步包括从疏水相连续提取paclitaxel的步骤。
本发明还提供了非破坏性的筛选技术，其中将生产加强方案整合到筛选技术中。该筛选技术也是非破坏性的和快速的。细胞在多相培养基中产生产物，所述培养基包括含水相和液体疏水相。疏水相与含水相相比对产物具有高的分配系数或较高的亲和性，以致于能够从疏水相中提取由细胞培养物产生的产物。在优选的实施方案中，多相培养基是两相培养基。优选的疏水相和含水相类似于上面列出的。
附图简述
在构成说明书一部分的附图中：
附图1显示用于生产paclitaxel的两相培养基的图解说明。
附图2显示具有额外成份的用于生产paclitaxel的两相培养基的图解说明，以便连续地从疏水相中提取paclitaxel。
附图3显示在提取之前(A)和用1，2，3-三辛酰甘油提取之后(B)的培养基中paclitaxel的HPLC分布图。
附图4显示在用1，2，3-三辛酰甘油原位提取红豆杉悬浮细胞系之后，第二相的HPLC分布图。所述细胞已经在具有第二相的特定的培养基中进行生长。
发明详述
1.发明
本发明涉及用于生产有药用价值的植物化学物质的新的方法和所述方法在筛选植物细胞培养基以识别产生所需的特定的植物化学物质的植物细胞系中的应用。该方法的重要的一个方面是多相培养基的应用，所述培养基包括含水相和疏水相。所需的植物化学物质的特征在于其分布到疏水相。
与现有的细胞培养物筛选和生产技术不同，本发明的方法是非破坏性的，仅仅是分析疏水相中的植物化学物质的含量。而现有技术中破坏了产生植物化学物质的细胞。由于疏水相形成了明显不同于含水相的层，因此取样更容易，能够将所需的植物化学物质与其它培养基成份分离开。
II.生产植物化学物质的方法
因此一方面，本发明提供了生产所需的植物化学物质的方法。该方法包括培养植物细胞的步骤，所述植物细胞在多相培养基中产生植物化学物质，所述培养基包括含水相和疏水相。疏水相相对于含水相而言对植物化学物质具有高的分配系数，可以使由细胞培养物产生的植物化学物质吸附到疏水相中。在优选的实施方案中，多相培养基是两相培养基。
采用本发明的方法能够生产可在含水相和疏水相之间分配的任何植物化学物质。由特定的植物细胞培养物产生和分泌所述的植物化学物质。由特定的植物细胞系产生和分泌的植物化学物质是本领域已知的。优选的植物化学物质是paclitaxel，它是一种用于癌症治疗的药物。
paclitaxel已经被批准用于治疗难治的卵巢和乳腺癌，并且已进行paclitaxel在治疗肺和直肠癌症的I期和II期试验。目前，paclitaxel来源于红豆杉的植物器官或通过从天然来源的paclitaxel中间体半固体合成转变。作为目前方法的另一种可选的途径，paclitaxel可以通过作为细胞培养物生产。由细胞培养物生产paclitaxel的优点是更可靠，更容易合法化，并且与从天然来源的产物分离相比，是一种可更新的来源，从天然来源分离导致物质的来源遭到破坏。paclitaxel是由红豆杉属的浆果紫杉树制备的。因此用于本发明的方法中生产paclitaxel的优选的植物细胞培养物是红豆杉细胞系的悬浮培养物。所述细胞系的例子是来自于各物种例如短叶红豆杉，和杂种紫杉，欧洲红豆杉，东北红豆杉和Taxus himalaya的浆物果紫杉的不同器官。建立植物细胞培养物的方法是本领域熟知的。
在选定了产生和分泌特定的植物化学物质的细胞系之后，将细胞系在多相培养基中培养，所述培养基含有用于维持细胞的含水相和用于分配植物化学物质的疏水相。正如本领域内技术人员熟知的，含水相含有营养物质和保持植物细胞存活必需的其它因子。那些因子包括碳源，盐和溶解的气体例如二氧化碳。在下文的实施例中使用了补充了30克/升蔗糖的Gamborg’s B-5培养基。
含水相包括或不包括刺激植物化学物质产生的因子。所述因子包括植物激素，植物化学物质的paclitaxel生物合成前体，激发剂和信号偶合剂。
可列举的和优选的植物激素包括植物生长激素，2-萘氧乙酸，1-萘乙酸，细胞激动素，激动素，6-苯甲基氨基嘌呤，4-氯苯氧乙酸，对-氯苯氧乙酸，2，4，5-三氯苯氧乙酸，毒莠定，N6-(22-异戊基)腺嘌呤，玉米素和6-(苯甲基氨基)-9-(2-四氢吡喃)-9H-嘌呤。
植物生长激素，2-萘氧乙酸(NOA)，l-萘乙酸(NAA)，细胞激动素，激动素或6-苯甲基氨基嘌呤(BAP)，以10∶1的摩尔比存在于基本培养基中可以有效地启动细胞系产生paclitaxel。
植物化学物质例如paclitaxel的合成的诱导经常与处于真菌，细菌和病毒的进攻时植激发物防御机制相结合。因此，通过向培养基中加入某些激发剂，病原菌的细胞壁的组分能够完成对植物化学物质的刺激。下面的表1列举了已经被成功地用于增强植物细胞培养物中植物化学物质的生物合成的激发剂。
表1  受激发的植物细胞培养物产生的植物化学物质
植物化学物质 植物细胞培养物 激发剂的来源   增强(X-倍)
  三尖杉酯碱生物碱   Cephalo Taxusharringtinia 大丽花轮枝孢     51
  紫苜蓿素   Cicer ariotinum   啤酒酵母     60
薯蓣皂苷配苷     Diascoreadeltoides   无根根霉     3
    吗啡     Papaversomniferum   串珠镰孢     20
研究已经证明生产者可用于刺激在比未受激发的培养物更短的生产时间内产生植物化学物质。特别是从真菌Cytospora abietis和Penicillium minoluteum制备的粗制激发剂提取物能够在加入后24小时内刺激paclitaxel的产生(参见美国专利No.5,019,504)。
将真菌培养物批量生长于悬浮培养物中，收集培养物滤液，将菌丝体块匀浆化。将培养物滤液和菌丝体匀浆蒸发到原始体积的1/20，然后透析以去除不溶性物质，将液体高压蒸汽灭菌并且在无菌加入到细胞培养物之前储存于-20℃。
用于测定最佳激发剂浓度，特异性，接触时间的长短，和激发剂加入的起始时间与培养物年龄的函数关系，培养基组成，和细胞系反应的手段是本领域内熟知的。典型的激发剂浓度0.3-5％V/V的培养物总体积。典型的接触时间是从约24到约48小时。
植物化学物质的生物合成前体提高了生产。对于paclitaxel所述生物合成前体的例子是苯丙氨酸和赤霉素。通常在起始培养的同时将这些前体加入到细胞培养物中。虽然在没有所述生物合成前体时能够出现paclitaxel的生产，但是通常当利用前体时可以加强其产生。决定所述前体的最佳浓度的方法是本领域内熟知的。
已经证明赤霉素(GA3)提高了细胞生长速率，而对paclitaxel的产生没有负影响(Fett-nett，A.F.，S.J.Melanson，K.Sakata，F.DiCosmo，生物技术，11，731，1993)。有人提示GA3的作用是由于与外源性的植物生长激素和细胞激动素在强烈促进细胞的扩增中的增效作用产生的。
苯丙氨酸是Winterstein acid的氨基酸前体，它是paclitaxel分子的侧链的生物合成所需要的。已经证明向培养基中加入0.1mM的苯丙氨酸可显著地增加东北红豆杉培养物中paclitaxel的产量而不影响细胞生长。
近来已经确认茉莉酸在信号转导过程中作为信号偶合剂，所述转导过程是基于激发发生的(参见，例如Gundlach，H.，M.J.Muller，T.M.Kutchan，M.H.Zenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，2389，1992和Reinbothe，S.，B.Mollenhauser，C.Reinbothe，植物细胞，6，1197，1994)。基于对红豆杉细胞的激发能够提高paclitaxel的生产。
已经有人提示在激发剂诱导的次级代谢产物的生物合成过程中茉莉酸是第二信使。已经注意到在植物的横切面中茉莉酮酸酯对次级代谢产物基因表达的作用。已经证明在许多种中通过加入外源性的甲基化的茉莉酮酸酯增加了次级代谢产物(参见，例如Gundlach，H.，M.J.Muller，T.M.Kutchan，M.H.Zenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，2389，1992和Reinbothe，S.，B.Mollenhauser，C.Reinbothe，植物细胞，6，1197，1994)。
将茉莉酸甲酯，茉莉酮酸甲酯作为外源性物质加入，因为植物细胞摄取甲基化形式被认为比摄取茉莉酸更有效，并且甲基化形式已经可通过商业途径获得。本发明人已经证明向花菱草的细胞培养物中加入茉莉酮酸甲酯增加了苯并菲啶生物碱的产量(Dutta，A.，结合了生物合成增加技术的两相植物细胞培养物，Ph.D.Thesis，Rutgers，新泽西州立大学，New Brunswick，NJ，1995)。
在整合了类似于给予激发和前体的增强方案的次级代谢产物的原位提取过程中通常存在增效作用。通过加入激发剂，前体和茉莉酮酸甲酯基本上将生物碱的生物合成增加到组成型水平。反馈抑制的强度大于对照培养物或大于单独加入激发剂或茉莉酮酸甲酯的培养物。
培养基包括疏水相，所述疏水相将由植物细胞培养物产生和分泌的植物化学物质吸附到含水相。由于对植物化学物质而言疏水相比含水相具有更高的分配系数，则其吸附到疏水相。从含水相去除植物化学物质并且进入到疏水相导致在植物化学物质的合成中平衡更多地移向产物，由此增强了生物合成。
疏水相的成份对植物细胞是无毒的，并且可充分地选择特定的植物化学物质以便将植物化学物质分配到疏水相。优选的是在含水相的上面形成疏水相。
优选的是对植物激素，营养物和存在于含水相的其它因子，疏水相具有低的分配系数。通过用含水相预调节疏水相能够使吸附到疏水相的所述因子降低到最小。
优选的是疏水相包括高分子量的醇类，疏水酯类，醚类，甘油三酯类，卤代的溶剂或硅氧烷。对于paclitaxel的生产尤其优选的疏水相包括1，2，3-三辛酰甘油。在下文的实施例中详细地描述了将1，2，3-三辛酰甘油用于paclitaxel的分配。附图1中列出了用于本发明的方法的具有含水相(A)和疏水相(H)的两相培养基的示意图。
用于决定合适的疏水相的方法是本领域熟知的。简单地说，将植物化学物质的水溶液与疏水相接触，测定植物化学物质在疏水相的分布或分配。用甲醇提取疏水相的样品，去除不溶性物质。然后浓缩提取物并且利用建立完善的HPLD方法进行分析，例如在该系统中易于识别paclitaxel。可以利用一组光敏二极管检测器检测paclitaxel峰的均匀性并且提供UV指纹图谱以进一步验证paclitaxel的均匀性。通过LC-MS对HPLC的paclitaxel峰进行最后的证实。
本发明的生产方法可进一步包括从疏水相连续提取植物化学物质的步骤。附图2显示了用于生产paclitaxel的所述系统的示意图。
参照附图2，将合适的植物细胞培养物悬浮于含水相(A)。由疏水相(H)形成上层。在一个分离器(例如离心分离器)中确定由植物细胞分泌的并且分配到疏水相的paclitaxel的路线(1)，所述分离器将出现于疏水相的paclitaxel和任何含水培养基成份分离。将含水培养基成份再循环(3)回到培养物反应器的含水相。确定paclitaxel在萃取器(例如中空纤维)中的路线(2)，所述萃取器采用甲醇提取方法去除paclitaxel。然后将疏水相的成份再循环(4)回到反应器的培养基中。然后收集在甲醇中的提取的paclitaxel。III.筛选植物细胞培养物以识别产生paclitaxel的培养物的方法
可以利用产生植物化学物质的方法筛选植物细胞培养物以识别那些产生特定的植物化学物质的细胞培养物。根据这样的筛选方法，将被认为产生给定的植物化学物质的植物细胞培养物培养于培养基中，所述培养基包括含水相和疏水相，所述疏水相与含水相相比，对植物化学物质具有更高的分配系数。
将培养物维持足够长的时间以便生产植物化学物质，并且分配到疏水相。然后从该疏水相取样，在该样品中测定植物化学物质的存在，其存在说明植物细胞培养物产生了该植物化学物质。
在优选的实施方案中，植物化学物质是paclitaxel，细胞系是如在上文中列出的红豆杉细胞系的悬浮培养物。含水相和疏水相的优选的实施方案与在上文中列出的相同。
下面的实施例描述了本发明的优选的实施方案并且不以任何方式限制说明书和权利要求书。实施例1
本实施例报道的研究工作显示通过分配到疏水相能够从含水相去除paclitaxel。在本研究工作中使用的含水相(培养基)是补充了30克/升蔗糖，维生素和25μM的α-萘乙酸的Garnborg’B-5培养基。
通过将20毫克的粗制paclitaxel溶解于10毫升的甲醇中制备paclitaxel的原液。约0.1毫升的该原液溶解于150毫升的含水培养基。通过HPLC分析样品结果显示含水培养基中paclitaxel含量是0.6毫克/升(附图3)。
将不同的paclitaxel-含水溶液的试样调节到pH值为3.5，5.45，5.75，6.36或6.9。从各paclitaxel溶液取3毫升与3毫升1，2，3-三辛酰甘油(三辛酸甘油酯)的疏水相混合并且涡旋1分钟。1小时之后分离各相，通过HPLC分析含水培养基。
在与三辛酸甘油酯混合之后在含水培养基中没有检测到paclitaxel，表明三辛酸甘油酯从含水培养基中完全去除了paclitaxel。实施例2
将从红豆杉种获得的植物器官小片例如针，叶，茎干置于无菌的Gamborg’B-5培养基，所述培养基补充了30克/升蔗糖，0.8％w/w琼脂，维生素和25μM的α-萘乙酸并且保持于22℃的培养器中。在2个星期到3个月的不同的时间之后在植物器官生长未分化的愈伤组织。在相同的培养基上将愈伤组织继代培养。
将愈伤组织的继代培养物试样转移到含水培养基(补充了30克/升蔗糖，维生素和25μM的α-萘乙酸的Gamborg’B-5培养基，pH5.5)以建立悬浮培养物。任何将这些悬浮细胞培养物转移到含有作为含水相的Gamborg’B-5培养基和作为疏水相的10％v/v的三辛酸甘油酯的两相培养基。
在gyratory摇床，25℃以180rpm，黑暗条件下，将悬浮细胞培养物，于具有50毫升培养基的125毫升的振荡培养瓶中生长。在培养30天之后，通过HPLC分析疏水相样品的paclitaxel含量(附图4)。
在HPLC分析之前用甲醇提取疏水相样品以去除任何被分离的含水相。结果显示疏水相含有浓度为510毫克/升的paclitaxel。将它与实施例的数据结合在一起，这些数据显示植物细胞培养物能够在含有疏水相和含水相的两相培养基中生长，并且将由植物细胞产生的和分泌的paclitaxel分配到疏水相。

Claims (17)

1.用于生产植物化学物质的方法，包括在多相培养基中培养产生植物化学物质的植物细胞，所述培养基包括含水相和疏水相，所述疏水相相对于含水相而言对植物化学物质具有高分配系数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中多相培养基是两相培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中疏水相相对于其它相而言，对植物激素和植物细胞营养物具有低分配系数。
4.根据权利要求1所述的方法，其中疏水相包括高分子量的醇类，酯类，醚类，甘油三酯类，卤代的溶剂或硅氧烷。
5.根据权利要求4所述的方法，其中疏水相包括1，2，3-三辛酰甘油。
6.根据权利要求2所述的方法，其中用含水相预调节疏水相。
7.根据权利要求2所述的方法，其中含水相包括至少一种植物激素。
8.根据权利要求7所述的方法，具中植物激素包括植物生长激素，2-萘氧乙酸，1-萘乙酸，细胞激动素，激动素，6-苯甲基氨基嘌呤，4-氯苯氧乙酸，对-氯苯氧乙酸，2，4，5-三氯苯氧乙酸，毒莠定，N6-(22-异戊基)腺嘌呤，玉米素和6-(苯甲基氨基)-9-(2-四氢吡喃)-9H-嘌呤。
9.根据权利要求2所述的方法，其中植物化学物质是paclitaxel。
10.根据权利要求9所述的方法，其中含水相包括paclitaxel的生物合成前体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中生物合成的前体是苯丙氨酸或赤霉素。
12.根据权利要求9所述的方法，其中含水相包括paclitaxel生产的刺激剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中刺激剂是Cytospora abietis或Penecillium minoluteum的提取物。
14.根据权利要求9所述的方法，其中植物细胞培养物是红豆杉细胞系的悬浮培养物。
15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括从疏水相连续地提取植物化学物质的步骤。
16.筛选植物细胞培养物以识别植物化学物质前体的方法，所述方法包括在培养基中培养植物细胞培养物，以及检测疏水相中植物化学物质的存在，其存在说明植物细胞培养物产生了植物化学物质，所述培养基包括含水相和疏水相，所述疏水相与含水相相比对植物化学物质具有更高的分配系数。
17.根据权利要求16所述的方法，其中植物化学物质是paclitaxel。
CN96199969A 1995-12-12 1996-12-11 由植物细胞培养物生产植物化学物质的生产和筛选方法 Pending CN1209168A (zh)

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